Name: La médula espinal de Electrofisiología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Aprende a realizar una laminectomía ventral para aislar la médula espinal de ratón neonatal y registrar su actividad neural mediante electrodos. Este método es esencial para estudios de neurofisiología.

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Samuel L. Pfaff es profesor en el Laboratorio de Expresión Génica en el Instituto Salk de Estudios Biológicos y un investigador en el Instituto Médico Howard Hughes. Este trabajo fue apoyado por el Christopher y Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Schnoeker Kent y Mike Sullivan en Recursos Multimedia en el Instituto Salk proporcionó asistencia con la fotografía y la edición.

1. Prepare líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) 1. En primer lugar, preparar un 2 litros de un depósito de 10 veces LCRa sin magnesio o calcio. Reactivos enumerados en milimolar. Los números de catálogo se refieren a Sigma / Aldrich. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> 2 Litros 10X LCRa (sin Mg o Ca) </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> mM </td><td> g/2L </td><td> Catálogo </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 40 </td><td> 5.96 </td><td> P-9333 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 1280 </td><td> 149,61 </td><td> S-7653 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 210 </td><td> 35.28 </td><td> S-6297 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 5 </td><td> 1.38 </td><td> S-9638 </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 300 </td><td> 108,12 </td><td> D-9434 </td></tr><tr><td colspan="4"> Agregue el agua destilada a 2L </td></tr></tbody></table> También vamos a preparar las soluciones 1M de MgSO 4 y CaCl 2 en 50 ml de agua para permitir ajustes en molaridad de experimento a experimento y para asegurar que el calcio se mantiene en solución. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> Calcio 1M y las poblaciones de magnesio </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> M </td><td> g/50mL </td><td> Catálogo </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 </td><td> 7.35 </td><td> C-5080 </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 1 </td><td> 12.33 </td><td> M-5921 </td></tr></tbody></table> La solución debe ser gaseados LCRa con carbogen (95% O2 / CO2 al 5%) para reducir el pH antes de la adición de calcio o calcio se precipitan. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 Litro LCRa </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> 10X LCRa </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M CaCl2 </td><td> 1 ml (disección) 2 ml (de grabación) </td></tr><tr><td> 1M MgSO4 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir ~ 800 ml de agua destilada, con carbogen gas durante 2 minutos antes de la adición de calcio </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir agua destilada hasta 1 litro. </td></tr></tbody></table> Las bombas y tubos y platos de disección debe enjuagarse antes y después de su uso. Disección Mientras que la disección, 1 mM de calcio LCRa debe ser continuamente gaseados con carbogen. El LCRa puede ser desviada de una botella a la placa de disección y se bombea desde el plato de disección a la botella o enviados a los residuos. Nosotros usamos un elastómero (Sylgard, Dow Corning) plato recubierto de realizar la disección. El ratón neonatal es rápidamente decapitado con tijeras y se hace una incisión con tijeras por el tórax y el abdomen ventral. El animal es entonces eviscerado. El ratón eviscerado se enjuaga con LCRa. El animal es luego depositado en el plato de disección con alfileres de insectos inserta a través de las extremidades anteriores y en la base de la cola. La columna vertebral se elimina mediante la realización de una laminectomía ventral. La columna vertebral se mantiene con pequeñas pinzas y una hoja de tijera pequeña se inserta inmediatamente dorsal a la columna vertebral ósea. La lámina se corta en un lado y luego el otro, mientras que levantar suavemente la columna vertebral ósea. Esto se lleva a cabo para la longitud de la columna vertebral. La médula espinal es eliminado por el corte a lo largo de ambos lados de la médula espinal para cortar las raíces del nervio espinal y las meninges corte que rodea la médula espinal. Cortamos en los lados izquierdo y derecho, y luego cortamos las meninges atado a la parte dorsal de la médula espinal para liberarlo. El cable aislado es entonces clavada en el plato cerca de la entrada LCRa para asegurar una buena oxigenación si otros animales, se disecan. La médula espinal aislado se transfiere a un plato de grabación con una cuchara o una espátula. Aquí perfundir la preparación con oxigenada de calcio 2 mM LCRa. La médula espinal se fija en el plato recubierto de elastómero y micromanipulador utiliza para mover los electrodos extracelulares, toda aspiración de raíz cerca de las raíces. Cuando la punta del electrodo se encuentra cerca del extremo de la raíz libre, suave succión se aplica a sacar la raíz en el electrodo de succión. Este proceso se puede repetir para grabar varias raíces al mismo tiempo. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Decapitación y extracción de las vísceras. A. Rápidamente decapitar al ratón con unas tijeras afiladas. Contribuciones más o menos desde el tronco cerebral se puede lograr en función del nivel de corte. B. Coloque una hoja de la tijera en la abertura de la cavidad torácica creada por la decapitación. Abrir el tórax y el abdomen ventral a la base de la cola. Retire las vísceras y enjuague con LCRa. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La eliminación de la columna vertebral. A. Inserte la hoja izquierda de las tijeras en el espacio entre la columna vertebral y la médula espinal a la derecha de la médula espinal y cortar a través de los huesos por la que se ventral de la médula. A continuación, introduzca el extremo derecho de la tijera en el espacio entre la columna vertebral y la médula espinal a la izquierda de la médula espinal y se corta. B. Repita este proceso mientras se aplica una tracción suave de la columna vertebral. Tenga cuidado de no pinchar la médula espinal mediante la celebración de las tijeras en un ángulo bajo. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La eliminación de la médula espinal. A. Inserte la hoja izquierda de las tijeras en el espacio entre la médula espinal y los huesos a la derecha de la médula espinal y cortar a través de las raíces espinal y las meninges por la que se laterales a la médula. A continuación, introduzca el extremo derecho de la tijera en el espacio entre la médula espinal y los huesos a la izquierda de la médula espinal y cortar a través de las raíces espinal y las meninges por la que se laterales a la médula. B. Por último, levante suavemente el cable rostral y cortar las meninges de conectar el cable a la lámina dorsal. Una vez más tener cuidado de no pinchar la médula espinal mediante la celebración de las tijeras en un ángulo bajo. No corte las raíces demasiado cerca de la médula espinal.

