Name: PuraMatrix encapsulación de las células cancerosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprende a encapsular células de cáncer de ovario CAR5 en PuraMatrix, un hidrogel de péptidos autoensamblables. Este método 3D replica mejor el entorno in vivo para estudiar respuestas al tratamiento.

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Notas técnicas: <ul><li> Gelificación se inicia por la adición de sales. Por lo tanto, es fundamental que no sales de entrar en contacto con PuraMatrix hasta la gelificación se desea, la exposición a las sales de la fuerza iónica muy baja (por ejemplo, &lt;0,05 M) causará gelificación irreversible. </li><li> Soluciones sobrantes de acciones que se prepara puede ser utilizado en una fecha posterior siempre que no hayan estado en contacto con las sales. Usted no necesita preocuparse por sonicación repetir. </li><li> Las burbujas de aire se puede quitar PuraMatrix alícuotas en tubos estériles, seguido por centrifugación. </li><li> Tenga mucho cuidado durante los cambios de los medios de comunicación como la aspiración puede alterar la cama PuraMatrix. </li></ul> Materiales: BD PuraMatrix péptido RAD16 hidrogel-1% (Cat # 354 250): La concentración de péptido total de la mezcla no diluida es de 10 mg / ml. <ul><li> Agua baño de ultrasonido o Vortex </li><li> 96 y placa de cultivo celular </li><li> Medios de cultivo celular </li><li> Estéril filtrado H 2 O </li><li> Filtrado estéril de sacarosa al 20% </li><li> Las células (todas menos 5.000 células / pocillo): OVCAR-5 </li></ul> Todos los pasos se deben realizar en condiciones asépticas. Procedimiento: <ol><li> Sonicar la PuraMatrix 1% (RAD16) en un baño de ultrasonido agua durante 30 minutos para reducir la viscosidad antes de su uso. </li><li> La solución PuraMatrix 1% ahora se puede alícuotas en tubos estériles para simplificar los experimentos futuros. <ol class="lalpha"><li> Evitar la formación de burbujas de aire, si se forman sólo hacen girar por los tubos estériles que contengan PuraMatrix a 1000 rpm (300 xg) durante 5 minutos. </li><li> La concentración de péptido total de la mezcla no diluida es de 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Dos grupos de cuatro pozos se sembraron a 2,5 mg / ml y 1,25 mg / ml de concentración de péptido total, respectivamente. </li><li> Diluir la PuraMatrix en cada pocillo conjunto con 0,2 micras estéril sacarosa filtrado del 20% y el 13,3% de sacarosa con el total de concentraciones de péptido de 5 mg / ml y 2,5 mg / ml, respectivamente, para alcanzar una concentración de 2x BD PuraMatrix en 10% de sacarosa. <ol class="lalpha"><li> Hacer 20% de sacarosa, diluir 10 g de sacarosa, entonces el volumen de 50 ml de agua. </li><li> 13% y 10% de sacarosa se puede preparar por dilución de la solución de reserva del 20%. <ol class="lroman"><li> 13% de sacarosa (por cada 10 ml): 6,5 ml de sacarosa al 20% + 3,5 ml estéril H 2 O. </li><li> 10% de sacarosa (por cada 10 ml): 5,0 ml de sacarosa al 20% + 5.0 ml estéril H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> Prepare una mezcla maestra de péptido PuraMatrix basado en el número de pozos tiene la intención de la placa. (Véase el siguiente ejemplo.) Luego alícuotas en tubos individuales que contienen 25 ml de la mezcla maestra. <ol class="lalpha"><li> La mezcla maestra debe estar preparado el doble de la concentración final deseada de péptido total, ya que se diluye con un volumen igual de células durante el recubrimiento. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figura 1"></li></ol></li><li> Preparar las suspensiones de células de cultivos celulares de células trypsinizing monocapa. <ol class="lalpha"><li> 2 ml de 0,05% de tripsina EDTA se puede utilizar para cada frasco T-75. </li></ol></li><li> Neutralizar la tripsina mediante la adición de medios de cultivo celular que contiene 10% inactivado por calor suero fetal bovino (uso de al menos 2 ml de los medios de comunicación por ml de tripsina utilizada en el paso anterior.) </li><li> Centrifugar las células a 1000 rpm (~ 300 xg) durante 5 minutos para crear un sedimento celular. <ol><li> Resuspender las células en estéril de sacarosa al 10% se filtra. </li><li> Contar las células y girar de nuevo a 1000 rpm (~ 300 xg) durante 5 minutos para eliminar pequeñas cantidades de sal en los medios de comunicación. </li></ol></li><li> Resuspender las células OVCAR-5 en el 10% de sacarosa en 2,0 x 10 5 células / ml por lo que el número final de células por pozo será de 5.000 células en cada pocillo. Los siguientes pasos deben llevarse a cabo rápidamente. </li><li> Añadir 25 l de la x 2.0 10 5 células / ml de suspensión en el primer tubo individuales con 25 l de la mezcla maestra de PuraMatrix como se muestra en el esquema de arriba. <ol class="lalpha"><li> Rápidamente la mezcla con la pipeta (~ 5 veces arriba y abajo) en el tubo sin introducir burbujas de aire. </li><li> A continuación, una pipeta de 50 l de suspensión celular / PuraMatrix mezcla en el pozo apropiado de un plato de 96 pozos. </li><li> Iniciar la gelificación de la PuraMatrix BD pipeteando suavemente 150 medios de comunicación l cultivo de células (RPMI + 10% FBS) al lado del pozo <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figura 2"></li></ol></li><li> Repita los pasos descritos en el 8 hasta que todos los pozos se han plateado. </li><li> Después de 30 minutos muy suavemente quitar ~ 2 / 3 de los medios de comunicación con una pipeta 200 l para equilibrar el pH del hidrogel. <ol class="lalpha"><li> NO USE una aspiradora, ya que esto INTERRUMPIR LA MATRIZ </li><li> Coloque la punta de la pipeta en el pozo para que no toque la cama PuraMatrix y retire con cuidado los medios de comunicación desde el pozo. </li><li> Se debe tener cuidado para no alterar la matriz durante el cultivo de células en PuraMatrix. </li></ol></li><li> Muy suavemente añadir 150 l de nuevo medio de cultivo celular al lado de las células y que contiene encapsulado en PuraMatrix. </li><li> Cambiar el medio de cultivo celular en cada pocillo cada 48 horas con medio de cultivo fresco con cuidado de repetir los pasos 10 y 11. </li></ol> Los resultados representativos: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figura 1"></a> Figura 1. OVCAR-5 células fueron encapsulados como se describe en el protocolo anterior. Las imágenes fueron adquiridas con un invertido Olympus FV1000 microscopio equipado con Spectra-Physics DeepSee Ti: Sapphire láser sintonizado a 750 nm. Sesiones de formación de imágenes se llevaron a cabo los días 1, 3, 5 y 7 días después de galvanoplastia. A larga distancia de trabajo, el agua mojando objetivo de 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) fue utilizado para la imagen a través de la PuraMatrix. Volúmenes tridimensionales fueron recogidos por la adquisición de las pilas de la imagen en 1,47 micras pasos axial. Dos no descanned detectores de recogida de la emisión de la autofluorescencia de violeta (440 hasta 490 nm) y verde (510-550 nm) filtros de paso de banda. Las imágenes finales y películas profundidad de la pila se procesaron con ImageJ mediante la combinación de los dos canales de detección.

