Gradiente desnaturalizante electroforesis en gel (DGGE)

Vale. Hola, mi nombre es Celeste Peterson y soy investigadora en la Universidad de Harvard, estudiando comunidades microbianas de biopelículas. Estoy caracterizando las comunidades bacterianas analizando su secuencia de 16S y cómo esta secuencia cambia en el tiempo y en el espacio. Para ello, estoy utilizando DGGE.

Esta no es una electroforesis normal de mi pozo, debe mantenerse a 60 grados durante su ejecución y el tampón debe bombearse continuamente. Así que vamos a calentar el tampón durante aproximadamente una hora hasta que alcance los 60 grados, y luego podremos realizar la corrida. Ahora voy a lavar esta placa con una solución diluida de uc, eliminando las impurezas, y uno, encender eso.

Algo así puede provocar irregularidades. Es importante eliminar toda el agua. Por lo tanto, cuando monte el gel, colocaré ese chip en la parte exterior del gel.

Entonces, el gel quedará entre estas dos piezas de vidrio y el chip estará en el exterior y no afectará al gel que está en el interior. Ahora voy a ensamblar el gel en estas pinzas y luego las apretaré juntas y ajustaré girando hacia la derecha. Como con cualquier gel, es importante asegurarse de que la base esté alineada.

Para evitar la formación de burbujas, ahora damos vuelta al gel y lo colocamos aquí para sellarlo con la junta. Por lo tanto, es importante que al hacer esto, las placas estén perfectamente alineadas con la junta. De este modo, estos pernos laterales entran en su lugar y usted presiona hacia abajo para crear el sello.

Entonces, esta es una jeringa de 30 ml. Y esta parte y esta otra vienen con el kit de bio red y simplemente se colocan así. Y eso sirve únicamente para eliminar el exceso de agua en los tubos.

Coloque el tubo sobre el gel para cargar el gel. Primero, introduzca un adaptador en el tubo y luego una aguja con ese pequeño adaptador, y colóquela justo en el centro del gel, de modo que quede ligeramente por debajo del vidrio inferior. Luego, este adaptador de alambre se introduce en el tubo largo y se conectará a jeringas idénticas que contienen la solución de alta y baja densidad.

Estas son soluciones previamente preparadas. En la azul, he agregado un colorante que simplemente indica que esta es la solución más desnaturalizante, y esta es la solución de menor densidad, la menos densa. Y contienen todos los componentes necesarios.

Y ahora voy a preparar, en realidad voy a hacer el doble de la cantidad semanal. Y una vez que tengas la mezcla, tienes entre cinco y siete minutos para llenar el gel antes de que comience a solidificarse. Ahora llenamos la jeringa con la solución.

Así que voy a llenarlo con aproximadamente 15 de la solución. Luego, para eliminar cualquier burbuja de aire, lo daré la vuelta y presionaré suavemente hasta que desaparezca la burbuja de aire superior. Ahora, este pequeño tornillo irá en esta ranura.

Este adaptador se alineará con esta abrazadera aquí, y se sujetará firmemente con una abrazadera en forma de C. Luego, este tubo se conectará a la jeringa. Lo mismo se realiza en el otro lado con la matriz de alta densidad cuando es momento de administrar.

Y así voy a girar esta rueda con un movimiento constante en sentido horario. Primero saldrá la solución azul, porque es la más densa por naturaleza, y formará la parte inferior del gel. Luego, después de un tiempo, la solución transparente comenzará a llenar el gel y se formará el gradiente.

Un momento es suavemente en un ángulo y, tan pronto como termine de verter el gel, lave inmediatamente sus tubos porque se polimerizarán. Va, es el grupo que hay allí. Luego presione hacia abajo. Así que este pequeño, y en el otro lado, haré lo mismo. Vale.

Hola, mi nombre es Celeste Peterson y soy investigadora en la Universidad de Harvard, estudiando comunidades microbianas. Estoy caracterizando las comunidades bacterianas analizando su secuencia de 16S y cómo esta secuencia cambia en el tiempo y en el espacio. Para ello, estoy utilizando DGGE.

Entonces, DGE es electroforesis en gel desnaturante. Básicamente, la idea consiste en que existe un gradiente y, a medida que el ADN migra a lo largo del gradiente, se desnaturaliza. De este modo, diferentes especies de 16S se detendrán en puntos distintos a lo largo del gradiente.

Y así termina siendo una huella dactilar de las diferentes especies de sexiness en la comunidad. Por lo tanto, el objetivo de mi experimento es determinar qué organismos están presentes en la comunidad y cómo cambia esto a lo largo del tiempo y el espacio. Luego puedo correr un gel de DDD de sexiness y cortar las bandas para identificar las especies representadas en cada comunidad.

Entonces, uno de los problemas más importantes al realizar un gel de A DDG es determinar el gradiente que sea el más adecuado. Por lo tanto, esto es algo que debe ajustarse experimentalmente para identificar, en una comunidad particular, el tipo de gradiente más apropiado. El que estoy utilizando hoy es un gradiente de urea del 35 al 55%.

Uno de los grandes problemas que puede ocurrir con esta técnica es que aparecen manchas en los geles. Y he descubierto que, por alguna razón, una de las mejores cosas que se puede hacer es correr los geles durante un tiempo muy prolongado, tras lo cual las manchas desaparecen. Hoy en día, simplemente lo estoy utilizando para comunidades bacterianas generales, pero también puede emplearse para una familia específica de bacterias con el fin de observar cómo cambian con el tiempo, y en esos casos los geles suelen ser muy nítidos.

También puede analizar mutaciones en genes individuales mediante DDGE.