Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta

Un método para el aislamiento de determinados tipos de células a partir de material vegetal se demuestra. Esta técnica emplea las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes marcador en los tipos de célula en particular, la disociación y la fluorescencia celular selección de células activadas. Además, un crecimiento de configuración se ha establecido aquí que facilita el tratamiento de

Este procedimiento se basa en plantas que expresan GFP en tipos específicos de células, que luego se pueden aislar del resto de las células vegetales mediante clasificación celular activada por fluorescencia o hechos. En este ejemplo se utilizan dos líneas marcadoras que se expresan en tipos específicos de células de Arabidopsis. Las plántulas de raíz de Aliana se cultivan en bandejas fitogénicas o en placas de agar.

Sus raíces se cosechan y se tratan con enzimas que digieren la pared celular. Después de una hora, la solución se filtra para eliminar los residuos grandes. A continuación, se centrifuga la solución y se elimina el sobrenadante.

A continuación, los protoplastos positivos de GFP se separan por fax. El material clasificado se puede utilizar para el análisis específico del tipo de célula, como los perfiles transcripcionales de todo el genoma. Hola, soy Basian Barman del laboratorio de Ken Birnbaum en el Departamento de Biología de la Universidad de Nueva York.

Hoy le mostraremos un procedimiento para la clasificación celular activada por fluorescencia de protoplastos vegetales. En este ejemplo, clasificaremos dos tipos específicos de células en la ruta de Arabidopsis. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar perfiles transcripcionales específicos del tipo de célula.

Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, cultive plántulas de tipo silvestre, así como plántulas que tengan una expresión específica de GFP por tipo de célula. El promotor del espantapájaros que impulsa la GFP marca la raíz, la endodermis y el centro inactivo en un grupo de plántulas.

Y en otro grupo, el centro quiescente de la raíz está marcado por las caminatas cinco promotores que impulsan GFP. Las plántulas se cultivan hidropónicamente y las bandejas FIA se colocan encima de un filtro de nailon, lo que permite que las raíces crezcan a través del medio de crecimiento. Alternativamente, las plantas se pueden cultivar sobre una malla de nailon y placas de agar 1% colocadas verticalmente.

Además de ayudar en la cosecha de las raíces, los filtros permiten que las plántulas se transfieran en masa a nuevas bandejas de fitoterapia o placas de agar donde se pueden complementar con un catalizador de interés. Esto se puede hacer para estudiar las respuestas transcripcionales específicas del tipo de célula a los nutrientes, las hormonas o los tratamientos para el estrés. Verifique bajo el microscopio de fluorescencia para verificar que el marcador fluorescente se exprese como se espera.

Asegúrese de que el patrón de expresión del marcador sea consistente en las condiciones de tratamiento aplicadas, ya que puede cambiar como resultado del tratamiento. Proceder a la cosecha y preparación de los protoplastos. Comience por preparar la solución de protoplastos.

Combine 1.25%peso por volumen, celulasa, 0.3%peso por volumen, maser, zyme, 0.4 molar, D, manitol, 20 milimolar, MES y 20 milimolares KCL en agua desmineralizada y ajuste el pH a 5.7 con un molar tris HCL a pH 7.5. Esta solución será ligeramente turbia. Luego caliente la solución a 55 grados centígrados durante 10 minutos.

La solución se volverá transparente, se dejará enfriar a temperatura ambiente y luego se agregará cloruro de calcio BSA de 10 milimolares y cinco milimolares de etanol beta me capto de una semana de antigüedad de una bandeja de fito. En el caso del espantapájaros de la línea GFP u ocho platos de cuatro días de edad camina 5G FP plántulas. Raspe las raíces de la malla de nailon con un bisturí, luego deposítelas en un recipiente con una solución de protoplastos.

Use aproximadamente 10 mililitros de solución de protoplastos por cada 1500 plántulas. Agite los matraces suavemente a 75 RPM a temperatura ambiente durante una hora. Un tiempo de incubación más largo puede aumentar el rendimiento de los protoplastos, pero también aumentará el efecto de los propios protoplastos en la expresión génica.

Ahora que se liberan los protoplastos, use un colador de celdas de 40 micrómetros para filtrar la solución y divida la suspensión de protoplastos entre tubos cónicos de 15 milésimas de pulgada. Es importante generar una suspensión limpia de protoplastos sin demasiados residuos para evitar la obstrucción de los hechos y minimizar el tiempo necesario para clasificar las células. Centrifugar los tubos en una centrífuga de cubo oscilante a 500 G durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Tenga en cuenta que la velocidad de centrifugación depende de la constitución de la sección de la planta que produce los protoplastos y de la cantidad de restos celulares producidos durante el tratamiento enzimático. Después de la centrifugación, retire la mayor parte del sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet que contiene los protoplastos en el pequeño volumen de solución de protoplastos restante. Por último, cuente los protoplastos con un hemocímetro y determine su densidad para calcular el rendimiento y decidir sobre los parámetros de ejecución de los hechos.

Después de contar, inspeccione los protoplastos. Comprobar su integridad, el nivel de expresión de GFP y el contenido de residuos celulares contaminantes. A continuación, proceda al fax.

Si no se procede directamente al fax. Los protoplastos se pueden lavar, resuspender y almacenar en una solución de incubación, como la solución de protoplacción, sin las enzimas añadidas o la solución W five. Encienda el clasificador de celdas y la computadora de la estación de trabajo.

Aquí utilizamos una fria fabricada por Becton Dixon and Company. Utilice un XPBS como fluido de vaina y ejecute el procedimiento de arranque fluido. Instale una boquilla de 100 micrómetros y establezca una presión de funda de 20 PSI.