<ol><li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Goulding, M., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+circuits+that+generate+simple+rhythmic+behaviors+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).</li>
<li>Gallarda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, (2008).</li>
<li>Gosgnach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V1+spinal+neurons+regulate+the+speed+of+vertebrate+locomotor+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs.</a> Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).</li>
<li>Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+spinal+interneurons+that+coordinate+left-right+locomotor+activity+necessary+for+walking+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements.</a> Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).</li>
<li>Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+functionally+mature+mouse+spinal+cord+preparation+for+the+study+of+spinal+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks.</a> Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).</li>
<li>Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+dual+modulatory+actions+on+spontaneous+postsynaptic+currents+in+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons.</a> J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).</li>
<li>Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+activity-dependent+network+depression+in+the+expression+and+self-regulation+of+spontaneous+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord.</a> J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).</li>
<li>Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-sensitive+MEQ+fluorescence+in+chick+embryo+motoneurons+following+manipulations+of+chloride+and+during+spontaneous+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity.</a> J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).</li>
</ol>

Cuidado de los Animales<br /&gt;<br /&gt; Los experimentos en animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Instituto Salk para Estudios Biológicos AIACUC.

El aislado de la médula espinal neonatal proporciona un método manejable de estudiar el sistema nervioso desarrollo1, 2. Dentro de la médula lumbar espinal de roedores recién nacidos, los circuitos centrales de generación de patrones puede producir locomoción ficticia en la presencia de neurotransmisores. Esta locomoción ficticia consiste en aumentos de ritmo en la actividad, las explosiones, que se producen en el 0,2 a 0,5 Hz. Estas explosiones se organizan para producir la alternancia izquierda-derecha a lo largo de l...

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td></td><td>P-9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>S-7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-6297</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td></td><td>D-9434</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras grandes</td><td>Fine Science Tools</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 (Dow-Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matraz aforado de 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matraz aforado de 100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la médula espinal de electrofisiología

Spinal Cord Electrophysiology

El cordón espinal de ratón recién nacido es un modelo para estudiar el desarrollo de circuitos neuronales y el movimiento del aparato locomotor. Nos demuestran que la disección de la médula espinal y la preparación del baño de grabación de líquido cefalorraquídeo artificial utilizado para estudios del aparato locomotor. Una vez disecado, las raíces nerviosas de la médula espinal ventral puede ser conectado a un electrodo de registro para registrar las señales electrofisiológicas de los circuitos generadores de patrones centrales dentro de la médula lumbar.

Una demostración del aislamiento de la médula espinal de ratón neonatal para los estudios electrofisiológicos.

La médula espinal de Electrofisiología

La médula espinal del ratón neonatal es un modelo para estudiar el desarrollo de los circuitos neurales y el movimiento locomotor. Demostramos la médula espinal ...

