Name: Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprende a medir tasas endocíticas de proteínas de membrana plasmática mediante biotinilación reversible. Este método utiliza reactivos impermeables para aislar proteínas internalizadas y estudiar dinámica de membrana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por el NIH subvención # DA15169 de HEM

Descripción general del procedimiento: Con este enfoque, proteínas de superficie celular son covalentemente marcado con biotina de disposición de residuos de lisina extracelular utilizando un impermeant membrana, disulfuro de acoplamiento reactivo biotinilación (sulfo-NHS-SS-biotina) en el tráfico de condiciones restrictivas (temperatura baja) (ver Fig. 1. por ejemplo). Un conjunto de células se desplaza a la trata de condiciones permisivas (37 ° C) e internalizar las proteínas con biotina. El otro conjunto de células se mantienen a baja temperatura, como los controles para: 1) la proteína de la superficie total en el momento = 0, y 2) el control de extracción. Después de un corto período de interiorización, las células se desplazan de nuevo a baja temperatura para detener la internalización, y cualquier biotina superficie residual se elimina mediante el tratamiento de células con un agente reductor, que rompe la biotina disulfuro de acoplamiento. Proteínas con biotina que surgió de la superficie celular y se internaliza están protegidos de la etapa de extracción, y será la única proteínas con biotina que quedan. Después de la lisis celular, proteínas con biotina se encuentran aisladas por estreptavidina cromatografía de afinidad y la proteína de interés se detectaron por inmunotransferencia cuantitativa. Para determinar la tasa de endocitosis, la cantidad de proteína es internalizada en comparación con el control total de la superficie de la etiqueta en el tiempo = 0. Hemos utilizado con éxito este método para medir la tasa de internalización de la norepinefrina y la dopamina neuronal 1 transportistas 1-4. Protocolo detallado: Día 1: <ol><li> Células de la placa en 6 y placas de tal manera que se confluente ~ 80% en el Día 2. Por otra parte, si las células transfectadas se están utilizando, transfectar a una densidad tal que van a ser confluentes ~ 80% en el momento se mide la tasa de internalización. Si las células no están fuertemente adheridas, artículos de cultivo de tejidos deben ser tratados con un sustrato de adhesión celular (por ejemplo, poli-D-lisina) para evitar la pérdida de células durante las etapas de lavado extenso. </li><li> Para cada proteína está probando, 2 pozos de la placa en una placa para ser utilizado como la proteína de la superficie total (t = 0) y los controles de extracción. En una segunda placa, la placa de un bien para cada condición de internalización se está probando (es decir, la tasa basal endocítica vs tratadas con el medicamento). </li><li> Prepare las siguientes soluciones y almacenar en las temperaturas indicadas para su uso en el Día 2: <ul><li> PBS 2 +: tampón fosfato salino (pH 7,4) suplementado con 1,5 mM de MgCl 2, 0,2 mM CaCl 2, (4 ° C) </li><li> Biotinilación Quench Solución: 2 + PBS suplementado con 100 mM glicina, (4 ° C) </li><li> NT búfer: 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 0,2% BSA, 20 mM Tris, pH 8.6, (4 ° C) </li><li> RIPA buffer: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, SDS 0,1%, 1,0% Triton X 100, 1,0% de desoxicolato de sodio, (4 ° C) </li><li> Sulfo-NHS-SS-biotina acciones: Se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO) a 200 mg / ml, (-20 ° C) </li><li> Tris (2-carboxietil) Clorhidrato de fosfina (TCEP) Solución: 500 mm de H 2 O, (-20 ° C, cubierto de papel de aluminio para bloquear la luz) </li></ul></li></ol> Día 2: <ol><li> Prepare 2 + PBS suplementado con glucosa 0.18g/ml, el 0,2% de IgG / proteasa libre de albúmina de suero bovino (PBS 2 + / g / BSA). Pre-caliente esta solución a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Descongelar la solución madre sulfo-NHS-SS-biotina en la parte superior del banco para fundir el DMSO. Inmediatamente antes de su uso, preparar nuevas sulfo-NHS-SS-biotina solución (2,5 mg / ml en PBS enfriado con hielo 2 +, suficiente para 0,75 ml / pocillo). Vortex vigorosamente la solución para solubilizar el DMSO. Tenga en cuenta que el reactivo NHS-biotina se hidroliza fácilmente en solución acuosa. Por lo tanto, todas las soluciones deben prepararse inmediatamente antes de su uso. </li><li> Biotinilación: Coloque las placas en un baño de hielo en la cámara frigorífica y enjuague 3 x 2 ml con PBS