Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta

Este procedimiento se basa en plantas que expresan GFP en tipos celulares específicos, los cuales pueden aislarse del resto de las células vegetales mediante clasificación celular activada por fluorescencia o FACS. Este ejemplo utiliza dos líneas marcadoras que expresan en tipos celulares específicos de Arabidopsis. Las plántulas de raíz de Arabidopsis se cultivan en bandejas fito o en placas de agar.

Sus raíces se cosechan y tratan con enzimas digestivas de la pared celular. Después de una hora, la solución se filtra para eliminar los residuos grandes. Luego, la solución se centrifuga y se elimina el sobrenadante.

Los protoplastos positivos para GFP se separan posteriormente mediante fagocitosis. El material clasificado puede utilizarse para análisis específicos de tipo celular, como perfiles transcriptómicos a escala del genoma. Hola, soy Basian Barman del laboratorio de Ken Birnbaum en el Departamento de Biología de la Universidad de Nueva York.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la clasificación de protoplastos vegetales activada por fluorescencia. En este ejemplo, separaremos dos tipos celulares específicos en la raíz de Arabidopsis. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar perfiles transcriptómicos específicos de cada tipo celular.

Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, cultive plántulas de tipo silvestre así como plántulas que expresen GFP de manera específica en ciertos tipos celulares. El promotor de scarecrow que dirige la expresión de GFP marca la endodermis radicular y el centro de quiescencia en un grupo de plántulas.

Y en otro grupo, el centro de quiescencia radicular está marcado por el promotor walks five que dirige la expresión de GFP. Las plántulas se cultivan hidropónicamente en placas FIA sobre un filtro de nailon, lo que permite que las raíces crezcan a través del filtro hacia el medio de crecimiento. Alternativamente, las plantas pueden cultivarse sobre una malla de nailon y placas verticales de agar al 1%.

Además de ayudar en la recolección de las raíces, los filtros permiten transferir en masa las plántulas a nuevas bandejas fito o placas de agar donde se pueden suplementar con un catalizador de interés. Esto puede realizarse para estudiar las respuestas transcripcionales específicas de tipo celular frente a nutrientes, hormonas o tratamientos de estrés. Revise bajo el microscopio de fluorescencia para verificar que el marcador fluorescente se exprese según lo esperado.

Asegúrese de que el patrón de expresión del marcador sea consistente bajo las condiciones de tratamiento aplicadas, ya que puede cambiar como resultado del tratamiento. Proceda a recolectar y preparar los protoplastos. Comience por preparar la solución de protoplastos.

Combine 1,25% peso por volumen de celulasa, 0,3% peso por volumen de maser zyme, 0,4 molar de D-manitol, 20 milimolar de MES y 20 milimolar de KCl en agua desmineralizada y ajuste el pH a 5,7 con HCl de Tris 1 molar a pH 7,5. Esta solución será ligeramente turbia. Luego caliente la solución a 55 grados Celsius durante 10 minutos.

La solución se volverá transparente; déjela enfriar a temperatura ambiente y luego agregue BSA al 0,1 % peso por volumen, cloruro de calcio 10 milimolar y etanol beta-mercapto 5 milimolar. Recolecte plántulas de una semana de edad de una bandeja de fitotrón. En el caso de la línea GFP de scarecrow, o placas de ocho días con plántulas GFP de 5 días, raspe las raíces de la malla de nailon con un escalpelo y luego deposítelas en un recipiente con solución de protoplastos.

Utilice aproximadamente 10 mililitros de solución de protoplastos por cada 1500 plántulas. Agite suavemente los matraces a 75 RPM a temperatura ambiente durante una hora. Un tiempo de incubación más largo puede aumentar el rendimiento de protoplastos, pero también incrementará el efecto de los propios protoplastos sobre la expresión génica.

Ahora que los protoplastos han sido liberados, utilice un filtro celular de 40 micrómetros para filtrar la solución y divida el suspensión de protoplastos entre tubos cónicos de 15 ml. Es importante obtener una suspensión limpia de protoplastos sin demasiados residuos para evitar la obstrucción del equipo y minimizar el tiempo necesario para ordenar las células. Centrifugue los tubos en una centrífuga con rotor oscilante a 500 G durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Téngase en cuenta que la velocidad de centrifugación depende de la constitución de la sección vegetal que produce los protoplastos y de la cantidad de restos celulares generados durante el tratamiento enzimático. Después de la centrifugación, retire la mayor parte del sobrenadante y resuspenda suavemente el precipitado que contiene los protoplastos en un pequeño volumen de la solución de protoplastos remanente. Finalmente, cuente los protoplastos utilizando un hemocitómetro y determine su densidad para calcular el rendimiento y decidir los parámetros del experimento.

Después de contar, inspeccione los protoplastos. Verifique su integridad, el nivel de expresión de GFP y la presencia de restos celulares contaminantes. A continuación, proceda al fax.

Si no se continúa directamente con el fax. Los protoplastos pueden lavarse, resuspenderse y almacenarse en una solución de incubación, como la solución para protoplasmas sin enzimas añadidas o la solución W cinco. Encienda el clasificador celular y la computadora de la estación de trabajo.

Aquí utilizamos un fria fabricado por Becton Dixon and Company. Utilice un XPBS como fluido de envolvente y realice el procedimiento de arranque del sistema fluidico. Instale una boquilla de 100 micrómetros y establezca una presión de envolvente de 20 PSI.

Configure un flujo estable y calibre el retardo de la gota. Tenga en cuenta que la calibración no se muestra en este procedimiento. Se pueden ordenar con éxito suspensiones de protoplastos con una densidad tan alta como 10 millones de células por mil.

