Name: La medición de la tensión de la membrana inducida con Di-8-ANEPPS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-19T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprende a medir el voltaje inducido en membranas celulares usando el colorante potenciométrico di-8-ANEPPS y microscopía de fluorescencia. Este protocolo permite estudiar la dinámica electrofisiológica en células CHO vivas.

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Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Investigación de Eslovenia con el proyecto de Z2-9229 y el programa P2-0249. Este video representa el material complementario para la &quot;base de electroporación, tecnologías y tratamientos&quot; taller científico y postgrado, organizado cada dos años por la Facultad de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de Ljubljana, en Eslovenia.

Parte I: Pasos preliminares <ol><li> En este experimento ovario de hámster chino línea celular (CHO-K1) se utiliza. Las células se colocan en Lab-Tek II cámaras (dos pozos, 4 cm 2 cada uno) (Nalge Nunc, Alemania) a ~ 0.7x10 5 células / ml en la HAM-F12 medio de cultivo suplementado con 8% de suero fetal bovino, 0,15 mg / ml L-glutamina, 16 mg / ml de gentamicina (todos de Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania), y 200 unidades / ml Crystacillin (Pliva, Zagreb, Croacia), y se incubaron en el 5% de CO 2 a 37 ° C. Alternativamente, las células también pueden ser chapados en # 1 se desliza cubierta de vidrio (0,13 a 0,16 mm de espesor), recubierta con un adhesivo de celulares, tales como polilisina. </li><li> Se incuban las células en su medio de cultivo. La incubación dura de 2 a 4 Rendimientos horas las células que aún están más o menos esférico, pero firmemente adherida a la superficie con una pequeña parte de su membrana. Por otra parte, después de 16 a 20 horas de incubación, las células están totalmente adheridos a la superficie y tienen formas más complejas, pero la mayoría de ellos todavía no dividir. </li><li> Prepare una solución stock 10 mM de di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, EE.UU.) mediante la adición de 843 l de DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) a 5 mg del colorante en el vial de Invitrogen original. La solución madre se pueden almacenar en un refrigerador a 4 ° C durante varios meses. Antes de comenzar los experimentos, calentar la solución hasta que los cristales se disuelven de DMSO. </li><li> Algunas líneas celulares pueden requerir el uso de Pluronic a facilitar la incorporación de contraste en la membrana celular. Pluronic se pueden comprar en solución de reserva del 20% en DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, EE.UU.), o una solución de reserva de la misma concentración se puede preparar disolviendo plurónico en DMSO. Solución de archivo de Pluronic se pueden almacenar a temperatura ambiente. </li></ol> Parte II: Carga de las células con di-8-ANEPPS <ol><li> Mezcle 3 l de 10 mM di-8-ANEPPS y 2,5 l de 20% plurónico en 1 ml de la modificación Spinner (calcio agotado versión) de la SMEM medio mínimo esencial (M8167 o M4767 medio, Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania ) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Esto produce una &quot;solución de carga&quot;, que contiene aproximadamente 30 M-8-di ANEPPS y 0,05% de Pluronic. Para otros tipos de células, sus medios de cultivo nativo se puede utilizar en lugar de SMEM. </li><li> Vuelva a colocar el medio de cultivo en la cámara Lab-Tek con la solución de carga. La transferencia de la cámara a la nevera durante 10 min a 4 ° C. A esta temperatura, la internalización del colorante a través de la membrana plasmática es muy reprimidas. </li><li> Después de la tinción, lave el exceso de colorante dos o tres veces con SMEM puro. </li><li> Agregar 1,5 ml de SMEM en la cámara. </li></ol> Parte III: Experimento y la adquisición de imágenes <ol><li> Las células se observan con un microscopio de fluorescencia (en nuestro caso Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Alemania) equipado con un objetivo de inmersión en aceite (x63, NA 1.4), un VisiCam monocromador (policroma