enfriado con hielo 2 +. Asegúrese de que las placas son ligeramente inclinada para permitir el drenaje completo y la eliminación de la solución tampón. Añadir 0,75 ml / pocillo de la nueva sulfo-NHS-SS-biotina a cada pocillo. Incubar x 15 ', 4 ° C en el baño de hielo con agitación vigorosa. Después de la incubación, preparar otra nueva sulfo-NHS-SS-biotina solución. Reemplazar la antigua solución con la solución fresca e incubar x '15, 4 ° C. </li><li> Enfriamiento: Es fundamental que todos los que no reaccionan NHS-biotina moléculas se apaga, por lo que no va a reaccionar con las proteínas intracelulares y biotinylate vez que las células se lisan. Lavar las células 3 x 2 ml con una solución de enfriamiento y se incuba dos veces en 2 ml de solución de enfriamiento x 15 ", 4 ° C con agitación suave. </li><li> Internalización: Si los tratamientos de drogas están siendo probadas, añadir la concentración del fármaco apropiado para PBS 2 + / g / BSA. Mantenga el control de la placa a 4 ° C y llevar la placa de la internalización de la cámara frigorífica. Lavar 3 x 2 ml con pre-calentado PBS 2 + / g / BSA (+ / - drUGS) y dejar en las mismas soluciones (2 ml / pocillo). Rellene los pocillos vacíos con pre-calentado solución para asegurar una temperatura de toda la placa. Transferencia de las células a una incubadora a 37 ° C durante 10 '. Inmediatamente antes de la final de 37 ° C de incubación, preparar nuevas soluciones 50 mM en tampón TCEP NT que se utilizará para el paso extracción y almacenamiento en hielo. Prepare la cantidad suficiente para 1,0 ml / pocillo. </li><li> Stripping: Inmediatamente placa de transferencia (s) de baño de hielo y volver a la cámara frigorífica. Lavarse rápidamente las células con helada NT buffer, 3 x 2 ml para detener la endocitosis. También lave las tiras de control de los pozos de 3 x 2 ml con tampón NT. Añadir 1,0 ml de solución fresca despojar a cada pocillo. Incubar en hielo, 15, 4 ° C con agitación suave. Vuelva a colocar los pozos con solución removedora fresco e incubar otros 15 ", 4 ° C en hielo. </li><li> Lisis: Lave todos los pozos que fueron expuestos a la solución de extracción, 3 x 2 ml NT buffer. A continuación, lavar los pocillos (incluidos los controles en total) con 3 x 2 ml de PBS 2 +. Lisis en 300μl/well RIPA buffer (buffer de lisis o otros compatibles con la proteína de interés) que contienen inhibidores de la proteasa fresca (1,0 mM PMSF, 1,0 mg / ml leupeptina, aprotinina y pepstatina). Lyse agitando x 20 ", 4 ° C. Transferencia a los tubos de microcentrífuga y los restos celulares por centrifugación claro 18.000 xg, 10, 4 ° C. </li><li> Determinación de concentración de proteínas: Utilice un ensayo de la proteína compatible con sus condiciones de lisis (por ejemplo, ensayo de proteínas DC, Bio-Rad) para determinar la concentración de proteínas de los lisados ​​en comparación con un estándar de la curva de BSA. </li><li> Estreptavidina cromatografía de afinidad: los tubitos de microcentrífuga con cantidades equivalentes de proteína para cada muestra. Añadir tampón de lisis para llevar el volumen final de cada muestra de 200μl. Vortex la estreptavidina perlas de agarosa con fuerza para llevar a una suspensión uniforme. Utilizando una pipeta 200μl con la punta cortada, cuentas de pipeta en cada tubo. Recomendado 20μl beads/50 lisado mg. Incubar toda la noche, 4 ° C en un rotor de tubo. </li></ol> Día 3: <ol><li> Lavado de esferas: las muestras de centrífuga, 18.000 xg, 2 'para recoger perlas. Aspirar de lisado, teniendo cuidado de no acercarse a bolas de pellets con aspirador. Utilice una punta de pipeta de plástico en el extremo del aspirador para un mejor control. Añadir 0,75 ml de solución amortiguadora de lisis a cada tubo y agitar para lavar cuentas. Centrifugue las muestras, 18.000 xg, 2 'para recoger los granos y repetir la aspiración y lavado dos veces (tres lavados en total). Después del último lavado, aspirado, como gran parte de la memoria intermedia como sea posible sin perturbar el precipitado de cuentas. De inflexión de la trompa hacia el aspirador ayuda con este paso. </li><li> Elución de la muestra: Agregar 20-25μl 2x tampón de muestra Laemmli (reducir) a cada tubo. El agente reductor se unirá el enlace disulfuro NHS-SS-biotina, la liberación de las proteínas aisladas en la solución. La mayoría de las proteínas de membrana son muy vulnerables a la agregación cuando se hierve, y no debe ser calentado antes de ser cargados en geles de SDS-PAGE. Determinar la sensibilidad al calor de la proteína de interés antes de realizar estos