La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

Este video muestra un protocolo para visualizar la replicación del ADN mediante microscopía óptica de campo amplio, lambda linealizada y modificada químicamente. El ADN está unido a un cubreobjetos de vidrio funcionalizado. El extremo libre del ADN se marca con perlas y el ADN se estira por flujo laminar.

Cuando se inicia la replicación, la hebra principal comienza a alargarse y la hebra rezagada se acorta debido al enrollamiento. La gran diferencia de longitud entre el ADN bicatenario y el monocatenario a bajas fuerzas permite una observación directa de las conversiones de ADN durante la replicación. La longitud de la construcción de ADN se monitorea mediante el seguimiento de la posición de la cuenta, lo que permite una determinación precisa de la velocidad y el proceso de replicación del ADN.

Hola, soy Ari Ulrich de los laboratorios de Anto One Vanian y Charles Richardson en el Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular de la Facultad de Medicina de Harvard. Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para obtener imágenes de la replicación del ADN a nivel de una sola molécula. Utilizamos este procedimiento en nuestros laboratorios para estudiar las actividades enzimáticas que tienen lugar durante la síntesis de ADN.

Así que comencemos al comienzo de este procedimiento. El ADN del fago Lambda de bacterias linealizadas es modificado por oligonucleótidos arrodillados para formar una horquilla de replicación, un brazo de horquilla complementario lambda, un brazo de horquilla biotinilado y un cebador de horquilla. El antebrazo de la horquilla biotinilada contiene una t de biotina unida a sus cinco extremos principales, lo que permite atar la plantilla de ADN a la superficie de la célula de flujo.

El ADN lambda se modifica aún más mediante el recocido, otro oligonucleótido que contiene un diggen y una fracción que sirven como una etiqueta inmunológica de alta afinidad para la fijación de una cuenta. Para generar la horquilla de replicación, se obtiene ADN lambda además de varios oligonucleótidos cuyas secuencias se pueden encontrar en el protocolo escrito que acompaña a este vídeo. Estos oligonucleótidos incluyen un brazo de horquilla biotinilado, un brazo de horquilla complementario lambda, un cebador de horquilla y un diggen y extremo complementario lambda fosforilan los cinco extremos principales del brazo de horquilla complementario lambda y el extremo digo genina complementario lambda que utiliza T cuatro polinucleótidos quinasa.

A continuación, mezcle el brazo de horquilla complementario lambda fosforilado, el brazo de horquilla biotinilado, el cebador de horquilla y el ADN lambda en la proporción molar de 10 a 10 a 100 a uno. En el tampón de ADN ligasa T four, caliente la mezcla a 65 grados centígrados durante cinco minutos y enfríe lentamente a temperatura ambiente apagando el bloque de calor para permitir el recocido adecuado de los oligonucleótidos y la ligasa de ADN T cuatro a la mezcla e incube durante dos horas. A temperatura ambiente, la T cuatro ADN ligasa catalizará el sellado de las muescas entre los oligonucleótidos y la lambda.

El ADN finalmente anil el lambda complementario diggen y termina en la plantilla de replicación del ADN agregando el diggen complementario lambda fosforilado y termina en tampón T cuatro ligasa, incuba la mezcla durante 30 minutos a 45 grados centígrados y nuevamente, enfría lentamente a temperatura ambiente apagando el bloque de calor, liga, el oxígeno de excavación complementario Lambda fosforilado y termina con la plantilla de replicación del ADN agregando T cuatro ADN ligasa a la mezcla y Incubar durante dos horas a temperatura ambiente. La plantilla final de replicación de ADN ya está lista para su uso. Con el fin de unir las perlas magnéticas activadas por la borla a la plantilla de replicación del ADN, deben funcionalizarse con un fragmento FAB específico para digo genina.

