Name: Retro-orbital de inyección en adultos de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Aprende la inyección retro-orbital en peces cebra adultos para estudios de trasplante de células madre hematopoyéticas. Esta técnica permite visualizar la dinámica de glóbulos rojos fluorescentes mediante microscopía.

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Este trabajo es apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes y una subvención del NIH para el estudio de la hematopoyesis embrionaria.

Parte 1. Preparación de material de inyección <ol><li> Tg (globina: GFP) células: </li><li> Sangran los peces donante adulto con punta de la pipeta 10 ul recubiertos de heparina (1unit/ul) para los peces pinchazo detrás de enmalle. </li><li> Aspirar las células rojas de la sangre y dispensar en tampón de células (0,9 x PBS + 5% de SFB + pluma 1% / estreptomicina). </li><li> Suspensión de células de filtro sobre la malla 40uM y determinar la concentración de las células utilizando hemocitómetro como se describió previamente por LeBlanc et al. </li><li> Centrifugar y resuspender en tampón de células a la concentración deseada de tal manera que el volumen de inyección final no es más que 5UL. Aquí se inyecta desde 1,5 hasta 2 millones células / receptor. </li><li> Para el dextrano, Texas Red ®, disolver el colorante en DPBS para una concentración final de inyección de 10-12 mg / ml. Plan para inyectar 4 uL por pez. </li></ol> Parte 2. Inyección <ol><li> Anestesiar a los peces en tricaína (4.2ml (4mg/ml) peces de agua tricaine/100ml). </li><li> Lave la jeringa Hamilton 3-4 veces antes de la inyección con etanol al 70%. Enjuague 3-4 veces con DPBS 0.9x. </li><li> Coloque el pescado lado dorsal hacia arriba y hacia la derecha en la esponja húmeda. </li><li> Sostenga la jeringa Hamilton con su mano derecha y con su dedo índice en el émbolo. Suavemente estabilizar el cuerpo de los peces con la mano izquierda. </li><li> Posición de la aguja con el bisel hacia arriba de tal manera que si el ojo del pez s fuera un reloj, la aguja se apunta a la posición de las 7:00 y en un ángulo de 45 grados a los peces (figura 1). </li><li> Suavemente inserte la aguja 1-2 mm en la posición 07:00 y lentamente el émbolo. </li><li> Permiten a los peces a recuperarse en el agua fresca E3. </li><li> Lavado de la aguja, como se describió anteriormente, entre las inyecciones de diferentes reactivos. </li><li> Flick solución celular para volver a suspender las células cada pocos minutos para evitar la formación de grumos de células. </li><li> Mantener a los peces el flujo de una semana con cambios de agua diarios para evitar la infección. Seguimos pez en el agua en la UCI para este período (capa de 10 ml + 5 ml de estrés pemafix + melafix 5 ml por cada 38 litros de agua E3). </li></ol> Parte 3. Resultados representante Cuando se realiza correctamente, es posible visualizar material inyectado, si se le ha llamado de alguna manera. Por ejemplo, Tg (globina: GFP), las células rojas de la sangre debe ser visto bajo un microscopio de disección fluorescente que circulan en la vasculatura del receptor de pescado casper pronto después de la inyección, como se muestra en la figura 2. Del mismo modo, la inyección de un dextrano 70kDa, conjugado con Texas Red ® se puede visualizar en la vasculatura de los peces transparentes inmediatamente después de retro-orbital de la inyección (figura 3). Células fluorescentes de riñón de Tg (β-actina: GFP) de pescado de los donantes también se puede inyectar retro-orbital en peces irradiados receptor casper. Estas células eventualmente el hogar de la médula receptor (Figura 4) y puede luego ir a repoblar el riñón después de varias semanas (figura 4b). Si la inyección es demasiado superficial o el ángulo de la aguja pasa por la cavidad venosa del seno retro-orbital, la sustancia inyectada se puede visualizar la puesta en común alrededor de los ojos o que sale de ella. Por otra parte, si la inyección es demasiado profundo, los peces pueden experimentar daños en los tejidos o el sangrado excesivo, aunque todavía se pueden recuperar. Cuando se realiza correctamente, la mortalidad después de retro-orbital inyección debe ser inferior al 5% del total de peces inyectados y el éxito de la entrega a la sangre debe ser mayor del 90% del total de peces inyectados. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figura 1"> Figura 1: Ilustración de la técnica de inyección retro-orbital. El ojo derecho de los peces se representa como un reloj analógico en el que la posición siete corresponde al lugar de la inyección correcta. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figura 2"> Figura 2: Tg (globina: GFP) los glóbulos rojos que circulan por los vasos de la cola de un pez adulto casper tres días después de retro-orbital de la inyección. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figura 3"> Figura 3: inyección de éxito de un dextrano 70kDa conjugados con Texas Red ® que se utiliza como colorante fluorescente produce vascularización de los peces adultos transparente, Casper y es fácil de ver con estándar de microscopía de fluorescencia todo animal. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="Figura 4a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4a: Tres días después de retro-orbital de la inyección de células de riñón de toda la médula de Tg (β-actina: GFP) de pescado de los donantes, las células pueden ser visualizados homing a la médula del riñón de los peces receptores irradiados adultos casper. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="Figura 4b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 4b"> Figura4b: Cuatro semanas después de retro-orbital de la inyección de células de riñón de toda la médula de Tg (β-actina: GFP) de pescado de los donantes, la repoblación del riñón receptor con el verde de los donantes de médula todo las células del riñón se puede visualizar en los peces receptores irradiados adultos casper.