experimentos. Si la proteína no puede tolerar el calor de ebullición /, se incuban en un rotor, 30 ', la temperatura ambiente antes de su análisis por SDS-PAGE. Esto es suficiente para romper los enlaces disulfuro y eluir las proteínas. </li><li> SDS-PAGE e inmunoblotting: proteínas separadas por SDS-PAGE. Para cada muestra, lo más fácil es ejecutar los ejemplos en el siguiente orden: la superficie total (tiempo = 0), la tira, la condición internalización # 1, Condición # 2, etc transferencia a la membrana de inmunotransferencia y borrar con el anticuerpo adecuado para su proteína de interés. La captura de bandas inmunorreactivas mediante un sistema de gel CCD de la cámara de documentación, con la certeza de que no hay píxeles saturados. Cuantificar la densidad de cada banda utilizando gel de análisis / densitometría software. </li></ol> Los resultados representativos: Un resultado inmunoblot representativo se muestra en la Figura 2A. La señal más fuerte es en el "total" de carril (T), que es la cantidad total de proteína de la superficie antes de la internalización. La "tira" de control (S), debe cerca de blanco, lo que demuestra que la banda era eficiente para el experimento. La eficiencia de banda se calcula mediante la comparación de la densidad de la "tira" de carril a la de la "total" de carril (por ejemplo, proteínas que se biotinilado en paralelo con la banda, pero no se calentó a 37 ° C, ni expuestos a la solución de extracción). La siguiente fórmula se utiliza: [1 - (tira / total)] * 100% Utilizando esta fórmula, la tira en la Figura 2 fue del 99,8% de eficiencia. Finalmente, podrás ver las bandas de menor intensidad que el total en el carril de la internalización (s) (I). En el ejemplo (Figura 2), las células tratadas fueron tratados con vehículo o con 1μM acetato de forbol miristato (PMA) en un 10 'tasas de internalización de la internalización y el transportador de dopamina se midieron en un 10' período de internalización inicial. La tasa se calcula como la internalizaciónsiguiente manera: internalizado / total * 100 Como se observa en la Figura 2B, el 10,4% de la superficie DAT interiorizado más de 10 'en los vehículos tratados con condiciones. PMA tratamiento aumentó las tasas de DAT internalización al 23,2% de la superficie total de DAT. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Las células ilustración protocolo. Biotina son a 4 ° C para marcar exclusivamente la población de la superficie, y se desplazan a 37 ° C para iniciar la internalización. Después de la internalización, las células se enfría rápidamente para detener los procesos de endocitosis y la biotina superficie residual es eliminado por el tratamiento de células con un agente reductor. Las proteínas sólo con biotina que permanecen son aquellos que surgieron desde la superficie en t = 0 y se internaliza, lo cual les protege del tratamiento de extracción. Proteínas con biotina se encuentran aisladas por cromatografía de afinidad por lotes con cuentas estreptavidina y la proteína de interés se detectaron por inmunotransferencia. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Activación de la PKC aumenta la tasa de DAT endocítica. Internalización de ensayo. PC12 células que expresan establemente DAT se biotina, 4 ° C como se describe en "protocolo detallado". Las células se calienta rápidamente a 37 ° C ± 1 M y se incubaron PMA "10, 37 ° C. Biotina residual fue despojado por la reducción, las células fueron lisadas y las proteínas con biotina se aislaron por cromatografía de afinidad estreptavidina. (A) inmunoblot Representante mostrando DAT superficie total en t = 0 (T), tira de control (S), e internalizado DAT (I) en las condiciones indicadas. (B) Las bandas fueron capturadas con una cámara CCD y se cuantifica con la cantidad de datos de software (Bio-Rad). Los datos se expresan como% total min DAT internalized/10. <img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Inmunoblot ejemplo que representa una mala banda de biotina. Internalización de ensayo. PC12 células que expresan establemente DAT se biotina, 4 ° C como se describe en "protocolo detallado". Las células se calienta rápidamente a 37 ° C y se incubaron '10, 37 ° C. Biotina residual fue despojado por la reducción, las células fueron lisadas y las proteínas con biotina se aislaron por cromatografía de afinidad estreptavidina. La inmunotransferencia muestra DAT superficie total en t = 0 (T), tira de control (S), e internalizado DAT (I). Nota de la banda visible en el carril de la tira de control, lo que indica la eficiencia de la tira pobres.