Para evitar la sedimentación de los protoplastos, utilice la opción de agitación de la muestra en el facts. Si existe el problema de obstrucción del facts, hay tres pasos posibles de disparo. Primero, realice un lavado inverso de la línea de muestra.

En segundo lugar, diluya la suspensión de protoplastos para reducir la densidad. En tercer lugar, purifique la solución de protoplastos repitiendo el paso de filtración tras la centrifugación y la resuspensión. Solo se utilizan cuatro parámetros para distinguir los protoplastos positivos para GFP de los protoplastos negativos para GFP y los restos celulares tras la excitación con un láser de 488 nanómetros: la dispersión hacia adelante es un indicador del tamaño de la partícula, y la dispersión lateral, un indicador de la granulosidad de la partícula.

Emisión a 530 nanómetros como medida de fluorescencia verde y emisión a 610 nanómetros como medida de autofluorescencia en el espectro rojo. Comience configurando un diagrama de puntos para dispersión hacia adelante versus dispersión lateral. Aplique el ajuste de voltaje para que los eventos medidos se centren en el gráfico.

Los PROTOPLASTOS positivos para GFP pueden distinguirse por su mayor relación de emisión verde a roja en comparación con los eventos con autofluorescencia. Configure únicamente un diagrama de dispersión con fluorescencia verde frente a autofluorescencia en el espectro rojo. Ajuste los valores de voltaje de manera que los eventos medidos den lugar a una única población diagonal en el gráfico.

Al observar una suspensión de protoplastos de tipo silvestre, los PROTOPLASTOS GFP positivos deben producir una población clara de eventos fluorescentes verdes que nunca se observan en muestras de tipo silvestre. Establezca restricciones de compensación para ajustar la superposición espectral entre la fluorescencia verde y la autofluorescencia en el espectro rojo. Utilizando una suspensión de PROTOPLASTOS GFP positivos, la configuración adecuada de las restricciones de compensación permitirá una mejor separación de los protoplastos GFP positivos respecto a los protoplastos GFP negativos y los restos celulares; cree una compuerta para identificar los eventos GFP positivos.

Es recomendable incluir PROTÓPLASTOS no GFP cada vez que prepare un experimento de clasificación para ayudar a definir los límites de la compuerta. Finalmente, establezca un umbral de corte de dispersión directa para excluir los restos pequeños del análisis. La visualización de eventos GFP positivos en el gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral ayudará a determinar dónde debe establecerse el umbral.

Los parámetros configurados en esta primera ejecución de hechos pueden reutilizarse para clasificaciones futuras. Serán necesarios ajustes menores para el uso diario de los hechos. Para la extracción de ARN, prepare tubos de recolección que contengan tampón de extracción de ARN; como guía, utilice un volumen de clasificación de hasta 100 microlitros en 350 microlitros de tampón de extracción.

20.000 eventos de clasificación producen un volumen total de clasificación de aproximadamente 100 microlitros. Ahora que los parámetros del fax y los modos de operación están configurados y los tubos de recolección están listos, comience a clasificar los protoplastos cuando finalice la clasificación. Mezcle los tubos de recolección de la muestra, ya que la suspensión celular puede acumularse en la parte superior; tan solo 500 eventos clasificados pueden utilizarse para el análisis de microarreglos tras la extracción de ARN y la amplificación de ADNc.

Aquí utilizamos el kit de microextracción RNEZ, el sistema de amplificación de ARN WT Ovation PICO y el módulo de biotina CD NA Fl Ovation V dos. A continuación se muestran resultados típicos de citometría de flujo para protoplastos derivados de plántulas no GFP Scarecrow, GFP y W 5G FP. Se presentan 100 000 eventos en cada diagrama de dispersión, con la fluorescencia verde en el eje X frente a la fluorescencia roja en el eje Y. Los eventos que caen dentro de la compuerta de clasificación GFP se resaltan en verde.

Este es un resumen del rendimiento típico de protoplastos obtenidos de plántulas que expresan ya sea GFP marcador de scarecrow, que etiqueta la endodermis radicular y el centro de reposo, o walks 5G FP, que marca el centro de reposo radicular. Hay menos células en el centro de reposo radicular en comparación con la endodermis radicular. Por lo tanto, a pesar de comenzar con más protoplastos, el rendimiento de células que expresan GFP es menor en la clasificación de walks 5G FP en comparación con la clasificación de scarecrow GFP. Aquí se muestran los resultados típicos de extracción de ARN de muestras triplicadas.

Cada muestra corresponde al ARN extraído de 10,000 eventos. El ARN extraído se analiza en un bioanalizador que muestra los picos ribosomales para las muestras de GFP de scarecrow en la parte superior y las muestras de walks 5G FP en la parte inferior. El ARN extraído puede utilizarse posteriormente para análisis de microarreglos. Este diagrama de dispersión de los niveles de expresión logarítmicos en base dos demuestra la similitud entre dos réplicas.

Acabamos de mostrarle cómo realizar la clasificación de protoplastos vegetales activada por fluorescencia para análisis específicos de tipo celular. Esta técnica es aplicable a muchos tejidos y especies vegetales diferentes. Rendimientos altos con bajo contenido de restos celulares y protoplastos sanos proporcionarán mejores resultados en análisis transcriptómicos y en otros análisis posteriores.

También recuerde que es importante mantener las condiciones de crecimiento del material vegetal idénticas para la comparación entre muestras ordenadas. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.