IV, Visitron, Alemania) y una cámara CCD enfriado ( 1280, Visitron, Alemania). Las imágenes se adquieren con MetaFluor 7.1.1 y procesada en MetaMorph 7.1.1 (tanto Molecular Devices, Downingtown, PA, EE.UU.), pero otro software de adquisición similar también se puede utilizar. La longitud de onda de excitación en el software de adquisición de 490 nm y elegir un filtro de emisión adecuados para ANEPPS, por ejemplo, un filtro pasa-banda centrado en 605 nm (605/55m, dicroico 565 DCXR, Chroma, Rockingham, Vermont, EE.UU.). Si un monocromador no está disponible, un filtro de excitación centrado en 490 nm se puede utilizar en su lugar. </li><li> Coloque la cámara con las células en el microscopio, la posición de los electrodos en la parte inferior de la cámara y su conexión con el generador de impulsos. El medio debe cubrir los electrodos. </li><li> Para mantener la viabilidad celular y reducir el calentamiento, el pulso debe ser de amplitud suficientemente baja y de corta duración. En este experimento, un pulso cuadrado de 35 V de amplitud y 50 ms de duración (lo suficientemente baja como para evitar la electroporación) se genera mediante una fuente de tensión continua y una medida controlado por microprocesador, el dispositivo de conmutación. Por otra parte, un generador de impulsos comerciales, tales como 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.), conectado a un amplificador o un estimulador comercial, como el S88 (Grass, West Warwick, Rhode Island, EE.UU.), se puede utilizar. El pulso se entrega a dos electrodos paralelos de alambre de Pt / Ir con un diámetro de 0,8 mm y 4 mm de distancia entre ellos, creando un campo eléctrico de aproximadamente 88 V / cm entre los electrodos y ΔΦ inducción. La distribución exacta de campo entre los electrodos utilizados en este experimento es descrito en [1]. </li><li> Encuentra las células de interés. Aplicar un pulso eléctrico o una secuencia de pulsos. Para cada pulso, la adquisición de dos imágenes de fluorescencia: una inmediatamente antes del pulso (el control de la imagen), y uno durante el pulso (la imagen de pulso). Debido a la baja respuesta de los di-8-ANEPPS, los cambios en la fluorescencia son difíciles de percibir a simple vista y llegar a ser aparente only después del procesamiento. La entrega de pulso debe estar sincronizado con la adquisición de la imagen, que es una característica de la adquisición de software. Para evitar posibles photobleaching y calefacción, la iluminación puede ser limitada a la duración del pulso. </li></ol> Parte IV: El procesamiento de imágenes y análisis <ol><li> Abra las imágenes en el software MetaMorph. Para cada pulso, restar el fondo, tanto en el control y la imagen de pulso. </li><li> Elegir un conjunto de células y la región de interés por lo que corresponde a la membrana. Medir la intensidad de fluorescencia a lo largo de esta región en el control de la imagen y el pulso y la transferencia de los valores de una hoja de cálculo. </li><li> Para cada pulso, restar los datos de control de los datos de pulso, y dividir el resultado por los datos de control para obtener los cambios de fluorescencia relativa. Si una secuencia de pulsos se aplica, los valores de los cambios relativos de fluorescencia determinada por cada pulso se promedian para obtener una medición más confiable. </li><li> Transformar los cambios de fluorescencia relativa a ΔΦ utilizando una curva de calibración. Una estimación aproximada de la curva se puede obtener de la literatura, pero para mayor precisión, tiene que ser medida para cada instalación en particular. Para las células y la configuración utilizada en este experimento una disminución del 6% de la fluorescencia corresponde a un incremento de 100 mV en ΔΦ [2]. </li><li> Finalmente, grafique el voltaje en función de la longitud del arco relativa en un paquete de software de gráficos, tales como Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA, EE.UU.), Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA, EE.UU.), o origen (OriginLab Corp., Northampton, MA, EE.UU.). La curva también pueden ser suavizadas con un filtro adecuado, como el filtro de media móvil. </li></ol>