Para comenzar este proceso, vuelva a suspender la solución madre de perlas y transfiera 400 microlitros a un tubo de einor. Coloque el tubo en un separador magnético e incube hasta que la solución se aclare. A continuación, retire el sobrenadante pipeteando Para activar los grupos toal para el acoplamiento de anticuerpos, añada un mililitro de tampón boid y mezcle suavemente mediante pipeteo.

De nuevo, retire el sobrenadante con la ayuda de un separador magnético. A continuación, agregue 240 microlitros de fragmento de FAB y vuelva a suspender las perlas en 400 microlitros de tampón de borato. Mezcle bien y deje la incubación en un rotador durante 16 a 24 horas a 37 grados centígrados.

Después de la incubación, separe las perlas con el separador magnético y retire el sobrenadante. Lavar las perlas con un mililitro de tampón de lavado e incubar durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, retirar el tampón con el separador magnético. Este lavado se repite dos veces.

Para bloquear los grupos de tosil libres, agregue un mililitro de BSA que contenga tampón tris e incube durante cuatro horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire el tampón de las perlas con un separador magnético, lave dos veces con tampón y alícuota. Para su uso, el ADN que se va a replicar se adhiere a cubreobjetos de vidrio funcionalizados con Amil lane.

El grupo oxi del carril Amil se une al vidrio, dejando una amina disponible para unirse a las moléculas de clavija biotiniladas. Este recubrimiento ayuda a reducir la adherencia inespecífica a la superficie. Para limpiar a fondo los cubreobjetos de vidrio, colóquelos en frascos de tinte y llene los frascos con sonicato de etanol.

Durante 30 minutos, enjuague los frascos y llénelos con un molar de hidróxido de potasio sonicato durante 30 minutos y repita ambos lavados. Para la primera reacción de funcionalización, es necesario eliminar todos los rastros de agua. Llene los frascos de tinción con acetona y sonique durante 10 minutos.

Vacía los frascos y vuelve a llenarlos con acetona. Proceda a agregar el reactivo sinusoidal a los frascos y agite durante dos minutos. Luego apague con un gran exceso de agua.

A continuación, seque los cubreobjetos horneándolos a 110 grados centígrados en el horno durante 30 minutos. A continuación, prepare la mezcla de clavijas a aproximadamente 0,2%peso por volumen. La clavija biotinilada, que incluye un espaciador de cubreobjetos de vidrio, permitirá la separación de los cubreobjetos, pipetee 100 microlitros en un cubreobjetos secos y aislados.

Coloque un segundo cubreobjetos en la parte superior. Incubar los cubreobjetos en la solución de PEG durante tres horas. A continuación, separe cada par de cubreobjetos y lávelos abundantemente con agua.

Tenga cuidado de mantener los cubreobjetos funcionalizados con el lado hacia arriba, ya que solo un lado estará cubierto con una clavija. Finalmente, seque los cubreobjetos con aire comprimido y guárdelos al vacío En un desecado, las superficies permanecen estables durante al menos un mes. Por lo tanto, se pueden hacer docenas de cubreobjetos en un lote y usarlos según sea necesario.

Ahora que los cubreobjetos están listos, se puede ensamblar la cámara de flujo para el experimento de una sola molécula. El experimento de una sola molécula se realiza utilizando una cámara de flujo simple construida con un cubreobjetos funcionalizado, cinta adhesiva de doble cara, un portaobjetos de un cuarto de galón y tubos. Se prepara una cámara de flujo para cada experimento de molécula individual.

Comience mezclando cinco mililitros de tampón de bloqueo y 20 mililitros de tampón de trabajo y coloque la mezcla en un desecado para eliminar las burbujas de aire para los pasos posteriores. A continuación, extienda 100 microlitros de una solución de trabajo de strp din en PBS sobre la superficie de la clavija funcionalizada Cover slip incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir que strp din se una a la biotina de la superficie. Mientras tanto, corte un trozo de cinta adhesiva de doble cara para que coincida con el tamaño de la corredera de cuarzo y marque la posición de los orificios de los tubos en la cinta.