<ol><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+transporter+endocytic+determinants%3A+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li>
<li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li>
</ol>

Los problemas más comunes: El problema más común que surge en estos experimentos es la eficiencia tira pobres. La eficiencia de la tira es fundamental para poder interpretar los resultados. A menos que la tira fue muy eficiente, no es posible concluir que todas las proteínas con biotina en los carriles de interiorización, de hecho, interiorizado de la superficie. Tiras de la eficiencia ≥ 90% son óptimas, y descartamos cualquier resultado si la tira cae por debajo de este nivel. Un ejemplo de una banda de pobres s...

medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Las proteínas de la membrana plasmática son un grupo grande y diverso de proteínas formado por los receptores, canales iónicos, transportadores y bombas. Actividad de estas proteínas es responsable de una variedad de importantes eventos celulares, incluyendo la entrega de nutrientes, la excitabilidad celular, y las señales químicas. Muchas proteínas de la membrana plasmática se regula de forma dinámica por el tráfico endocítica, que modula la función de proteínas mediante la alteración de la expresión de proteínas de la superficie. Los mecanismos que facilitan la endocitosis de proteínas son complejos y no son totalmente entendido por muchas proteínas de la membrana. Con el fin de entender completamente los mecanismos que controlan el tráfico endocítica de una proteína, es fundamental que la tasa de endocitosis de la proteína s medirse con precisión. Para muchos receptores, mediciones directas de la tasa de endocitosis son con frecuencia logra utilizando la etiqueta ligandos del receptor. Sin embargo, para muchas clases de proteínas de la membrana, como los transportistas, las bombas y los canales de iones, no hay ligando conveniente que puede ser usado para medir la tasa de endocitosis. En el presente informe, se describe un método reversible biotinilación que empleamos para medir el transportador de dopamina (DAT) Tasa de endocítica. Este método proporciona un método directo para medir las tasas de internalización, y puede ser fácilmente empleados para los estudios de tráfico de proteínas de membrana de la mayoría.