Configure un flujo de flujo estable y calibre el retardo de caída. Tenga en cuenta que la calibración no se muestra en este procedimiento. Las suspensiones de protoplastos con una densidad de hasta 10 millones de células por mil, se pueden clasificar con éxito.

Para evitar la sedimentación de los protoplastos, utilice la opción de agitación de la muestra en los hechos. Si la obstrucción de los hechos es un problema, hay tres posibles pasos de disparo. En primer lugar, realice un retrolavado de la línea de muestreo.

En segundo lugar, diluya la suspensión de protoplastos para reducir la densidad. En tercer lugar, limpie la solución de protoplastos repitiendo el paso de filtración después de la centrifugación y la suspensión de resus. Solo se utilizan cuatro parámetros para distinguir los protoplastos positivos de GFP de los protoplastos negativos de GFP y los desechos celulares después de la excitación por un láser de 488 nanómetros, la dispersión directa es un indicador del tamaño de partícula, la dispersión lateral como indicador de la granularidad de las partículas.

Emisión a 530 nanómetros como medida de fluorescencia verde y emisión a 610 nanómetros como medida de autofluorescencia de espectro rojo. Comience por configurar un diagrama de puntos para la dispersión hacia adelante frente a la dispersión lateral. Aplique el ajuste de voltaje para que los eventos medidos estén centrados en el gráfico.

Los PROTOPLASTOS positivos para GFP se pueden distinguir por su mayor proporción de emisión de verde a rojo en comparación con los eventos con autofluorescencia. Configure solo un diagrama de puntos con fluorescencia verde frente a autofluorescencia de espectro rojo. Aplique los ajustes de voltaje de tal manera que los eventos medidos den lugar a una sola población diagonal en el gráfico.

Cuando se observa una suspensión de protoplastos de tipo salvaje, los PROTOPLASTOS positivos para GFP deben producir una población clara de eventos fluorescentes verdes nunca vistos en muestras de tipo silvestre. Establezca restricciones de compensación para ajustar la superposición espectral entre la fluorescencia verde y la autofluorescencia del espectro rojo. Con una suspensión de PROTOPLASTOS positivos de GFP, la configuración adecuada de las restricciones de compensación permitirá una mejor separación de los protoplastos positivos de GFP de los protoplastos no GFP y los desechos configuran una puerta para identificar eventos positivos de GFP.

Es aconsejable llevar consigo PROTOPLASTOS no GFP cada vez que prepare un experimento de clasificación para ayudar a definir los límites de la puerta. Por último, establezca un límite de umbral de dispersión hacia adelante para dejar pequeños residuos fuera del análisis. La visualización de los eventos positivos de GFP en el diagrama de dispersión directa frente a dispersión lateral ayudará a determinar dónde se debe establecer el umbral.

Los parámetros configurados en esta ejecución de hechos inicial se pueden reutilizar para ordenaciones futuras. Se requerirán ligeros ajustes para el uso diario de los hechos. Para la extracción de ARN, prepare tubos de recolección que contengan tampón de extracción de ARN, como máximo, use un volumen de clasificación de 100 microlitros a un tampón de extracción de 350 microlitros como guía.

20.000 eventos de clasificación producen un volumen total de clasificación de aproximadamente 100 microlitros. Ahora que los parámetros de fax y los modos de funcionamiento están configurados y los tubos de recolección están listos, comience a clasificar los protoplastos cuando se complete la clasificación. Mezcle los tubos de recolección de muestras, ya que la suspensión celular puede acumularse en la parte superior, se pueden usar tan solo 500 eventos clasificados para el análisis de microarrays después de la extracción de ARN y la amplificación de CD NA.

Aquí utilizamos el kit de micro extracción RNEZ, el sistema de amplificación de ARN WT ovation PICO y el módulo de biotina CD NA fl ovation V two. A continuación, se muestran los resultados típicos de fax para protoplastos derivados de plántulas de espantapájaros no GFP, GFP y W 5G FP: se presentan 100.000 eventos en cada diagrama de puntos de fluorescencia verde en el eje x frente a fluorescencia roja. En el eje Y, los eventos que caen dentro de la puerta de clasificación GFP se resaltan en verde.

Este es un resumen del rendimiento típico de protoplastos de las plántulas, expresando ya sea GFP del espantapájaros que marca la endodermis de la raíz y el centro quiescente o caminatas 5G FP que marcan el centro quiescente de la raíz. Hay menos células en el centro quiescente de la raíz en comparación con la endodermis de la raíz. Por lo tanto, a pesar de comenzar con más protoplastos, el rendimiento de las células que expresan GFP es menor en el tipo 5G FP en comparación con el tipo GFP del espantapájaros que se muestra aquí son resultados típicos de extracción de ARN de muestras triplicadas.

Cada muestra corresponde al ARN extraído de 10.000 eventos. El ARN extraído se analiza en un bioanalizador que muestra los picos ribosómicos para las muestras de GFP del espantapájaros en la parte superior y las muestras 5G FP por debajo del ARN extraído se pueden utilizar posteriormente para el análisis de microarrays. Este diagrama de dispersión de dos niveles de expresión logarítmicos demuestra la similitud entre dos réplicas.

Acabamos de mostrarle cómo realizar la clasificación celular activada por fluorescencia de protoplastos vegetales para el análisis específico del tipo de célula. Esta técnica es aplicable a muchos tejidos y especies vegetales diferentes. Los buenos rendimientos con bajo contenido de residuos y protoplastos sanos proporcionarán mejores resultados posteriores en los análisis transcripcionales y de otro tipo.

También recuerde que es importante mantener las condiciones de crecimiento del material vegetal idénticas para la comparación entre muestras clasificadas. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.