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

Retro-orbital de la inyección en adultos de pez cebra ofrece la más alta eficiencia de la entrega de material inyectado en el torrente sanguíneo con la menor incidencia de la mortalidad. Debido a la naturaleza del lugar de la inyección, la punción parece sanar rápidamente, disminuyendo la incidencia de la infección y la cantidad de sangre perdida. El sitio incluso pueden ser inyectados repetidamente durante un corto período de tiempo para las inyecciones diarias de medicamentos, por ejemplo. ...

<table><tbody><tr><td>Sal de heparina sódica de mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>Vial prepesado de 300 unidades USP</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano, Texas Red&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl&lt;br/&gt;0.17 mM KCl&lt;br/&gt;0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0.33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Jeringa de microlitros</td><td>Hamilton Co</td><td>80300</td><td>701N 10 μL SYR (26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

retro-orbital de inyección en adultos de pez cebra

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

El tratamiento farmacológico de la totalidad de animales es una herramienta esencial en cualquier sistema modelo para estudios genéticos farmacológicos y químicos. Intravenosa (IV) de la inyección es a menudo la forma más eficaz y no invasiva de administración de un agente de interés. En el pez cebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), La inyección intravenosa de drogas ha sido un desafío debido a que el diámetro de pequeños vasos. Esto también ha demostrado ser un obstáculo significativo para la inyección de las células durante el trasplante de células madre hematopoyéticas. Históricamente, las inyecciones en el torrente sanguíneo se realiza directamente a través del corazón. Sin embargo, este procedimiento intra-cardíaca tiene una mortalidad muy elevada, el corazón suele ser perforado durante la inyección de dejar a los peces propensos a la infección, pérdida masiva de sangre o daño en los órganos fatal. Basándonos en nuestra experiencia con el ratón, hemos desarrollado un procedimiento de inyección de nuevo en el pez cebra en el que el sitio de la inyección está detrás de los ojos y en el seno venoso retro-orbital. Este retro-orbital (RO) la técnica de inyección se ha empleado con éxito tanto en la inyección de drogas en los peces adultos, así como el trasplante de células de riñón de toda la médula ósea. RO de inyección tiene una tasa de mortalidad mucho más bajo que los tradicionales de inyección intra-cardiaca. Los peces que se inyectan retro-orbital tiende a sangrar menos después de la inyección y se encuentran en un riesgo mucho menor de lesión a un órgano principal como el corazón. Las células más, cuando se realiza correctamente, se inyecta y / o drogas rápidamente entran al torrente sanguíneo lo que permite a los compuestos ejercen su efecto sobre todo el pescado y las células de riñón de manera fácil en casa a su nicho. Por lo tanto, esta técnica reduce al mínimo la mortalidad nueva inyección al tiempo que permite la prestación eficiente de materiales en el torrente sanguíneo de los peces adultos. Aquí tenemos un ejemplo de esta técnica de retro-orbital inyección de Tg (<em&gt; Globina</em&gt;: GFP) en células adultas<em&gt; Casper</em&gt; Peces, así como la inyección de un tinte rojo fluorescente (dextrano, Texas Red<em&gt;</em&gt;) En adultos<em&gt; Casper</em&gt; Peces. A continuación, visualizar las inyecciones de éxito mediante microscopía de fluorescencia de todo animal.

Aquí te mostramos cómo hacer retro-orbital de la inyección en adultos de pez cebra.