Delinea la cámara de flujo dibujando un canal central de tres milímetros de ancho y rectángulos que contengan ambos orificios. Las cámaras de flujo se pueden diseñar con dos canales de entrada y dos de salida. Ahora corte la cinta marcada a lo largo del contorno dibujado, haciendo cortes rectos y limpios para asegurarse de que no sobresalga ningún adhesivo en el canal.

Limpie a fondo el portaobjetos de cuarzo con acetona para eliminar el adhesivo de la construcción de la celda de flujo utilizado en experimentos anteriores. Encuentre la mejor alineación del contorno del canal. Retire un lado de la parte posterior adhesiva y coloque con cuidado la cinta en el tobogán de la cancha.

Tenga cuidado de alinear la cinta correctamente, ya que los orificios de entrada y salida deben permanecer desbloqueados. A continuación, prepare las longitudes de corte de la tubería de 0,76 milímetros de diámetro interior para la entrada y salida de la celda de flujo. Corte el extremo del tubo en un ángulo de aproximadamente 30 grados para que el tubo no presione contra el fondo de la cámara.

Suspenda el tubo en las gradillas de tubos de ensayo para facilitar la fijación a la celda de flujo en los siguientes pasos. A estas alturas, la incubación del cubreobjetos debería haber terminado. Enjuague la cubierta, deslícela abundantemente con agua y séquela con aire comprimido.

Tenga cuidado de no voltear el deslizamiento de la cubierta, ya que solo un lado está funcionalizado con una clavija. Complete el ensamblaje de la cámara de flujo quitando el otro lado del respaldo de la cinta y colocando la corredera de cuarzo en el cubreobjetos Presione ligeramente el cubreobjetos para expulsar el aire atrapado en el adhesivo. Esto ayudará a evitar que entren burbujas de aire en el canal de flujo.

Selle los lados de la cámara con epoxi. Inserte el tubo cortado en los agujeros del cuarzo y selle en su lugar con el epoxi. Dejar secar durante unos minutos.

Una vez seco, use una aguja de calibre 21 para tirar de algunos de los tampones de bloqueo de DGA a través de uno de los tubos para bloquear la superficie de la cámara. Enjuague varias veces para eliminar las burbujas de aire y permita que la cámara se incube durante al menos 30 minutos antes de pasar al experimento de replicación de una sola molécula. Una vez que se han preparado las perlas funcionalizadas de la plantilla de ADN y la cámara de flujo, se puede realizar un experimento con una sola molécula.

Para comenzar, coloque la celda de flujo en la platina del microscopio. Mantenga la cámara en su lugar con clips de etapa y asegúrese de que el canal de flujo esté alineado con la cámara CCD. Conéctelo a la bomba de jeringa y a los tubos de salida de la celda de flujo.

Usando un tubo conector de mayor diámetro, coloque los tubos de entrada de la celda de flujo en el tampón de bloqueo y tire hacia atrás de la jeringa para eliminar las burbujas de aire de los tubos, mueva suavemente los tubos de salida para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo. Una vez que se hayan eliminado todas las burbujas de aire, tape uno de los tubos de entrada con una aguja y selle uno de los tubos de salida doblándolo 180 grados y asegurándolo con cinta adhesiva Antes de agregar ADN a la célula, diluya la plantilla de ADN original a 10 picomolar en un mililitro de DGA un tampón de bloqueo x. Introduzca la plantilla en la cámara a un caudal moderado para permitir una buena cobertura superficial del ADN.

Diluya la solución de perlas de caldo entre dos y cuatro veces 10 de las sextas perlas por mililitro. En un mililitro de DGAs un tampón de bloqueo x. A continuación, vórtice la mezcla y sonique durante 20 segundos.

Haga fluir la solución de perlas diluidas en la cámara. Una vez que se agreguen las cuentas, cierre el flujo y permita que la cámara alcance el equilibrio. A continuación, cierre ambos tubos de salida.