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
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puramatrix encapsulación de las células cancerosas

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Evidencia creciente sugiere que las células del cáncer de cultivo en tres dimensiones con mayor precisión recapitula la complejidad de la biología del tumor. Muchos de estos modelos utilizan la membrana basal reconstituida procede de animales que contienen una cantidad variable de factores de crecimiento y citoquinas que pueden influir en el crecimiento de estos modelos de cultivo celular. A continuación, describimos en detalle la preparación y el uso de PuraMatrix, un auto disponible en el mercado montaje de gel de péptido que carece de origen animal y material de los agentes patógenos para encapsular y propagar el cáncer de ovario línea celular, OVCAR-5. Comenzaremos por describir la forma de preparar el PuraMatrix antes de su uso. A continuación, se demuestra cómo mezclar la PuraMatrix y la suspensión celular para encapsular las células en el hidrogel. Tras la adición de medios de cultivo celular o inyección en un entorno fisiológico, el componente de péptidos de PuraMatrix rápidamente sí se constituye en un hidrogel en 3D que muestra a escala nanométrica estructura fibrosa con un tamaño de poro promedio de 500 a 200 nm<sup&gt; 1</sup&gt;. Además, se demuestra cómo propagar cultivos crecidos en PuraMatrix encapsulado. Cuando se encapsula en PuraMatrix, OVCAR-5 células se ensamblan en tres dimensiones las estructuras acinares que se asemejan más a la morfología de los nódulos micrometástasis observado en la clínica de monocapa en modelos in vitro. Mediante microscopía confocal que ilustran la aparición del representante OVCAR-5 células encapsuladas en PuraMatrix el día 1, 3, 5, y 7 placas mensaje. El uso de PuraMatrix a las células cancerosas cultura a mejorar nuestra comprensión de la enfermedad y nos permitirá evaluar la respuesta al tratamiento en los sistemas modelo más predictivo clínicamente.

Este video muestra la forma de encapsular las células de cáncer en la cultura PuraMatrix, un auto disponible en el mercado montaje de gel de péptido.

PuraMatrix encapsulación de las células cancerosas

Cada vez hay más pruebas que sugieren que el cultivo de células cancerígenas en tres dimensiones recapitula con mayor precisión la complejidad de la biología tumoral. Muchas de estas...

