Las sinapsis silenciosa presináptico estudiado con microscopía de luz
4 de enero de 2010
Sinapsis glutamatérgica puede cambiar de un modo activo a un modo silencioso. Se demuestra que el estado de actividad presináptica en la cultura disociada de las neuronas de roedores se visualiza mediante un formulario puede arreglar de la FM1-43 tintes para visualizar las sinapsis activas y inmunotinción con vGluT-1 anticuerpo para visualizar todas las sinapsis de glutamato.
Algunos terminales presinápticos en el sistema nervioso central parecen ser no funcionales o silenciosos. Aquí presentamos un protocolo para identificar terminales presinápticos silenciosos. Este protocolo puede aplicarse para identificar tratamientos y manipulaciones que se sospecha que silencian o activan terminales.
El protocolo combina la marcación con colorante vital de vesículas sinápticas durante la despolarización neuronal con la posterior marcación de células fijadas mediante un anticuerpo que etiqueta todos los terminales presinápticos, tanto silenciosos como activos. Las sinapsis marcadas con colorante y anticuerpo son activas. Las sinapsis marcadas únicamente con el anticuerpo son silenciosas.
Hola, soy Amanda Taylor del laboratorio del Dr. Steve Minick en el Departamento de Psiquiatría de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington. Soy Shahin, también del Laboratorio Manic. Hoy nos gustaría mostrarle el procedimiento para visualizar terminales presinápticos silenciosos utilizando neuronas del hipocampo en cultivo.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo la actividad eléctrica y otras vías de señalización independientes modulan la liberación de neurotransmisores. Comencemos. En una campana de flujo laminar estéril, utilice HIPA y compre ratas o ratones de día postnatal cero a tres para preparar cultivos celulares disociados.
Según nuestro protocolo publicado, nuestros cultivos son cultivos mixtos de células gliales derivados de las mismas células de disección que deben sembrarse en placas estériles de 35 milímetros. Cada una contiene un cubreobjetos número cero recubierto con cinco miligramos por mililitro de placa de colágeno. Las neuronas a una densidad aproximada de 500 células por centímetro cuadrado.
12 crías de rata normalmente producirán entre 30 y 35 placas de milímetro. Deje crecer los cultivos en una incubadora de cultivo durante 10 a 14 días. Para el desarrollo y maduración sinápticos, agregue el anti-mitótico a C para detener el crecimiento glial en el día in vitro cuatro.
Además, al quinto día in vitro, realice un cambio parcial del medio con medio neurobasal más suplemento B27 para mejorar la supervivencia neuronal durante este período de maduración. Introduzca tratamientos que modifiquen el número de sinapsis presinápticas silenciosas. Hemos encontrado que una forma conveniente de silenciar un alto porcentaje de sinapsis de glutamato es un tratamiento de cuatro horas con potasio 30 milimolar.
Cuando los cultivos estén maduros, las neuronas deben tener una densidad relativamente baja con prolongaciones neuríticas bien separadas y extensas. Retire los cultivos del incubador y llévelos al banco de trabajo. Reemplace el medio de cultivo con una solución salina tamponada que contenga 45 milimolares de cloruro de potasio y 10 micromoles de colorante FM 1 43 FX.
Esta solución también debe contener NBQX y A PV para prevenir la señalización recurrente. Es importante mantener la solución stock de FM 1 43 FX y los experimentos en la oscuridad para evitar el fotoblancamiento. Por lo tanto, cubra las placas de cultivo con papel de aluminio durante todos los pasos posteriores de incubación.
Incubar exactamente durante dos minutos a temperatura ambiente. Retire la solución de colorante y lave solo durante tres a cinco segundos en tampón salino con 500 micromolar de adversivo.Siete. Para eliminar el colorante no específico, el momento en este paso es crítico.
Como la exposición prolongada al adv adverse F7 eliminará toda la marcación con FM 43 FX. Luego, lave las células con tampón salino sin adv adverse. Siete intervalos de cinco minutos cada uno en una campana extractora de gases.
Fije los cultivos en paraformaldehído al 4% y glutaraldehído al 0,2% en PBS durante 10 minutos. Lave brevemente las células con PBS. Ahora las células pueden retirarse de la cabina de flujo laminar.
