Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Este protocolo proporciona un método general para medir la tasa endocítica de la mayoría de las proteínas de membrana plasmática mediante el uso de reactivos permeabilizantes de membrana reductibles. En este procedimiento, las proteínas de la superficie celular que contienen lisinas extracelulares o están marcadas covalentemente se etiquetan a cuatro grados Celsius con sulfo-NHS-SS-biotina, mostrada aquí en verde. A continuación, las células se calientan a 37 grados Celsius para permitir la endocitosis de las proteínas de superficie. Luego, las células se devuelven a cuatro grados Celsius para detener el tráfico de membrana y el biotín residual de la superficie se elimina utilizando un agente reductor que deja intacto el enlace disulfuro.

Por lo tanto, las únicas proteínas biotiniladas que permanecen son aquellas que se originaron en la superficie celular, fueron internalizadas y quedaron protegidas del procedimiento de eliminación. Finalmente, las células se solubilizan y las proteínas biotiniladas se aíslan mediante cromatografía de afinidad con estreptavidina. Hola, soy Luke Gabriel del laboratorio de Heli Milk Ian en el Departamento de Psiquiatría de la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts.

Hoy les mostraremos un procedimiento para medir tasas de endocitosis o internalización utilizando una técnica reversible de elución con biotina. Utilizamos este procedimiento para medir la tasa de internalización del transportador de dopamina. Así que comencemos.

Un día antes del experimento, prepare las células y los sustratos para su uso al día siguiente. Los tipos celulares y los medios variarán, pero si las células experimentales no son fuertemente adherentes, utilice un sustrato adecuado de adhesión celular, como placas de cultivo tisular recubiertas con polilisina, en cada placa de seis pocillos. Etiquete un total de cuatro pocillos utilizando dos placas separadas.

Para cada proteína analizada, se utilizarán dos pocillos en la placa de control para los controles de proteína superficial total y de eliminación. Prepare un pocillo en la placa experimental para cada condición de internalización que se vaya a analizar. Siembre una vez 10 a la seis células en dos mililitros de cultivo celular de manera que las células alcancen aproximadamente un 80 % de confluencia al día siguiente.

Después de cultivar las células, prepare las siguientes soluciones y almacénelas a cuatro grados Celsius para su uso en el día dos. El PBS dos más se prepara a partir de solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4 y se suplementa con cloruro de magnesio 1,5 milimolar y cloruro de calcio 0,2 milimolar. La solución de detención de tonación se prepara usando PBS dos más suplementado con glicina 100 milimolar. El tampón NT se prepara con cloruro de sodio 150 milimolar, EDTA 1 milimolar, BSA 0,2% y tris 20 milimolar a un pH de 8,6. El tampón RIPA se prepara usando tris 10 milimolar a pH 7,4, cloruro de sodio 150 milimolar, EDTA 1 milimolar, SDS 0,1%, Triton X-101% y desoxicolato sódico 1%.

A continuación, prepare una solución stock de biotina SULF N-H-S-S-S disolviéndola en SULFOXIDE o DMSO hasta una concentración de 200 miligramos por mililitro. Prepare alícuotas de 500 microlitros y almacénelas a menos 20 grados Celsius. Las alícuotas pueden someterse a varios ciclos de congelación y descongelación tras este tris.

Se prepara una solución stock de clorhidrato de fosfina de ácido carboxi etílico o TCEP a una concentración de 500 milimolar, disuelta en 50 milimolar de tris, y se ajusta el pH a 7,4. Dado que el TCEP es altamente ácido, será necesario ajustar el pH de la solución a 7,4, cubrir el TCEP y envolverlo en papel de aluminio antes de almacenarlo a menos 20 grados Celsius. Al segundo día, prepare PBS dos más suplementado con 0,18 % de glucosa y 0,2 % de albúmina sérica bovina libre de proteasas o PBS dos más GBSA, y precaliente a 37 grados Celsius en un baño de agua.

Descongele la solución stock de biotina SFO N-H-S-S-S a temperatura ambiente. Prepare una solución fresca de biotina con azufre N-H-S-S-S inmediatamente antes de su uso y vortexee vigorosamente para solubilizar el DMSO.