Cualquier cambio en los tubos sin la cámara cerrada causará fluctuaciones de presión que ejercerán una fuerte fuerza sobre las cuentas y cortarán las moléculas de ADN atadas. Tape el tubo de entrada que se usó para cargar las cuentas con una aguja usando el segundo tubo de entrada. Comience a lavar la celda de flujo con una solución de DGA de lavado de tampón de bloqueo extensivo.

Agite la etapa dando golpecitos para eliminar las cuentas que no estén específicamente pegadas a la superficie para revisarla. Las cuentas están atadas al ADN. Intente cambiar la dirección del flujo.

Una vez que las perlas libres se hayan eliminado lo suficiente, cierre el flujo y permita que la cámara alcance el equilibrio. Prepare una mezcla de reacción fresca que contenga proteínas de replicación como se indica en el protocolo de texto. Cierre el tubo de salida abierto y cambie el depósito de entrada a la mezcla de reacción recién preparada.

Abrir lentamente la salida para evitar cambios bruscos de presión para proceder a la reacción enzimática. Primero, haga fluir la solución de proteína en la cámara a un ritmo moderado para permitir una unión eficiente al ADN. Cierre el flujo y permita que la cámara alcance el equilibrio.

Cierre los tubos de salida y reemplace el tubo que contiene la mezcla de reacción. Con el tubo que consta de tampón de lavado de DGA, lave la cámara para eliminar las proteínas libres después del lavado. Nuevamente, cierre el flujo y permita que la cámara alcance el equilibrio.

Cierre los tubos de salida y vuelva a colocar el tubo que contiene el tampón de lavado. Con el tubo que contiene el tampón de replicación T seven, el tampón de replicación T seven contiene cloruro de magnesio que desencadena el inicio de la reacción de replicación. Utilice un caudal de 0,012 mililitros por minuto que corresponda a una fuerza de arrastre de tres picos de Newin sobre las ataduras de ADN utilizando las condiciones descritas en este protocolo.

Coloque un imán permanente de tierras raras sobre la celda de flujo antes de obtener imágenes para evitar interacciones inespecíficas entre las perlas y la superficie. Coloque un iluminador de fibra en un ángulo de incidencia entre 10 grados y paralelo a la platina del microscopio cerca del campo de visión del microscopio con un objetivo de 10x y una cámara CCD. La iluminación de campo oscuro se utiliza para aumentar el contraste en el enfoque de la imagen de cuentas mediante una cuenta atada.

Comience la adquisición de datos durante 20 a 30 minutos a una velocidad de fotogramas lenta. En un experimento exitoso, se pueden observar 100 cuentas simultáneamente. El experimento debería arrojar numerosos rastros que muestren la síntesis de ADN de la hebra principal.

Con el fin de medir las tasas y el proceso de desenrollado y polimerización del ADN, se deben determinar las posiciones precisas de las perlas para lograr esto. Ajuste estas posiciones con funciones gaussianas bidimensionales. Visualice la trayectoria mediante el seguimiento de la posición del cordón en cada fotograma mediante un software de seguimiento.

A continuación, trace la posición de la cuenta en función del tiempo utilizando cualquier software gráfico para obtener datos de tasa. Ajuste las parcelas con una regresión lineal y calcule la pendiente para el procesual. Determine la longitud total del ADN desde el inicio hasta el final de un evento de acortamiento.

Combine todas las mediciones individuales y trace las distribuciones de tasa y productividad que se ajustan a los datos utilizando funciones gaussianas y exponenciales simples, respectivamente. Acabamos de mostrarte cómo medir las tasas y el proceso de replicación del ADN a nivel de una sola molécula. Al realizar este procedimiento, es importante asegurarse de que la fuerza y la certeza de las apuestas por el flujo de la lámina no afecten las actividades enzimáticas de las proteínas de replicación.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y diviértete con tus experimentos.