Añada solución de bloqueo que contenga 4% de suero normal de cabra y 0,04% de Triton X para reducir el fondo y permeabilizar las células para la inmunotinción. Incube durante 15 minutos. Tiña las células con el anticuerpo primario vlu T diluido a 1:2000 en la solución de bloqueo.
Incube las culturas con el anticuerpo con agitación suave durante tres horas. Lave las células cuatro veces con PBS. Incube las células con Alexa.
Anticuerpo secundario conjugado con 647 anti cerdo de Guinea diluido de uno a 500 en solución bloqueante. Incubar las culturas con el anticuerpo secundario con agitación suave durante 30 minutos. Lavar las células cuatro veces más con PBS.
Coloque una pequeña gota de la cantidad de cultivo en una lámina de vidrio limpia utilizando pinzas. Tome un cubreobjetos y bájelo suavemente sobre la gota, con las células del cultivo enfrentadas hacia la lámina. Deje que la preparación se seque durante la noche.
Prepare un objetivo de inmersión en aceite de 60 x en un microscopio confocal de barrido láser. Coloque un portaobjetos sobre la platina de manera que el cubreobjetos quede frente al objetivo. Localice un campo de neuritas que no sea excesivamente denso y que esté alejado del soma, el cual puede retener colorante residual.
Aumente el zoom hasta un tamaño de campo de 51 por 51 micrones. Utilizando software de adquisición de imágenes, adquiera una serie Z que cubra una profundidad de 7,8 micrones en 27 pasos de 0,3 micrones cada uno.
Escaneé primero con el anticuerpo VLU T uno para identificar todas las sinapsis glutamatérgicas en el campo. Luego, vuelva a escanear para detectar la fluorescencia de FM 1 43 FX y analizar las imágenes tras la adquisición. Utilice software de análisis para convertir la serie Z en una imagen compuesta de un solo plano basada en la lectura de intensidad máxima de cualquier plano en cada umbral establecido de píxeles.
Para reducir el fondo, identifique terminales VGluT1 sin hacer referencia a la tinción con el colorante FM 1-43. Y marque estos puntos como regiones de interés. Normalmente seleccionamos 10 PUNTOS por campo.
Repita el umbralizado y la selección de puntos en la imagen de efectos de FM 1-43 y superponga las imágenes para identificar sinapsis silenciosas. Puede utilizarse un criterio absoluto de píxeles o un criterio porcentual de píxeles para distinguir sinapsis activas positivas para FM 1-43 de sinapsis inactivas negativas para FM 1-43. En nuestras culturas, encontramos que del 70 al 80 % de las sinapsis glutamatérgicas definidas por la tinción de Vglut1 presentan tinción detectable de FM 1-43 en imágenes superpuestas de fluorescencia verde de FM 1-43 y tinción roja de Vglut1.
Esto es evidente por una abundancia de sinapsis puntuadas de color amarillo con marcadores co-localizados. Estas están indicadas por las flechas. Aproximadamente entre el 20 y el 30 % de las púntas positivas para Vglut1 rojas no presentarán fluorescencia verde de FM 1-43 por encima de la línea base.
Estos son los terminales presinápticos inactivos y un ejemplo se indica mediante la flecha. También se observará una tercera población de sinapsis. Estas son positivas para la fluorescencia verde de FM 1-43, pero carecen de tinción roja de B glut uno.
Estas son sinapsis GABAérgicas activas y un ejemplo se indica con el asterisco. Estas se excluyen de la mayoría de nuestros análisis, pero pueden estudiarse explícitamente utilizando un anticuerpo contra el transportador vesicular de GABA. En lugar del anticuerpo VLU T uno, acabamos de mostrarle cómo visualizar sinapsis silenciosas presinápticas utilizando FM 1-43 y la inmunotinción con VLU uno.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar que FM 1 43 FX es sensible tanto al tiempo en el lavado adver sub seven como a la concentración del X 100 tratante incluido en la solución bloqueadora. Eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para identificar terminales presinápticos silenciosos en el sistema nervioso central. Al combinar la marcación con colorantes vitales y la inmunotinción, los investigadores pueden distinguir entre sinapsis activas y silenciosas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Función sináptica
Antecedentes
- Algunos terminales presinápticos son no funcionales o silenciosos.