Coloque ambas las placas sobre un baño de hielo en una sala fría y enjuague cada pocillo tres veces con dos mililitros de PBS frío con hielo dos más, manteniendo las placas en un ángulo ligero para lograr el drenaje completo del tampón. Tras el último lavado, añada 0,75 mililitros por pocillo de la solución fresca de sulfa N-H-S-S-S biotina a cada uno. Incube durante 15 minutos a cuatro grados Celsius sobre el baño de hielo con agitación vigorosa en un agitador orbital, justo antes del final de la incubación.

Preparar otra solución fresca de biotina SUHO N-H-S-S-S y a los 15 minutos reemplazar la solución antigua con la solución fresca. Incubar durante 15 minutos adicionales a cuatro grados Celsius con agitación vigorosa en un agitador orbital. Después de la segunda incubación, lavar las células tres veces rápidamente con dos mililitros de solución de bloqueo para inactivar todas las moléculas de biotina NHS no reaccionadas. Luego, incubar en dos mililitros de solución de bloqueo durante 15 minutos.

Sustituya por solución de bloqueo fresca a los 15 minutos e incube durante 15 minutos adicionales. Mantenga las placas a cuatro grados Celsius con agitación suave en un agitador orbital durante cada incubación, mientras que la placa de control permanece en la solución de bloqueo sobre la mesa de trabajo en la sala fría. Retire la placa experimental de la sala fría sobre el baño de hielo en este momento.

Si se están probando tratamientos farmacológicos, añada las concentraciones adecuadas de fármaco al PBS precalentado con GBSA. En este caso, utilizamos como vehículo etanol o bien acetato de cuatro bolo mira a una concentración de un MICROMOLAR o PMA para activar la vía PKC. Lave cada pocillo de la placa experimental tres veces con dos mililitros de PBS precalentado con GBSA, añadiendo los tratamientos farmacológicos adecuados tras el último lavado.

Añada dos mililitros de las soluciones correspondientes de PBS más GBSA y complete los pocillos vacíos con medio precalentado para asegurar una temperatura uniforme en toda la placa. Transfiera las células a un incubador a 37 grados Celsius durante 10 minutos inmediatamente antes del final de la incubación. Prepare una solución fresca de desnaturalización utilizando una solución de TCEP 50 milimolar en tampón NT y almacénela en hielo.

Prepare una cantidad suficiente de un mililitro por pocillo. Tras la incubación de 10 minutos, transfiera rápidamente la placa experimental a un baño de hielo y regrese a la sala fría. Lave rápidamente los pocillos experimentales tres veces con dos mililitros por pocillo de tampón NT frío con hielo para detener la endocitosis.

Luego, lave el pocillo de control de eliminación tres veces con dos mililitros de tampón NT frío con hielo. Deje los pocillos de control total en la solución de parada. Añada un mililitro de solución de eliminación a cada pocillo experimental y de control de eliminación e incube en hielo durante 15 minutos.

Cuatro grados Celsius con agitación suave antes del final de la incubación. Nuevamente, prepare el mismo volumen de solución de eliminación fresca que antes. Después de 15 minutos, reemplace la solución de eliminación usada por solución fresca e incube otros 15 minutos a cuatro grados Celsius con agitación suave para lisar las células primero.

Lave todas las pocilas expuestas a la solución de eliminación tres veces con dos mililitros de tampón NT. A continuación, lave todas las pocilas, incluidos los controles totales, tres veces con dos mililitros de PBS frío. Añada 300 microlitros de tampón RIPPA frío que contenga inhibidores de proteasas frescos a cada pocila y lise las células agitando durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.

Transfiera el lisado a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y elimine los restos celulares mediante centrifugación durante 10 minutos a 18.000 ×g y 4 °C. Utilice un ensayo de proteínas compatible con sus condiciones de lisis, por ejemplo, el ensayo de proteínas BCA de Pierce, para determinar la concentración de proteína en el lisado en comparación con una curva patrón de albúmina sérica bovina. A continuación, prepare los lisados para strep y cromatografía de afinidad.