Vale. Hola, mi nombre es Alan Meyer y soy ayudante de investigación en el Laboratorio faf del Instituto Salk. Hoy les mostraré cómo realizar una laminectomía ventral para aislar la médula espinal de un ratón; además, les mostraré cómo fijar la médula espinal a un electrodo. Para registrar su actividad neuronal, necesitará preparar dos soluciones para la médula espinal: una para la disección y otra para el baño de registro.La única diferencia entre las dos soluciones será la concentración de cloruro de calcio. Primero deberá preparar una solución de 10 X-A-C-S-F. Para ello se necesitarán los reactivos que se enumeran a continuación.Comience añadiendo 100 mililitros de la X-A-C-S-F 10 X a un matraz aforado de un litro. A continuación, llene el matraz con agua, pero deje espacio para que no rebose. Cuando se burbujee gas, las soluciones con una concentración de gas del 5 %CO2 y 95 %O2.Para reducir el pH y oxigenar la solución, agregue un mililitro de sulfato de magnesio uno molar. A continuación, agregue un mililitro de una solución de cloruro de calcio uno molar a la solución de disección, y agregue dos mililitros de cloruro de calcio uno molar a la solución de registro. Pueden utilizarse ratones de edades entre E 16.5 y P 4 en estos experimentos.Comience la disección del ratón decapitándolo rápidamente con tijeras afiladas. A continuación, corte a lo largo de la línea media ventral hasta llegar a la cola. Luego, utilizando fórceps, eviscere al ratón y enjuáguelo con la solución de LCR A.Utilice la solución salina tamponada con calcio A de un milimolar para realizar la disección. Coloque el ratón en el recipiente de disección y sujételo con alfileres colocando uno en cada una de sus cuatro patas y otro en la base de la cola. Nuestro objetivo en esta parte será aislar la médula espinal cortando a lo largo de la línea punteada roja, separando la columna vertebral de la lámina que envuelve la médula espinal.Esto le permitirá exponer la médula espinal. A continuación, siga la línea para cortar las meninges y las raíces espinales, liberando así la médula espinal. Localice la columna vertebral y use una mano con pinzas para sujetar firmemente la columna vertebral y la otra con tijeras pequeñas.Para extraer la médula espinal, mantenga las tijeras en un ángulo bajo. Para evitar perforar la médula con las puntas de las tijeras, procederemos ahora a disecar la médula espinal. Siguiendo la línea roja, corte las meninges y las raíces espinales.Para extraer la médula espinal, puede cortar a lo largo de ambos lados del cordón y luego cortar a lo largo de la línea media ventral. Es importante mantener las tijeras en un ángulo bajo para no perforar la médula espinal. Es fundamental evitar cortar las raíces demasiado cerca de la médula espinal.A continuación, transfiera la médula espinal al baño de registro y conecte los electrodos a las raíces espinales. Coloque el electrodo cerca de la raíz. Luego, utilizando succión, introduzca suavemente el nervio en el electrodo.Gracias por ver el video y espero que sea útil en sus futuros experimentos.

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Investigación

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Biología

Una demostración de la fabricación y el uso de un electrodo de succión extracelular para medir los registros electrofisiológicos de los cables de la columna vertebral de roedores recién...

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

El video muestra la regeneración funcional de las conexiones propioespinales utilizando un ensayo basado en una matriz de electrodos múltiples (MEA). Los cortes de la médula espinal se colocan en el MEA y se dejan fusionar. Los cortes fusionados se separan mecánicamente creando una lesión, induciendo que las neuronas propioespinales crezcan sobre la lesión y conecten los cortes. Se evalúa la actividad eléctrica de las rodajas para identificar la regeneración de las conexiones funcionales.

Estudio de la regeneración de conexiones funcionales entre cortes de médula espinal utilizando una guía de electrodos múltiples

Este video presenta grabaciones electrofisiológicas de cocultivos organotípicos de cortes de médula espinal, capturados usando una matriz de electrodos múltiples o un dispositivo MEA. Estas grabaciones evalúan la regeneración neuronal entre los cortes. La actividad eléctrica sincronizada observada confirma el éxito de la regeneración neuronal.

Registros electrofisiológicos para la evaluación de las regeneraciones neuronales en cortes de médula espinal cocultivados

Inhibición presináptica GABAérgicas es un poderoso mecanismo inhibitorio en la médula espinal importante para el motor y la integración de la señal sensorial en las redes de la médula espinal. Subyacente despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de la raíz dorsal (DRP). Aquí se demuestra un método de grabación en vivo de DRP en ratones.

Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial<em&gt; En Vivo</em

El impulso respiratorio central se encuentra en el tronco encefálico. La salida motora respiratoria espontánea de un tronco encefálico aislado se registra colocando un electrodo en la cuarta raíz ventral. Este enfoque experimental es valioso para las investigaciones farmacológicas o la evaluación de los desafíos respiratorios y las manipulaciones genéticas en el comportamiento motor rítmico.

Electrofisiología en aislados Preparativos Cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal Respiratorio

Aquí se presenta un protocolo que se basa en rebanadas de la médula espinal cultivadas en matrices de electrodos múltiples para estudiar la regeneración funcional de conexiones propioespinal in vitro.

La investigación de la regeneración funcional en organotípicos médula espinal Co-culturas cultivadas en Arrays Multi-electrodos

Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Se describe el uso combinado de la tecnología de matriz de microelectrodos y la estimulación química inducida por 4-aminopiridina para investigar la actividad nociceptiva a nivel de red en el asta dorsal de la médula espinal.

Registro de la actividad de la red en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos

Este protocolo describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal (SCS) con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular simultáneamente.

La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal

Describimos un protocolo para el registro extracelular multicanal espinal junto con el registro de la función cardíaca y el análisis de las neuronas del asta dorsal espinal bloqueadas por el corazón. Este método ofrece un marco sincronizado temporalmente para estudiar los mecanismos de la columna vertebral que subyacen a los cambios funcionales viscerales torácicos inducidos por la acupuntura.

Estudio de los perfiles codificantes de la estimulación somática en las respuestas neuronales bloqueadas por el corazón en el asta dorsal espinal de la rata

Aprende a realizar una laminectomía ventral para aislar la médula espinal de ratón neonatal y registrar su actividad neural mediante electrodos. Este método es esencial para estudios de neurofisiología.

La médula espinal de Electrofisiología

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