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</ol>

Las mediciones de la membrana inducido (transmembrana) de tensión, ΔΦ, puede ser importante en diversos parámetros experimentales, tales como estudios de los canales de membrana voltaje-dependientes, propagación de potenciales de acción, la estimulación de células cardíacas, o la electroporación de la membrana celular [3, 4, 5, 6 , 7]. Con formas simples de células, ΔΦ se puede calcular analíticamente. Por ejemplo, para una célula esférica, ΔΦ está dada por la ecuación de Schwan s, que establece que la tensión es proporcional a la intensidad de campo y el tamaño celular y sigue a la función del coseno a lo largo de la membrana [8, 9]. Para más formas de células complicado, ΔΦ pueden desviarse considerablemente de la del coseno y debe ser determinado numéricamente, usando una computadora [2, 10, 11], o de forma experimental, utilizando un medio de potenciométrica [12, 13, 14, 15]. Uno de los colorantes potenciométricos utilizados para este propósito es di-8-ANEPPS (di-8-butil-amino-naftil-etilen-piridinio-propil-sulfonato), un tinte rápido con los espectros de excitación y de emisión depende de la tensión de la membrana, que permite que las observaciones no invasivo de las variaciones de la ΔΦ en la membrana celular y para medir su valor. En este vídeo, se muestra un enfoque experimental para la determinación de ΔΦ mediante el uso de di-8-ANEPPS. El colorante fue desarrollado por el profesor Leslie Loew y sus colegas [13, 14] en la Universidad de Connecticut, y pertenece a la clase de respuesta rápida colorantes. di-8-ANEPPS es no fluorescente en el agua y se convierte en fuertemente fluorescente cuando se incorpora en la bicapa lipídica de la membrana celular. Un cambio en los resultados de ΔΦ en un cambio de la distribución de carga intramolecular y los correspondientes cambios en el perfil espectral y la intensidad de la fluorescencia del colorante. La intensidad de fluorescencia de di-8-ANEPPS varía proporcionalmente al cambio de ΔΦ, la respuesta de la tintura es lineal para las tensiones que van desde -280 mV a 250 mV [4, 16]. Cambios relativamente pequeños en la fluorescencia de las manchas del tinte, la membrana irregular, y la internalización de tinte que di-8-ANEPPS menos adecuados para la medición absoluta de la tensión de la membrana, por ejemplo, su componente de descanso, a pesar de estos esfuerzos también se informó [17]. Es, sin embargo, adecuada para medir los cambios más grandes en el voltaje de la membrana, tales como la aparición de la tensión de la membrana en las células no excitables inducida expuestos a campos eléctricos externos [12, 13], o potenciales de acción en las células excitables [4, 5]. Aunque no se aplica aquí, di-8-ANEPPS también permite la determinación de las mediciones ΔΦ radiométrica de excitación de fluorescencia [18] o de las emisiones [19], lo que aumenta la sensibilidad de la respuesta y reduce los efectos antes mencionados. Como di-8-ANEPPS manchas de la membrana, sino que también puede ser utilizado simplemente como un marcador de membrana [2]. Uno de los inconvenientes de la tintura es que es propenso a photobleaching, por lo que la exposición prolongada a la luz fuerte se debe evitar. La calibración de la tintura se realiza ya sea con valinomicina ionóforo (i) de potasio y un conjunto de diferentes concentraciones de potasio en el medio externo [2,18], o (ii) de patch-clamp en el modo de fijación de voltaje [17]. Finalmente, con las medidas de ΔΦ en células esféricas y las células de formas más complejas, el video muestra la influencia de la forma de la célula en la distribución espacial de la amplitud y ΔΦ. Así, por células esféricas ΔΦ está cerca de un coseno, de acuerdo con la ecuación de Schwan, mientras que para las formas más complicadas de células de la distribución espacial de ΔΦ es más complejo [20] ...