Llene tubos microfuga de 1,5 mililitro con cantidades equivalentes de proteína de cada muestra. En este experimento, estamos aislando proteínas biotiniladas a partir de lisados celulares de 50 microgramos. Añada tampón RIPA que contenga inhibidores de proteasas hasta un volumen final de 200 microlitros para cada muestra.

A continuación, agite en vórtex vigorosamente las perlas de estreptavidina y agarosa antes de usarlas. Utilice un pipeta de 200 microlitros con la punta recortada para transferir 20 microlitros de perlas de estreptavidina y agarosa a cada tubo. Agite los tubos en vórtex e incube toda la noche a cuatro grados Celsius en un rotador para tubos. Al día siguiente, recupere las perlas mediante centrifugación de las muestras a 18.000 ×g durante dos minutos a temperatura ambiente. Aspire el lisado teniendo cuidado de no acercar el aspirador al pellet de perlas. Añada 0,75 mililitros de tampón a temperatura ambiente.

Añadir tampón de lavado a cada tubo y vortexiar a velocidad máxima para lavar las perlas. Centrifugar a 18.000 GS durante dos minutos a temperatura ambiente para recoger las perlas y repetir este ciclo de lavado, vortexiado y centrifugación dos veces más, para un total de tres lavados tras el lavado final.

Aspire toda la mayor cantidad posible del tampón sin perturbar el pellet de perlas. A continuación, agregue de 20 a 25 microlitros de tampón reductor 2x a cada tubo. El agente reductor romperá el enlace disulfuro N-H-S-S-S de la biotina, liberando las proteínas aisladas en solución.

Dado que la mayoría de las proteínas de membrana no toleran la ebullición, incubar los tubos en un rotador durante 30 minutos a temperatura ambiente tras la reducción y desnaturalización para separar las proteínas. Mediante una electroforesis SDS-PAGE estándar, transferir las proteínas a una membrana para inmunotransferencia e incubar con un anticuerpo apropiado. En este experimento, utilizamos un anticuerpo anti-DAT de rata de Chemicon número 3609 a una dilución de 1:2000, detectando las bandas inmunorreactivas mediante un sistema de documentación de geles con cámara CCD, asegurándose de que no haya píxeles saturados. En este experimento, utilizamos un sistema de imagen BioRad VersaDoc con software Quantity One para cuantificar la densidad de cada banda.

Se muestra aquí un bloque inmuno representativo del procedimiento reversible sobre el transportador de dopamina. La señal más intensa corresponde a la cantidad total de proteína de superficie antes de la internalización, observada en la banda total o T. El control de elución o S debería ser idealmente cercano al blanco y mostrar una alta eficiencia de elución. La eficiencia de elución se calcula utilizando mediciones de densidad de banda en la siguiente fórmula.

Esta tira en este experimento tuvo una eficiencia del 99,8%. Las tiras con eficiencia mayor o igual al 90% son óptimas y los resultados por debajo de este nivel deben descartarse. Este ejemplo de una tira de poro muestra una banda visible en la pista de la tira con una eficiencia del 34%. Aquí, las bandas de menor intensidad corresponden a las pistas de internalización procedentes de la placa experimental. Las células fueron tratadas con solución vehicular o con un micromolar de PMA durante una internalización de 10 minutos, y se midieron las tasas de internalización del transportador de dopamina.

La tasa de internalización se calcula utilizando mediciones de densidad de banda de la siguiente manera, como se observa en esta gráfica: el 10,4 % del DAT de superficie se internalizó durante 10 minutos bajo condiciones tratadas con vehículo. Sin embargo, el tratamiento con PMA aumentó las tasas de internalización del DAT al 23,2 % del DAT total de superficie. Así que acaba de ver cómo medir las tasas de internalización de proteínas de la membrana plasmática utilizando una técnica de biotinilación reversible.

Es importante recordar dos cosas: preparar fresca la reactiva de biotinación, así como el TCP, justo antes de usarlos. Si encuentra que está perdiendo muchas células durante el protocolo, utilice un sustrato de adhesión celular en sus placas. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con su experimento.