Retro-orbital de inyección en adultos de pez cebra

El tratamiento farmacológico de animales completos es una herramienta esencial en cualquier sistema modelo para estudios farmacológicos y de genética química. La inyección intravenosa (IV) es...

Primero se recolectan glóbulos rojos del donante de peces transgénicos con globina GFP mediante la punción del corazón del animal donante y la aspiración de los glóbulos rojos. Una vez que las células están preparadas para la inyección, los peces receptores se inyectan por vía retroorbital y posteriormente se someten a imágenes mediante microscopía de fluorescencia estándar de todo el organismo para verificar la inyección exitosa de células marcadas con fluorescencia. De manera similar, se prepara un dextrano coloreado conjugado con Texas Red, se inyecta por vía retroorbital y el animal inyectado se somete a imágenes para confirmar una inyección exitosa.Hola, soy Emily Atch del Laboratorio de Leonard Zan en el Departamento de Hematología y Oncología del Hospital Pediátrico de Boston. Hoy les mostraremos un procedimiento para la inyección retroorbital en peces cebra adultos. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el trasplante de células madre hematopoyéticas.Así que comencemos. Demostraremos las inyecciones retroorbitarias de células transgénicas de globina GFP y un colorante fluorescente rojo, dextrina conjugada con Texas Red, en peces Casper adultos, una raza transparente de pez cebra, para preparar células transgénicas de globina. Se extraen las células de globina GFP de peces donantes adultos utilizando una punta de pipeta de 10 microlitros recubierta con heparina para perforar el pez detrás de las branquias, aspirar los glóbulos rojos y dispensarlos en un tampón celular.A continuación, filtre la suspensión celular a través de una malla de 40 micrómetros. Después de determinar la concentración de las células utilizando un hemocitómetro como se describió previamente por LeBlanc et al., centrifugue las células a 1500 RPM durante cinco minutos. Reuspenda las células en tampón celular a una concentración deseada de modo que el volumen final de inyección no supere los cinco microlitros.En esta demostración, inyectaremos entre 1,5 y 2 millones de células por receptor para preparar el colorante fluorescente rojo, disolviéndolo en DPBS para obtener una concentración final de inyección de 10 a 12 miligramos por mililitro. Inyectaremos cuatro microlitros por pez, ya que el procedimiento de inyección es el mismo. Independientemente del material inyectado, solo demostraremos la inyección del colorante fluorescente rojo.Antes de inyectar los peces, lave la jeringa Hamilton tres o cuatro veces utilizando etanol al 70 %. Enjuague tres o cuatro veces con XDPS 0,9. Después de anestesiar los peces en Trica, coloque los peces con el lado dorsal hacia arriba y mirando hacia la derecha sobre una esponja húmeda.Sostenga la jeringa Hamilton cargada con la mano derecha y con el dedo índice sobre el émbolo; con la mano izquierda estabilice suavemente el cuerpo del pez. Coloque la aguja con el bisel hacia arriba, de manera que si el ojo del pez fuera un reloj, la aguja apuntaría hacia la posición de las siete. E inclinada a 45 grados respecto al pez, inserte suavemente la aguja de uno a dos milímetros en la posición de las siete y presione lentamente el émbolo.Deje que los peces se recuperen en agua fresca E tres. Mantenga a los peces fuera del flujo durante una semana con cambios diarios de agua para evitar infecciones; mantenemos a los peces en agua de UCI durante este período. Cuando las inyecciones retroorbitarias se realizan correctamente, es posible visualizar el material inyectado que ha sido marcado.Por ejemplo, los glóbulos rojos transgénicos con globina GFP pueden observarse mediante un microscopio de disección fluorescente circulando por la vasculatura de la cola de un pez Casper adulto receptor tres días después de la inyección; asimismo, la inyección exitosa de una dextrina de 70 kilodalton conjugada con rojo Texas produce inmediatamente una vasculatura fluorescente. En el pez Casper adulto transparente, que se visualiza fácilmente mediante microscopía de fluorescencia de todo el organismo, también pueden inyectarse por vía retrooral células de médula de riñón agujereado fluorescentes procedentes de un pez donante transgénico con beta actina GFP en un pez Casper receptor irradiado. Estas células finalmente migrarán hacia la médula del receptor, como se muestra aquí, tres días después de la inyección; cuatro semanas después, estas células donantes verdes pueden llegar a repoblar el riñón del receptor.Acabamos de mostrarle cómo realizar inyecciones retroorbitarias en peces cebra adultos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar inyectar con la aguja a un ángulo de 45 grados respecto al plano del pez. Eso es todo.Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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