Endocitosis regulado regula los niveles de expresión de la superficie celular de la mayoría de las proteínas de la membrana. Aquí se utilizan los reactivos reducible, la membrana impermeant biotinilación para medir la tasa de endocitosis del transportador de dopamina (DAT), una proteína de membrana politópica. El método facilita un método directo para medir la tasa de endocitosis de la mayoría de las proteínas de la membrana plasmática.

Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Las proteínas de la membrana plasmática constituyen un grupo amplio y diverso de proteínas compuesto por receptores, canales iónicos, transportadores y bombas. La actividad de estas proteínas...

Este protocolo proporciona un método general para medir la tasa endocítica de la mayoría de las proteínas de membrana plasmática mediante el uso de reactivos permeabilizantes de membrana reductibles. En este procedimiento, las proteínas de la superficie celular que contienen lisinas extracelulares o están marcadas covalentemente se etiquetan a cuatro grados Celsius con sulfo-NHS-SS-biotina, mostrada aquí en verde. A continuación, las células se calientan a 37 grados Celsius para permitir la endocitosis de las proteínas de superficie. Luego, las células se devuelven a cuatro grados Celsius para detener el tráfico de membrana y el biotín residual de la superficie se elimina utilizando un agente reductor que deja intacto el enlace disulfuro.Por lo tanto, las únicas proteínas biotiniladas que permanecen son aquellas que se originaron en la superficie celular, fueron internalizadas y quedaron protegidas del procedimiento de eliminación. Finalmente, las células se solubilizan y las proteínas biotiniladas se aíslan mediante cromatografía de afinidad con estreptavidina. Hola, soy Luke Gabriel del laboratorio de Heli Milk Ian en el Departamento de Psiquiatría de la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts.Hoy les mostraremos un procedimiento para medir tasas de endocitosis o internalización utilizando una técnica reversible de elución con biotina. Utilizamos este procedimiento para medir la tasa de internalización del transportador de dopamina. Así que comencemos.Un día antes del experimento, prepare las células y los sustratos para su uso al día siguiente. Los tipos celulares y los medios variarán, pero si las células experimentales no son fuertemente adherentes, utilice un sustrato adecuado de adhesión celular, como placas de cultivo tisular recubiertas con polilisina, en cada placa de seis pocillos. Etiquete un total de cuatro pocillos utilizando dos placas separadas.Para cada proteína analizada, se utilizarán dos pocillos en la placa de control para los controles de proteína superficial total y de eliminación. Prepare un pocillo en la placa experimental para cada condición de internalización que se vaya a analizar. Siembre una vez 10 a la seis células en dos mililitros de cultivo celular de manera que las células alcancen aproximadamente un 80 % de confluencia al día siguiente.Después de cultivar las células, prepare las siguientes soluciones y almacénelas a cuatro grados Celsius para su uso en el día dos. El PBS dos más se prepara a partir de solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4 y se suplementa con cloruro de magnesio 1,5 milimolar y cloruro de calcio 0,2 milimolar. La solución de detención de tonación se prepara usando PBS dos más suplementado con glicina 100 milimolar. El tampón NT se prepara con cloruro de sodio 150 milimolar, EDTA 1 milimolar, BSA 0,2% y tris 20 milimolar a un pH de 8,6. El tampón RIPA se prepara usando tris 10 milimolar a pH 7,4, cloruro de sodio 150 milimolar, EDTA 1 milimolar, SDS 0,1%, Triton X-101% y desoxicolato sódico 1%.A continuación, prepare una solución stock de biotina SULF N-H-S-S-S disolviéndola en SULFOXIDE o DMSO hasta una concentración de 200 miligramos por mililitro. Prepare alícuotas de 500 microlitros y almacénelas a menos 20 grados Celsius. Las alícuotas pueden someterse a varios ciclos de congelación y descongelación tras este tris.Se prepara una solución stock de clorhidrato de fosfina de ácido carboxi etílico o TCEP a una concentración de 500 milimolar, disuelta en 50 milimolar de tris, y se ajusta el pH a 7,4. Dado que el TCEP es altamente ácido, será necesario ajustar el pH de la solución a 7,4, cubrir el TCEP y envolverlo en papel de aluminio antes de almacenarlo a menos 