<table><tbody><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td>tinción fluorescente potenciométrica</td></tr><tr><td>plurónico</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>iónforo de potasio</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>SMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8167 o M4767</td><td>Modificación rotatoria del Medio Mínimo Esencial</td></tr><tr><td>Ham-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4888</td><td>medio de cultivo</td></tr><tr><td>suero de ternera fetal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacilina</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Lab-Tek II</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td>cámara</td></tr><tr><td>fuente de voltaje de corriente continua</td><td>Elektro-Automatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>conmutador controlado por microprocesador</td><td>Personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>electrodos</td><td>Personalizado</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

la medición de la tensión de la membrana inducida con di-8-anepps

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

La colocación de una celda en un campo eléctrico externo provoca una redistribución de carga en el interior local y exterior de la célula en los alrededores de la membrana celular, lo que resulta en un voltaje a través de la membrana. Este voltaje, llamado el voltaje de la membrana inducida (tensión inducida también transmembrana, o la diferencia de potencial transmembrana inducida) y se denota por ΔΦ, existe sólo mientras el campo externo está presente. Si la tensión de reposo está presente en la membrana, la tensión inducida superpone (agrega) en la misma. Mediante el uso de uno de los tintes fluorescentes potenciométrica, como di-8-ANEPPS, es posible observar las variaciones de ΔΦ en la membrana celular y para medir su valor forma no invasiva. di-8-ANEPPS se convierte en fuertemente fluorescente cuando se une a la bicapa lipídica de la membrana celular, con el cambio de la intensidad de fluorescencia proporcional al cambio de ΔΦ. Este video muestra el protocolo para la medición de ΔΦ con di-8-ANEPPS y también demuestra la influencia de la forma celular de la amplitud y la distribución espacial de ΔΦ.

Campo eléctrico externo provoca una tensión en la membrana de una célula, denominada tensión de la membrana inducida (ΔΦ). Mediante el uso de la tintura potenciométrica di-8-ANEPPS, es posible medir el ΔΦ no invasiva. Este video muestra el protocolo para la medición de ΔΦ con di-8-ANEPPS.

La medición de la tensión de la membrana inducida con Di-8-ANEPPS

La colocación de una célula en un campo eléctrico externo provoca una redistribución local de la carga dentro y fuera de la célula en las proximidades de la misma...

