La toxina de inducción y extracción de proteínas a partir de Fusarium Spp. Los cultivos para los estudios proteómicos

En este vídeo se describe un procedimiento utilizado para inducir la sinesis de toxinas en algunas especies, en este caso y el protocolo de extracción de proteínas completas utilizado para los estudios proteómicos en nuestro laboratorio. La duración del procedimiento, 16 días, cuatro días para el crecimiento de hongos, 10 días para la sinesis de toxinas y dos días para la extracción de proteínas. Después de cuatro días, las colonias siguen creciendo activamente hacia el borde de la placa.

El micelio aéreo típico se forma y se recoge utilizando una cuchilla de esteroides debajo de la caja de flujo de la lámina rascando suavemente la superficie de la placa. El micelio se corta en cinco trozos pequeños y se añade a un matraz que contiene 25 mililitros de medios inductores de toxinas. La inducción de toxinas es más eficiente que el polvo oscuro.

El matraz está cubierto de aluminio. A continuación, los cultivos se agitan durante 10 días, a 150 rondas por minuto a 25 grados centígrados. El medio es de SAPH y contiene una solución de S row altamente concentrada.

Se sabe que la cama junto con la oscuridad facilita la sinesis de las toxinas en la ría. A continuación, el micelio se separa del líquido que contiene la toxina filtrándolo en el tejido cercano del infarto de miocardio. El líquido se puede utilizar para medir el contenido de toxinas, mientras que el micelio se utiliza para la extracción de proteínas.

Para evitar el arrastre de medios, mi techo se lava tres veces con agua estéril. El exceso de agua debe eliminarse Después, se agrega nitrógeno líquido, y las muestras se pueden almacenar a menos 80 o usarse para la extracción de proteínas. El procedimiento de extracción de proteínas se basa en el uso de SDS y TCA y consta de diferentes etapas de lisis.

Propondrá un método que abarque múltiples operadores para llevar a cabo. Al mismo tiempo que la extracción de réplicas biológicas, un operador diferente lleva a cabo cada réplica. Este procedimiento tiene en cuenta las diferencias en el procedimiento de extracción que pueden generar los diferentes operadores que procesan las réplicas.

Por lo tanto, debería mostrar una mayor robustez cuando se comparan las réplicas biológicas, ya que la variable del operador está incluida en la réplica. Al mismo tiempo, el uso de múltiples operadores reduce el tiempo de procesamiento. La muestra se muele en un mortero estéril con nitrógeno líquido hasta que el micelio se convierte en un polvo fino.

Este paso es crucial para la calidad y cantidad de proteínas. El micelio se recoge en tubos de teflón de 10 mili en una proporción de cuatro décimas partes del volumen total de los tubos. A continuación, se añade un tampón de lisis que contiene SDS y diferentes inhibidores de la proteasa.

A continuación, se agitan los tubos hasta obtener una solución homogénea. A continuación, las muestras se agitan durante 30 minutos en la cámara de códigos para homogeneizarse aún más, las muestras se hierven para disolver las paredes celulares y las proteínas hidrofóbicas. La presencia de SDS impide la formación de oligómeros que abortan la precipitación de proteínas.

Un paso de centrifugación separa tres fases. Las proteínas se suspenden en la solución transparente que se recoge en un nuevo tubo mantenido en hielo. A continuación, la paleta se utiliza para realizar un segundo paso, repitiendo el vórtice, la ebullición y la centrifugación.

Los snat de las dos lisis se combinan para realizar la precipitación con precipitación glacial, tampón que contiene tono ácido, ácido triácido y DTT. Luego, las muestras se almacenan durante la noche durante 16 horas a menos 20 grados centígrados para permitir la proteína. Las proteínas de precipitación están situadas en la parte inferior de los tubos para mejorar la precipitación.

Los tubos se centrifugan a alta velocidad durante 45 minutos. El paladar ya es bien visible. Los sobrenadantes se pueden desechar con una almohadilla de tubería de cinco mililitros.

A continuación, se elimina el TCA añadiendo 25 mililitros de tampón de lavado glacial que contiene acetona y DTT. A continuación, se agita completa y vigorosamente. A continuación, se realiza un nuevo paso de centrifugación.

El paladar proteico ahora está flotando, por lo que se debe prestar una tensión para eliminar el snat. Se realiza un segundo paso de lavado, añadiendo lavado, tampón, agitación y centrifugado. Se elimina el agente SUP y la muestra se seca con una bolsa rápida.

Cuando la muestra está seca, la proteína tiene una consistencia similar a la del polvo. Para almacenar. La proteína de la muestra debe recogerse del tubo para disminuir la interferencia electrostática del plástico.

Se utiliza una pistola electrostática y la proteína en polvo se recoge con una espátula metálica. A continuación, las proteínas se resuspenden directamente en el tampón de etiquetado. Se utiliza para 2D dash 30 minutos a 800 gramos por minuto.

Basta para solubilizar. La proteína antes de proceder al costoso etiquetado en 2D. La calidad de la proteína se prueba en el gel de una dimensión de la página SDS como se puede ver.

La ausencia de manchas significativas en el borde de un carril sugiere una buena calidad de la muestra.