20 grados Celsius. Al segundo día, prepare PBS dos más suplementado con 0,18 % de glucosa y 0,2 % de albúmina sérica bovina libre de proteasas o PBS dos más GBSA, y precaliente a 37 grados Celsius en un baño de agua.Descongele la solución stock de biotina SFO N-H-S-S-S a temperatura ambiente. Prepare una solución fresca de biotina con azufre N-H-S-S-S inmediatamente antes de su uso y vortexee vigorosamente para solubilizar el DMSO.Coloque ambas las placas sobre un baño de hielo en una sala fría y enjuague cada pocillo tres veces con dos mililitros de PBS frío con hielo dos más, manteniendo las placas en un ángulo ligero para lograr el drenaje completo del tampón. Tras el último lavado, añada 0,75 mililitros por pocillo de la solución fresca de sulfa N-H-S-S-S biotina a cada uno. Incube durante 15 minutos a cuatro grados Celsius sobre el baño de hielo con agitación vigorosa en un agitador orbital, justo antes del final de la incubación.Preparar otra solución fresca de biotina SUHO N-H-S-S-S y a los 15 minutos reemplazar la solución antigua con la solución fresca. Incubar durante 15 minutos adicionales a cuatro grados Celsius con agitación vigorosa en un agitador orbital. Después de la segunda incubación, lavar las células tres veces rápidamente con dos mililitros de solución de bloqueo para inactivar todas las moléculas de biotina NHS no reaccionadas. Luego, incubar en dos mililitros de solución de bloqueo durante 15 minutos.Sustituya por solución de bloqueo fresca a los 15 minutos e incube durante 15 minutos adicionales. Mantenga las placas a cuatro grados Celsius con agitación suave en un agitador orbital durante cada incubación, mientras que la placa de control permanece en la solución de bloqueo sobre la mesa de trabajo en la sala fría. Retire la placa experimental de la sala fría sobre el baño de hielo en este momento.Si se están probando tratamientos farmacológicos, añada las concentraciones adecuadas de fármaco al PBS precalentado con GBSA. En este caso, utilizamos como vehículo etanol o bien acetato de cuatro bolo mira a una concentración de un MICROMOLAR o PMA para activar la vía PKC. Lave cada pocillo de la placa experimental tres veces con dos mililitros de PBS precalentado con GBSA, añadiendo los tratamientos farmacológicos adecuados tras el último lavado.Añada dos mililitros de las soluciones correspondientes de PBS más GBSA y complete los pocillos vacíos con medio precalentado para asegurar una temperatura uniforme en toda la placa. Transfiera las células a un incubador a 37 grados Celsius durante 10 minutos inmediatamente antes del final de la incubación. Prepare una solución fresca de desnaturalización utilizando una solución de TCEP 50 milimolar en tampón NT y almacénela en hielo.Prepare una cantidad suficiente de un mililitro por pocillo. Tras la incubación de 10 minutos, transfiera rápidamente la placa experimental a un baño de hielo y regrese a la sala fría. Lave rápidamente los pocillos experimentales tres veces con dos mililitros por pocillo de tampón NT frío con hielo para detener la endocitosis.Luego, lave el pocillo de control de eliminación tres veces con dos mililitros de tampón NT frío con hielo. Deje los pocillos de control total en la solución de parada. Añada un mililitro de solución de eliminación a cada pocillo experimental y de control de eliminación e incube en hielo durante 15 minutos.Cuatro grados Celsius con agitación suave antes del final de la incubación. Nuevamente, prepare el mismo volumen de solución de eliminación fresca que antes. Después de 15 minutos, reemplace la solución de eliminación usada por solución fresca e incube otros 15 minutos a cuatro grados Celsius con agitación suave para lisar las células primero.Lave todas las pocilas expuestas a la solución de eliminación tres veces con dos mililitros de tampón NT. A continuación, lave todas las pocilas, incluidos los controles totales, tres veces con dos mililitros de PBS frío. Añada 300 microlitros de tampón RIPPA frío que contenga inhibidores de proteasas frescos a cada pocila y lise las células agitando durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.Transfiera el lisado a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y elimine los restos celulares mediante centrifugación durante 10 minutos a 18.000 ×g y 4 °C. Utilice un ensayo de proteínas compatible con sus condiciones de lisis, por ejemplo, el ensayo de proteínas