La médula espinal de Electrofisiología
18 de enero de 2010
Una demostración del aislamiento de la médula espinal de ratón neonatal para los estudios electrofisiológicos.
Vale. Hola, mi nombre es Alan Meyer y soy ayudante de investigación en el Laboratorio faf del Instituto Salk. Hoy les mostraré cómo realizar una laminectomía ventral para aislar la médula espinal de un ratón; además, les mostraré cómo fijar la médula espinal a un electrodo. Para registrar su actividad neuronal, necesitará preparar dos soluciones para la médula espinal: una para la disección y otra para el baño de registro.
La única diferencia entre las dos soluciones será la concentración de cloruro de calcio. Primero deberá preparar una solución de 10 X-A-C-S-F. Para ello se necesitarán los reactivos que se enumeran a continuación.
Comience añadiendo 100 mililitros de la X-A-C-S-F 10 X a un matraz aforado de un litro. A continuación, llene el matraz con agua, pero deje espacio para que no rebose. Cuando se burbujee gas, las soluciones con una concentración de gas del 5 %CO2 y 95 %O2.
Para reducir el pH y oxigenar la solución, agregue un mililitro de sulfato de magnesio uno molar. A continuación, agregue un mililitro de una solución de cloruro de calcio uno molar a la solución de disección, y agregue dos mililitros de cloruro de calcio uno molar a la solución de registro. Pueden utilizarse ratones de edades entre E 16.5 y P 4 en estos experimentos.
Comience la disección del ratón decapitándolo rápidamente con tijeras afiladas. A continuación, corte a lo largo de la línea media ventral hasta llegar a la cola. Luego, utilizando fórceps, eviscere al ratón y enjuáguelo con la solución de LCR A.
Utilice la solución salina tamponada con calcio A de un milimolar para realizar la disección. Coloque el ratón en el recipiente de disección y sujételo con alfileres colocando uno en cada una de sus cuatro patas y otro en la base de la cola. Nuestro objetivo en esta parte será aislar la médula espinal cortando a lo largo de la línea punteada roja, separando la columna vertebral de la lámina que envuelve la médula espinal.
Esto le permitirá exponer la médula espinal. A continuación, siga la línea para cortar las meninges y las raíces espinales, liberando así la médula espinal. Localice la columna vertebral y use una mano con pinzas para sujetar firmemente la columna vertebral y la otra con tijeras pequeñas.
Para extraer la médula espinal, mantenga las tijeras en un ángulo bajo. Para evitar perforar la médula con las puntas de las tijeras, procederemos ahora a disecar la médula espinal. Siguiendo la línea roja, corte las meninges y las raíces espinales.
Para extraer la médula espinal, puede cortar a lo largo de ambos lados del cordón y luego cortar a lo largo de la línea media ventral. Es importante mantener las tijeras en un ángulo bajo para no perforar la médula espinal. Es fundamental evitar cortar las raíces demasiado cerca de la médula espinal.
A continuación, transfiera la médula espinal al baño de registro y conecte los electrodos a las raíces espinales. Coloque el electrodo cerca de la raíz. Luego, utilizando succión, introduzca suavemente el nervio en el electrodo.
Gracias por ver el video y espero que sea útil en sus futuros experimentos.
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Descripción general
Este artículo demuestra el aislamiento de la médula espinal de ratón neonatal para estudios electrofisiológicos. El procedimiento incluye realizar una laminectomía ventral y fijar la médula espinal a un electrodo para la grabación de la actividad neural.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
Antecedentes
- El aislamiento de la médula espinal es fundamental para estudiar la actividad neuronal.
- Las técnicas electrofisiológicas permiten la medición de señales neuronales.
- La concentración de cloruro de calcio es importante para las soluciones de disección y registro.
Objetivo del estudio
- Demostrar la técnica para aislar la médula espinal de ratón neonato.
- Mostrar cómo fijar la médula espinal a un electrodo.
- Facilitar la grabación de la actividad neuronal.
Métodos Utilizados
- Procedimiento de laminectomía ventral para el aislamiento de la médula espinal.
- Preparación de soluciones de disección y grabación.
- Uso de electrodos para la grabación de la actividad neuronal.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de la médula espinal de ratones neonatos.
- Fijación efectiva de la médula espinal a los electrodos.
- Grabación de la actividad neuronal demostrada.
Conclusiones
- La técnica es viable para estudios electrofisiológicos.
- La preparación de soluciones es fundamental para obtener resultados exitosos.
- Este método puede aplicarse en diversos contextos de investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el aislamiento de la médula espinal de ratones neonatos para la evaluación electrofisiológica de los circuitos generadores de patrones centrales, lo que apoya la reducción de riesgos mecanicistas en la validación de dianas para trastornos neuromusculares. El método proporciona un sistema relevante para la enfermedad con el fin de investigar la función de la red locomotora y evaluar los efectos de compuestos sobre la señalización neural. Mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al permitir la medición cuantitativa de las respuestas electrofisiológicas obtenidas a partir de un modelo preclínico validado.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas relacionadas con el desarrollo del circuito locomotor y la interacción con los objetivos neuromusculares.
- Valor operativo: Proporciona un preparado reproducible de tejido de la médula espinal para grabaciones electrofisiológicas consistentes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Apoya la estandarización de ensayos mediante soluciones de disección controladas y concentraciones definidas de cloruro de calcio para garantizar la estabilidad del baño de registro.
- Valor operativo: Facilita la preparación de sistemas biológicos validados para ensayos posteriores de cribado de compuestos y flujos de trabajo de detección de señales.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Ofrece un sistema relevante para la enfermedad para evaluar los cambios en la actividad neural asociados con fenotipos locomotores en modelos preclínicos.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar lecturas electrofisiológicas cuantificables.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar preparaciones aisladas de la médula espinal que permiten la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías para objetivos neuromusculares.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función del generador de patrones centrales y la modulación de circuitos neuronales.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante soluciones estandarizadas de disección y registro con composición iónica definida.
- Análisis: Genera mediciones electrofisiológicas cuantitativas de las raíces nerviosas ventrales para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar una salida medible para la modulación de objetivos relacionados con la locomoción.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de preparación de tejido neural aplicable en múltiples programas de descubrimiento neuromuscular.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la función del circuito locomotor.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad mediante la preparación definida de soluciones y técnicas de disección.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana de los efectos del compuesto sobre la señalización neural.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos neuromusculares basada en perfiles de respuesta electropisiológica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección de ratones neonatos y técnicas de registro electrofisiológico.
- Depende de instrumentación para la fijación del electrodo de succión y la adquisición de señales neuronales.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de las soluciones de disección y registro.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicarse a diferentes etapas del desarrollo o modelos de enfermedad.
- Limitado por la necesidad de un control preciso de la concentración de cloruro de calcio para mantener la viabilidad del tejido durante el registro.
