Las sinapsis silenciosa presináptico estudiado con microscopía de luz

Algunas terminales presinápticas del sistema nervioso central parecen no funcionales o silenciosas. Aquí presentamos un protocolo para identificar terminales presinápticos silenciosos. Este protocolo se puede aplicar para identificar tratamientos y manipulaciones que se sospecha que silencian o despiertan terminales.

El protocolo combina el marcaje de colorantes vitales de las vesículas sinápticas durante la despolarización neuronal con el posterior marcaje de las células fijas con un anticuerpo que marca todas las terminales presinápticas, tanto silenciosas como activas. Synapsis. Los co marcados con tinte y anticuerpo son activos. Las sinapsis marcadas solo por anticuerpo son silenciosas.

Hola, soy Amanda Taylor del laboratorio del Dr. Steve Minick en el Departamento de Psiquiatría de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. También soy Shahin del Manic Lab. Hoy nos gustaría mostrar su procedimiento para visualizar terminales presinápticas silenciosas utilizando neuronas del hipocampo cultivadas.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo la actividad eléctrica y las otras vías nasales individuales modulan la liberación de neurotransmisores. Así que comencemos. En una campana de flujo laminar estéril, use HIPA no se puede comprar desde el día cero postnatal hasta tres ratas o ratones para preparar cultivos celulares disociados.

De acuerdo con nuestro protocolo publicado, nuestros cultivos son gliales mixtos. Los cultivos derivados de las mismas células de disección deben sembrarse en placas estériles de 35 milímetros. Cada uno contenía un cubreobjetos con el número cero que se recubría con cinco miligramos por mililitro de placa de colágeno. Las neuronas a una densidad aproximada de 500 células por centímetro cuadrado.

12 cachorros de rata suelen producir entre 30 y 35 antenas de 35 milímetros. Deje que los cultivos crezcan en una incubadora de cultivos durante 10 a 14 días. Para el desarrollo sináptico y la maduración, agregue el antimitótico a C para detener el crecimiento glial durante el día in vitro cuatro.

También en el día in vitro cinco, realizar un intercambio de medio medio con medio neuro basal más suplemento de B 27 para mejorar la supervivencia neuronal durante este período de maduración. Introducir tratamientos que alteren el número de sinapsis presinápticamente silentes. Encontramos que una forma conveniente de silenciar un gran porcentaje de sinapsis de glutamato es un tratamiento de cuatro horas con 30 milimolares de potasio.

Cuando los cultivos están maduros, las neuronas deben tener una densidad relativamente baja con procesos neuróticos bien separados y extensos. Retire los cultivos de la incubadora y llévelos al banco. Sustituya el medio de cultivo por una solución salina tamponada que contenga 45 milimolares de cloruro de potasio y 10 micromolares FM 1 43 FX troqueles.

Esta solución también debe contener NBQX y A PV para evitar la señalización recurrente. Es importante que la solución madre FM 1 43 FX y los experimentos se mantengan en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo. Por lo tanto, cubra las placas de cultivo con papel de aluminio para todos los pasos de incubación posteriores.

Incubar durante exactamente dos minutos a temperatura ambiente. Retire la solución de tinte y lave durante solo tres a cinco segundos en montones de solución salina tamponada con 500 micromolares adversivos. Siete. Para eliminar el tinte no específico, el tiempo en este paso es fundamental.

A medida que la exposición prolongada a adv F siete adverso eliminará todo el etiquetado FM 43 FX. A continuación, lavar las células y montones de solución salina tamponada sin adv adverso. Siete por cinco intervalos de dos minutos en una campana de gases químicos.

Fije los cultivos en 4% de paraldehído y 0,2% de glutaraldehído en PBS durante 10 minutos. Lave las celdas brevemente con PBS. Las celdas ahora se pueden mover fuera de la campana extractora.

Agregue una solución bloqueante que contenga 4% de suero de cabra normal y 0.04% de tritton X para reducir el fondo y permear las células para la tinción inmunológica. Incubar durante 15 minutos. Teñir las células con un anticuerpo vlu T uno diluido a uno a 2000 en solución de bloqueo.

Incubar los cultivos en anticuerpo con un balanceo suave durante tres horas. Lave las celdas cuatro veces con PBS. Incuba las células con Alexa.

6 47 anticuerpo anti cobaya conjugado diluido a uno a 500 en solución bloqueante. Mantenga los cultivos en el anticuerpo secundario con un balanceo suave durante 30 minutos. Lave las celdas cuatro veces más con PBS.

Coloque una pequeña gota de cantidad de piso en un portaobjetos de vidrio limpio con pinzas. Tome un cubreobjetos y bájelo suavemente sobre la caída de las celdas del piso que miran hacia el portaobjetos. Deje que el portaobjetos se seque durante la noche.

Prepare un objetivo de aceite de 60 x en un microscopio de escaneo láser confocal. Coloque una diapositiva en el escenario de modo que la cubierta quede orientada hacia el objetivo. Busque un campo de neuritas que no sea demasiado denso y que esté lejos del soma que pueda retener el tinte residual.

Acérquese a un tamaño de campo de 51 por 51 micras. Uso de software de adquisición de imágenes. Adquiera una pila ZS que cubra una profundidad de 7,8 micras en 27 pasos de 0,3 micras para cada paso.

Primero busque el anticuerpo VLU T one para identificar todas las sinapsis glutamatérgicas en el campo. A continuación, vuelva a buscar fluorescencia FM 1 43 FX para analizar las imágenes después de la adquisición. Utilice el software de análisis para convertir la tachuela Z en una imagen compuesta de un solo plano basada en la lectura de intensidad máxima de cualquier plano en cada umbral de conjunto de píxeles.

Para reducir el fondo, identifique los terminales VG glu T one sin referencia a la mancha de efectos FM 1 43. Y marque estos puntos como regiones de interés. Por lo general, seleccionamos 10 PUNTA por campo.

Repita el umbral y la selección de puntos en la imagen de efectos FM 1 43 y superponga las imágenes para identificar sinapsis silenciosas. Se puede utilizar un criterio de píxel absoluto o un criterio de píxel porcentual para distinguir las sinapsis FM 1 43 positivas activas de las sinapsis FM 1 43 negativas inactivas. En nuestros cultivos, encontramos que entre el 70 y el 80% de las sinapsis de glutamato definidas por V glut one staining exhiben una tinción detectable de FM 1 43 en imágenes superpuestas de fluorescencia verde de FM 1 43 y V roja con una tinción.

Esto es evidente como una abundancia de sinapsis de puntos amarillos con marcadores colocalizados. Estos se indican con las flechas. Aproximadamente entre el 20 y el 30% de la saturación de V roja en un punto positivo no logrará tener fluorescencia FM 1 43 verde por encima de la línea de base.

Estos son los terminales presinápticos inactivos y un ejemplo lo indica la punta de flecha. También se observará una tercera población de sinapsis. Estos son positivos para la fluorescencia verde FM 1 43, pero desprovistos de tinción de rojo B glut one.

Estas son sinapsis GABAérgicas activas y un ejemplo se indica con el asterisco. Estos se excluyen de la mayoría de nuestros análisis, pero se pueden estudiar explícitamente utilizando un anticuerpo transportador vesicular de GABA. En lugar del anticuerpo VLU T one, acabamos de mostrarle cómo visualizar sinapsis presinápticamente silenciosas utilizando FM 1 43 y VLU one inmunotinción.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que FM 1 43 FX es sensible tanto al tiempo en el lavado sub seven como a la concentración del tratamiento X 100 incluido en la solución de bloqueo. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.