BCA de Pierce, para determinar la concentración de proteína en el lisado en comparación con una curva patrón de albúmina sérica bovina. A continuación, prepare los lisados para strep y cromatografía de afinidad.Llene tubos microfuga de 1,5 mililitro con cantidades equivalentes de proteína de cada muestra. En este experimento, estamos aislando proteínas biotiniladas a partir de lisados celulares de 50 microgramos. Añada tampón RIPA que contenga inhibidores de proteasas hasta un volumen final de 200 microlitros para cada muestra.A continuación, agite en vórtex vigorosamente las perlas de estreptavidina y agarosa antes de usarlas. Utilice un pipeta de 200 microlitros con la punta recortada para transferir 20 microlitros de perlas de estreptavidina y agarosa a cada tubo. Agite los tubos en vórtex e incube toda la noche a cuatro grados Celsius en un rotador para tubos. Al día siguiente, recupere las perlas mediante centrifugación de las muestras a 18.000 ×g durante dos minutos a temperatura ambiente. Aspire el lisado teniendo cuidado de no acercar el aspirador al pellet de perlas. Añada 0,75 mililitros de tampón a temperatura ambiente.Añadir tampón de lavado a cada tubo y vortexiar a velocidad máxima para lavar las perlas. Centrifugar a 18.000 GS durante dos minutos a temperatura ambiente para recoger las perlas y repetir este ciclo de lavado, vortexiado y centrifugación dos veces más, para un total de tres lavados tras el lavado final.Aspire toda la mayor cantidad posible del tampón sin perturbar el pellet de perlas. A continuación, agregue de 20 a 25 microlitros de tampón reductor 2x a cada tubo. El agente reductor romperá el enlace disulfuro N-H-S-S-S de la biotina, liberando las proteínas aisladas en solución.Dado que la mayoría de las proteínas de membrana no toleran la ebullición, incubar los tubos en un rotador durante 30 minutos a temperatura ambiente tras la reducción y desnaturalización para separar las proteínas. Mediante una electroforesis SDS-PAGE estándar, transferir las proteínas a una membrana para inmunotransferencia e incubar con un anticuerpo apropiado. En este experimento, utilizamos un anticuerpo anti-DAT de rata de Chemicon número 3609 a una dilución de 1:2000, detectando las bandas inmunorreactivas mediante un sistema de documentación de geles con cámara CCD, asegurándose de que no haya píxeles saturados. En este experimento, utilizamos un sistema de imagen BioRad VersaDoc con software Quantity One para cuantificar la densidad de cada banda.Se muestra aquí un bloque inmuno representativo del procedimiento reversible sobre el transportador de dopamina. La señal más intensa corresponde a la cantidad total de proteína de superficie antes de la internalización, observada en la banda total o T. El control de elución o S debería ser idealmente cercano al blanco y mostrar una alta eficiencia de elución. La eficiencia de elución se calcula utilizando mediciones de densidad de banda en la siguiente fórmula.Esta tira en este experimento tuvo una eficiencia del 99,8%. Las tiras con eficiencia mayor o igual al 90% son óptimas y los resultados por debajo de este nivel deben descartarse. Este ejemplo de una tira de poro muestra una banda visible en la pista de la tira con una eficiencia del 34%. Aquí, las bandas de menor intensidad corresponden a las pistas de internalización procedentes de la placa experimental. Las células fueron tratadas con solución vehicular o con un micromolar de PMA durante una internalización de 10 minutos, y se midieron las tasas de internalización del transportador de dopamina.La tasa de internalización se calcula utilizando mediciones de densidad de banda de la siguiente manera, como se observa en esta gráfica: el 10,4 % del DAT de superficie se internalizó durante 10 minutos bajo condiciones tratadas con vehículo. Sin embargo, el tratamiento con PMA aumentó las tasas de internalización del DAT al 23,2 % del DAT total de superficie. Así que acaba de ver cómo medir las tasas de internalización de proteínas de la membrana plasmática utilizando una técnica de biotinilación reversible.Es importante recordar dos cosas: preparar fresca la reactiva de biotinación, así como el TCP, justo antes de usarlos. Si encuentra que está perdiendo muchas células durante el protocolo, utilice un sustrato de adhesión celular en sus placas. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con su experimento.