- Comprender la actividad sináptica es fundamental para la investigación en neurociencia.
- La identificación de terminales silenciosos puede ayudar en el estudio de diversos tratamientos.
- La visualización de la actividad sináptica puede proporcionar información sobre la comunicación neuronal.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para identificar terminales presinápticos silenciosos.
- Explorar los efectos de tratamientos sobre la actividad sináptica.
- Mejorar la comprensión de la dinámica sináptica en redes neuronales.
Métodos Utilizados
- Etiquetado con colorante vital de vesículas sinápticas durante la despolarización neuronal.
- Inmunomarcado con un anticuerpo que etiqueta todos los terminales presinápticos.
- Técnicas de codetección para diferenciar entre sinapsis activas y silenciosas.
- Uso del colorante FM1-43 para visualizar sinapsis activas.
Resultados principales
- Las sinapsis activas pueden visualizarse utilizando el colorante FM1-43.
- La inmunotinción revela todos los terminales presinápticos, incluidos los silenciosos.
- El protocolo distingue eficazmente entre sinapsis activas y silenciosas.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la plasticidad y la función sináptica.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado es una herramienta valiosa para la investigación en neurociencia.
- La identificación de terminales silenciosos puede orientar estrategias de tratamiento.
- Este método mejora la comprensión del comportamiento sináptico.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación de sinapsis silenciosas presinápticas permite la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas al revelar la heterogeneidad funcional en redes neuronales. Este método respalda la confianza predictiva en ensayos de cribado al distinguir sitios activos de liberación de glutamato de los inactivos. Informa la selección de carteras al vincular mecanismos de plasticidad sináptica con sistemas relevantes para la enfermedad en modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de estados de silenciamiento o activación presinápticos.
- Valor operativo: Permite la desaceleración biológica mediante la visualización directa de la competencia de liberación de vesículas.
- Valor predictivo: Apoya la confianza en el blanco al correlacionar la señalización de AMPc o el silenciamiento eléctrico con resultados funcionales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la evaluación de compuestos mediante la co-localización de las señales de FM1-43 FX y vGluT-1.
- Resultado cuantitativo: Permite la medición estandarizada del porcentaje de sinapsis activas mediante análisis de imágenes basado en umbrales.
- Reproducibilidad: Facilita la reutilización de la plataforma mediante protocolos estandarizados de fijación, tinción e imagen.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Conecta la plasticidad presináptica con las vías de aprendizaje y memoria dependientes del hipocampo.
- Continuidad traslacional: Une el descubrimiento con la validación preclínica mediante el seguimiento de la adaptación sináptica a tratamientos.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar/no continuar al cuantificar poblaciones de sinapsis silenciosas en condiciones basales y moduladas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar una lectura funcional de la actividad del terminal presináptico antes de la identificación del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre tratamientos que alteran el silenciamiento presináptico mediante despolarización por potasio o activación del AMPc.
- Selección: Proporciona una cuantificación reproducible y lista para ensayos de la competencia en la liberación de glutamato en cultivos disociados del hipocampo.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (por ejemplo, % de puntos FM1-43+/vGluT-1+) que permiten la comparación entre condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al modelar la adaptación sináptica relacionada con los mecanismos de los trastornos neuropsiquiátricos.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para seleccionar moduladores de la función presináptica en diversos modelos neuronales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la evaluación directa de la probabilidad de liberación de vesículas.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante protocolos de imagen en células fijadas y tinción conjunta.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de continuar o descartar proyectos al reducir la ambigüedad mecanicista en los efectos de fármacos sinápticos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en datos funcionales de modulación sináptica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo neuronal, microscopía confocal y análisis de imágenes de fluorescencia.
- Necesita instrumentación que incluya microscopio de barrido láser con objetivo de inmersión en aceite de 60x y capacidad de adquisición de cortes Z.
- Exige estandarización entre equipos en cuanto al tiempo de tinción, concentración del colorante y rigor de los lavados.
- Implica consideraciones de adaptación para sistemas neuronales no hipocampales o transportadores de vesículas alternativos.
- Incluye limitaciones prácticas, como la sensibilidad de FM1-43 FX a la duración del lavado con ácido ascórbico y a la composición de la solución bloqueante.