Para un biólogo, una célula es el ladrillo fundamental de la vida que contiene una serie de orgánulos diferentes, cada uno realizando tareas específicas y que en conjunto permiten a la célula desempeñar sus funciones vitales desde una perspectiva eléctrica. Sin embargo, la estructura interna no es muy importante, y la célula puede considerarse como un citoplasma conductor encerrado por una membrana aislante y rodeado por un entorno exterior conductor. Un pequeño desequilibrio en las concentraciones iónicas, con los iones en exceso acumulándose cerca de la membrana, da lugar al voltaje de reposo de la membrana.Colocar una célula en un campo eléctrico provoca una redistribución local de cargas en ambos lados de la membrana. El resultado es un voltaje inducido en la membrana, que se superpone al voltaje de reposo y desaparece cuando se apaga el campo. Con formas celulares simples, el voltaje inducido en la membrana puede calcularse analíticamente para una célula esférica.Se describe mediante la ecuación de Schwan, que establece que el voltaje es proporcional a la intensidad del campo y al tamaño celular, y sigue la función coseno a lo largo de la membrana. Para formas celulares más complejas, el voltaje inducido puede desviarse considerablemente de la función coseno y debe determinarse ya sea numéricamente mediante una computadora potente o experimentalmente utilizando un colorante métrico de potencial. Uno de los colorantes métricos de potencial ampliamente utilizado con este fin es el dietil AIPs.Un colorante rápido cuyos espectros de excitación y emisión dependen del voltaje de la membrana, los AIPs se vuelven fuertemente fluorescentes al unirse a la membrana, con un cambio en la intensidad de fluorescencia proporcional al cambio en el voltaje de la membrana. Este video muestra el protocolo para medir el voltaje de membrana inducido utilizando D AIPs. En este ejemplo, se utilizan células de ovario de hámster chino, que se siembran en cámaras a 100.000 células por cámara.En el cultivo HAMF 12, suplemente el medio con suero fetal bovino, L-glutamina y antibióticos, e incube las células en su medio de cultivo durante dos a cuatro horas para obtener células adheridas de forma esférica, o de 16 a 20 horas para obtener células individuales adheridas de formas más complejas. Prepare una solución stock de 10 millones de MO de diet aaps disuelta en DMSO en el vial original. Algunas líneas celulares pueden requerir la adición de onic para facilitar la incorporación del colorante en la membrana. Transfiera un mililitro de los agitadores, modificación del medio mínimo esencial (SMEM), a un tubo EOL con 2,5 microlitros de onic al 20 % y tres microlitros de diet aaps 10 milimolar.Esto produce una solución de carga que contiene aproximadamente 30 micromolar de diet aaps y 0,05 % de onic. Reemplace el medio de cultivo en la cámara con la solución de carga. Transfiera la cámara al refrigerador durante 10 minutos a cuatro grados Celsius a esta temperatura.La internalización del colorante a través de la membrana plasmática está ampliamente inhibida tras la tinción; lave cuidadosamente el exceso de colorante varias veces con SMEM puro. Finalmente, deje 1,5 mililitros de SMEM en la cámara. Las células se observan utilizando un microscopio de fluorescencia con objetivo de inmersión en aceite, un monocromador y una cámara CCD.En el software de adquisición, configure la longitud de onda de excitación en 419 nanómetros y elija un filtro de paso de banda ajustado aproximadamente en 605 nanómetros, aunque no se aplica aquí. Diet aaps también permite mediciones ratiométricas del voltaje de membrana. Coloque la cámara con las células sobre la platina del microscopio, posicione los electrodos en la parte inferior de la cámara y conéctelos al generador de impulsos.En este ejemplo, se genera un pulso cuadrado con una amplitud de 35 volts y una duración de 50 milisegundos. Mediante una fuente de voltaje de corriente continua y un conmutador controlado por microprocesador, el pulso se aplica a un par de electrodos, creando un campo eléctrico entre ellos e induciendo el voltaje de la membrana. La aplicación del pulso debe estar sincronizada con la adquisición de imágenes.Localice las células de interés, aplique un solo pulso eléctrico o una secuencia de pulsos para cada pulso. Adquiera dos imágenes de fluorescencia: la imagen de control inmediatamente antes del pulso y la imagen del pulso durante el pulso, debido a la baja respuesta del colorante. Los cambios en la fluorescencia son difíciles de distinguir y solo se vuelven evidentes tras el procesamiento; abra las imágenes para cada pulso.Reste el fondo en ambas imágenes, la de control y la de pulso. Elija una célula y establezca la región de interés de modo que corresponda a la membrana. Mida la fluorescencia a lo largo de esta región en las imágenes de control y de pulso, y transfiera los valores a una hoja de cálculo para cada pulso.Reste los datos del control de los datos del pulso y divida el resultado por los datos del control para obtener los cambios relativos de fluorescencia. Si se aplica una secuencia de pulsos, los valores de cambio relativo determinados para cada pulso pueden promediarse. Para obtener una medición más confiable, transforme los cambios relativos de fluorescencia en el voltaje inducido en la membrana.Mediante una curva de calibración, se puede obtener una estimación aproximada de esta curva a partir de la literatura, pero para una mayor precisión, debe medirse para cada configuración particular. Represente el voltaje en función de la longitud relativa del arco. La curva también puede suavizarse utilizando un filtro adecuado para células esféricas.El gráfico resultante es similar a un coseno, de acuerdo con la ecuación de Schwan. Para formas celulares más complejas, el mismo procedimiento produce distribuciones espaciales más intrincadas del voltaje de membrana.