measuring-plasma-membrane-protein-endocytic-rates-reversible

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra un método para evaluar la internalización de proteínas diana en los astrocitos corticales de ratón utilizando biotinilación, seguida de lisis celular, extracción de proteínas basada en estreptavidina, desnaturalización y análisis de Western blot para confirmar la internalización exitosa.

Evaluación de la internalización de proteínas de superficie diana utilizando un derivado de la biotina

El tráfico de membrana implica el transporte de proteínas desde la membrana plasmática hasta el interior de la célula (es decir, endocitosis) seguido de un tráfico a los lisosomas para su degradación o a la membrana plasmática para su reciclaje. Los métodos descritos en este artículo están diseñados para estudiar la endocitosis y el reciclaje de las proteínas de la membrana plasmática.

Los ensayos de protección de L-glutatión basados en células para estudiar la endocitosis y el reciclaje de proteínas de la membrana plasmática

El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Los protocolos siguientes describen ensayos cinéticos de las interacciones proteína-proteína con Interferometría Bio-capa. F-tipo ATP sintasa, que está implicado en el metabolismo de la energía celular, puede ser inhibida por su subunidad ε en bacterias. Hemos adaptado Interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones del complejo catalítico con el dominio del ε inhibidora C-terminal.

Interferometría Bio-capa para Cinética de interacciones proteína-proteína y alostéricos Efectos ligando medición

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

En este informe se presentan dos métodos basados ​​en la biotinilación, diseñados para determinar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas expresadas en la membrana plasmática.

Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Este protocolo presenta un método para medir la unión de nucleótidos de adenina a los receptores en tiempo real en un entorno celular. La unión se mide como transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre derivados de nucleótidos de trinitrofenilo y proteínas marcadas con un aminoácido fluorescente no canónico.

Medición de la unión de nucleótidos a proteínas de membrana intactas y funcionales en tiempo real

La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

El protocolo presenta un método para la unión covalente in vivo de biotina a proteínas basado en su proximidad a una biotina ligasa fusionada con una proteína de interés. Esta modificación permite un enriquecimiento selectivo de las proteínas utilizando perlas de estreptavidina según sea necesario en los estudios de interacción de proteínas.

In vivo Biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia

Aprende a medir tasas endocíticas de proteínas de membrana plasmática mediante biotinilación reversible. Este método utiliza reactivos impermeables para aislar proteínas internalizadas y estudiar dinámica de membrana.

Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Explorar más videos