La medición de la tensión de la membrana inducida con Di-8-ANEPPS

Para un biólogo, una célula es el ladrillo fundamental de la vida que contiene una serie de orgánulos diferentes, cada uno realizando tareas específicas y que en conjunto permiten a la célula desempeñar sus funciones vitales desde una perspectiva eléctrica. Sin embargo, la estructura interna no es muy importante, y la célula puede considerarse como un citoplasma conductor encerrado por una membrana aislante y rodeado por un entorno exterior conductor. Un pequeño desequilibrio en las concentraciones iónicas, con los iones en exceso acumulándose cerca de la membrana, da lugar al voltaje de reposo de la membrana.

Colocar una célula en un campo eléctrico provoca una redistribución local de cargas en ambos lados de la membrana. El resultado es un voltaje inducido en la membrana, que se superpone al voltaje de reposo y desaparece cuando se apaga el campo. Con formas celulares simples, el voltaje inducido en la membrana puede calcularse analíticamente para una célula esférica.

Se describe mediante la ecuación de Schwan, que establece que el voltaje es proporcional a la intensidad del campo y al tamaño celular, y sigue la función coseno a lo largo de la membrana. Para formas celulares más complejas, el voltaje inducido puede desviarse considerablemente de la función coseno y debe determinarse ya sea numéricamente mediante una computadora potente o experimentalmente utilizando un colorante métrico de potencial. Uno de los colorantes métricos de potencial ampliamente utilizado con este fin es el dietil AIPs.

Un colorante rápido cuyos espectros de excitación y emisión dependen del voltaje de la membrana, los AIPs se vuelven fuertemente fluorescentes al unirse a la membrana, con un cambio en la intensidad de fluorescencia proporcional al cambio en el voltaje de la membrana. Este video muestra el protocolo para medir el voltaje de membrana inducido utilizando D AIPs. En este ejemplo, se utilizan células de ovario de hámster chino, que se siembran en cámaras a 100.000 células por cámara.

En el cultivo HAMF 12, suplemente el medio con suero fetal bovino, L-glutamina y antibióticos, e incube las células en su medio de cultivo durante dos a cuatro horas para obtener células adheridas de forma esférica, o de 16 a 20 horas para obtener células individuales adheridas de formas más complejas. Prepare una solución stock de 10 millones de MO de diet aaps disuelta en DMSO en el vial original. Algunas líneas celulares pueden requerir la adición de onic para facilitar la incorporación del colorante en la membrana. Transfiera un mililitro de los agitadores, modificación del medio mínimo esencial (SMEM), a un tubo EOL con 2,5 microlitros de onic al 20 % y tres microlitros de diet aaps 10 milimolar.

Esto produce una solución de carga que contiene aproximadamente 30 micromolar de diet aaps y 0,05 % de onic. Reemplace el medio de cultivo en la cámara con la solución de carga. Transfiera la cámara al refrigerador durante 10 minutos a cuatro grados Celsius a esta temperatura.

La internalización del colorante a través de la membrana plasmática está ampliamente inhibida tras la tinción; lave cuidadosamente el exceso de colorante varias veces con SMEM puro. Finalmente, deje 1,5 mililitros de SMEM en la cámara. Las células se observan utilizando un microscopio de fluorescencia con objetivo de inmersión en aceite, un monocromador y una cámara CCD.

En el software de adquisición, configure la longitud de onda de excitación en 419 nanómetros y elija un filtro de paso de banda ajustado aproximadamente en 605 nanómetros, aunque no se aplica aquí. Diet aaps también permite mediciones ratiométricas del voltaje de membrana. Coloque la cámara con las células sobre la platina del microscopio, posicione los electrodos en la parte inferior de la cámara y conéctelos al generador de impulsos.

En este ejemplo, se genera un pulso cuadrado con una amplitud de 35 volts y una duración de 50 milisegundos. Mediante una fuente de voltaje de corriente continua y un conmutador controlado por microprocesador, el pulso se aplica a un par de electrodos, creando un campo eléctrico entre ellos e induciendo el voltaje de la membrana. La aplicación del pulso debe estar sincronizada con la adquisición de imágenes.

Localice las células de interés, aplique un solo pulso eléctrico o una secuencia de pulsos para cada pulso. Adquiera dos imágenes de fluorescencia: la imagen de control inmediatamente antes del pulso y la imagen del pulso durante el pulso, debido a la baja respuesta del colorante. Los cambios en la fluorescencia son difíciles de distinguir y solo se vuelven evidentes tras el procesamiento; abra las imágenes para cada pulso.

Reste el fondo en ambas imágenes, la de control y la de pulso. Elija una célula y establezca la región de interés de modo que corresponda a la membrana. Mida la fluorescencia a lo largo de esta región en las imágenes de control y de pulso, y transfiera los valores a una hoja de cálculo para cada pulso.

Reste los datos del control de los datos del pulso y divida el resultado por los datos del control para obtener los cambios relativos de fluorescencia. Si se aplica una secuencia de pulsos, los valores de cambio relativo determinados para cada pulso pueden promediarse. Para obtener una medición más confiable, transforme los cambios relativos de fluorescencia en el voltaje inducido en la membrana.

Mediante una curva de calibración, se puede obtener una estimación aproximada de esta curva a partir de la literatura, pero para una mayor precisión, debe medirse para cada configuración particular. Represente el voltaje en función de la longitud relativa del arco. La curva también puede suavizarse utilizando un filtro adecuado para células esféricas.

El gráfico resultante es similar a un coseno, de acuerdo con la ecuación de Schwan. Para formas celulares más complejas, el mismo procedimiento produce distribuciones espaciales más intrincadas del voltaje de membrana.