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Investigación

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Biology

Biología

Esta es una demostración de cómo las membranas biológicas se puede entender el uso de modelos eléctricos. También demuestran los procedimientos para el registro de potenciales de acción desde el cordón nervioso ventral de los cangrejos de río para los laboratorios de los estudiantes orientados.

Modelado de membranas biológicas con placas de circuitos y medición de señales eléctricas en los axones: Ejercicios de laboratorio para estudiantes

La fabricación, la calibración y el uso de sondas no invasivas para medir la corriente vibratoria bioeléctrica en diversos sistemas biológicos se describe.

Medición de la corriente bioeléctrica con una sonda vibrante

La técnica amperométrica mide la liberación de dopamina a partir de una única célula mediante la detección de la corriente oxidativo producido por la oxidación espontánea dopamina. Fijación de tensión simultánea y metodología amperometría revelar la relación mecanicista entre el general "actividad" del transportador de dopamina y el papel regulador de esta actividad en el transporte inverso de la dopamina.

Medición única célula de la liberación de dopamina simultánea con fijación de voltaje y Amperometría

Aquí presentamos un método electrofisiológico basado en membranas de soporte sólido con el foco en sus aplicaciones para la caracterización de transportadores de membrana electrógenos.

Introducción a Solid membrana compatibles Basada Electrofisiología

Los transportadores en las membranas celulares permiten la segregación diferencial de iones a través de las membranas celulares o capas celulares y desempeñan un papel crucial durante la fisiología, reparación y patología de los tejidos. Describimos el microelectrodo autorreferencial selectivo de iones que permite la medición de flujos de iones específicos en células individuales y tejidos in vivo.

Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica

Canales mechanosensitive bacterianas se pueden utilizar como transductores mechanoelectrical en dispositivos biomoleculares. Bicapas Gotita de interfaz (DIB), bloques de construcción de células de inspiración a este tipo de dispositivos, representan nuevas plataformas para incorporar y estimular canales mechanosensitive. Aquí, demostramos un nuevo método basado en la micropipeta de formar DIB, lo que permite el estudio de los canales mechanosensitive bajo estimulación mecánica.

Multifuncional, Micropipeta basada en el Método de Incorporación y la estimulación de Canales bacteriana mechanosensitive Ion en Gotita de interfaz Bilayers

Se describe un método para obtener imágenes de los cambios en el potencial de membrana utilizando indicadores de voltaje codificados genéticamente.

Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

Describimos un método para la preparación de las células musculares lisas detrusorreciéntes recién aisladas a partir de muestras de vejiga urinaria humana que emplean un procedimiento enzimático de dos pasos. Las células DSM viables obtenidas pueden ser estudiadas por varias técnicas de células individuales, incluyendo la electrofisiología de abrazadera de parche anfotericina-B descrita para revelar propiedades fisiológicas y farmacológicas.

Preparación y utilización de células musculares lisas de detrusor humano recién aisladas para la caracterización de corrientes de cationes sensibles al 9-Phenanthrol

Aquí, demostramos cómo configurar un antímetro de voltios barato con frecuencia de salida programable que se puede utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para mediciones de resistencia eléctrica transepitelial/endotelial.

Un enfoque simple para realizar mediciones TEER utilizando un antímetro de voltios autohecho con frecuencia de salida programable

Este protocolo describe una metodología reproducible para la fabricación de membranas sostenibles de matriz mixta metal-orgánico/polímero y la medición precisa de su conductividad de protones en el plano bajo temperatura y humedad variables mediante espectroscopía electroquímica de impedancia, lo cual puede ser útil para pilas de combustible de membrana de intercambio de protones (PEMFC).

Medición de la conductividad de protones en membranas de matriz mixta basadas en MOF mediante espectroscopía electroquímica de impedancias

Aprende a medir el voltaje inducido en membranas celulares usando el colorante potenciométrico di-8-ANEPPS y microscopía de fluorescencia. Este protocolo permite estudiar la dinámica electrofisiológica en células CHO vivas.

La medición de la tensión de la membrana inducida con Di-8-ANEPPS

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