Los modelos de cultivo celular en monocapa han sido herramientas muy útiles para estudiar diversas enfermedades, incluido el cáncer. Sin embargo, estos modelos no logran reproducir el entorno tridimensional observado in vivo. Este video demostrará el uso de Matrixx puro, un gel peptíd游戏副本La suspensión celular se mezcla con la Matrixx pura y el cultivo celular. Se añade medio para iniciar la activación de la Matrixx pura cuando está encapsulada y cultivada en Matrixx pura, las células Carv cinco se ensamblan en estructuras tridimensionales de tipo ASIN R que asemejan la morfología de nódulos micrometastásicos. Hola, soy Adnan Abbi.Soy investigadora asociada en el laboratorio del Dr. TBA Hassan en el Centro de la Mujer para Medicina Fotónica del Hospital General de Massachusetts. Hoy les mostraremos un protocolo para encapsular y cultivar una línea celular de cáncer de ovario en una matriz sintética llamada matriz pura. Utilizamos este modelo para evaluar la respuesta al tratamiento del cáncer de ovario en nuestro laboratorio.Entonces, comencemos. El hidrogel de péptido RAD 16 en matriz BD 1% pura tiene una concentración total de péptido de 10 miligramos por mililitro antes de su uso. Reduzca la viscosidad de la matriz pura sometiéndola a un baño de agua y sonicándola durante 30 minutos; tras la sonicación, mantenga las condiciones estériles.Aliquote la solución de matriz pura al 1% en tubos estériles. Para simplificar experimentos futuros, evite la formación de burbujas de aire; si se forman, centrifugue simplemente los tubos estériles que contienen la matriz pura a 1000 RPM durante cinco minutos. En esta demostración, sembraremos dos conjuntos de cuatro pocillos a 2,5 miligramos por mililitro y 1,25 miligramos por mililitro, respectivamente, de concentración total de péptido. Prepare dos mezclas maestras de péptido de matriz pura según el número de pocillos que vaya a sembrar, que en este caso es ocho.Cada mezcla maestra debe prepararse al doble de la concentración final deseada de péptido total, ya que se diluirá con un volumen igual de células durante la siembra. Para preparar las mezclas maestras, diluya la matriz pura con sacarosa estéril al 10% y sacarosa al 13,3% hasta alcanzar concentraciones totales de péptido de cinco miligramos por mililitro y 2,5 miligramos por mililitro, respectivamente, para obtener una concentración 2x de matriz pura en sacarosa al 10%. Luego, alícuota 25 microlitros de las mezclas maestras en ocho tubos individuales. Las mezclas maestras de matriz pura ya están listas para encapsular células. En este experimento, se encapsulará y propagará la línea celular de cáncer de ovario CAR cinco; antes de la incubación con tripsina, incube las células con 10 mililitros de PBS estéril sin calcio ni magnesio durante 15 a 20 minutos.Aspire el PBS y la tripsina de un cultivo celular de monocapa, neutralice la tripsina añadiendo medio de cultivo celular que contenga 10% de suero bovino fetal inactivado por calor. Utilice al menos dos mililitros de medio por cada mililitro de tripsina usado en el paso anterior. A continuación, transfiera las células a tubos de centrífuga y centrifugue las células a 1000 RPM durante cinco minutos para formar un pellet celular.Después de la centrifugación, suspenda el botón celular en sacarosa estéril al 10%. Cuente las células y centrifugue nuevamente a 1000 RPM durante cinco minutos. Para eliminar cantidades traza de sal presentes en el medio, vuelva a suspender las células O car cinco en sacarosa al 10% a una concentración de dos veces 10 a la quinta células por mililitro, de modo que la concentración final de células por pozo sea de 5.000 células en cada pozo.Las células ya están listas para la encapsulación en la matriz pura Matrixx. Los siguientes pasos para encapsular las células en la matriz pura deben realizarse rápidamente: añada 25 microlitros de la suspensión celular previamente preparada al primer tubo individual que contiene 25 microlitros de la mezcla maestra de Matrixx pura. Mezcle rápidamente pipeteando aproximadamente cinco veces hacia arriba y hacia abajo en el tubo, sin introducir burbujas de aire.Luego, pipetee la mezcla de 50 microlitros de suspensión celular y Matrixx puro en el pocillo correspondiente de una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Inicie la activación del Matrixx puro BD agregando suavemente 150 microlitros de medio de cultivo celular al costado del pocillo. Repita los pasos para la encapsulación de las células en los pocillos restantes.Recuerde que estos pasos deben realizarse rápidamente y que todo el procedimiento de encapsulación debe completarse en un pocillo antes de pasar al siguiente. Después de sembrar las ocho placas, incube las células durante 30 minutos. Transcurridos 30 minutos, utilizando una pipeta de 200 microlitros, coloque la punta de la pipeta en el pocillo de manera que no toque la cama de matriz pura y retire muy suavemente el medio del pocillo. Debe eliminarse aproximadamente dos tercios del medio para equilibrar el pH del hidrogel.No utilice un aspirador de vacío, ya que esto alteraría la matriz. A continuación, agregue muy suavemente 150 microlitros de medio fresco de cultivo celular al costado del pocillo que contiene las células encapsuladas en Matrixx puro. De la misma manera que se mostró anteriormente, retire dos tercios del medio y agregue medio fresco a los pocillos restantes.Cambie el medio de cultivo celular en cada pocillo cada 48 horas por medio fresco. Se encapsularon células OR cinco como se demostró en el procedimiento. Se muestran representaciones 3D representativas del protocolo de imágenes de células OR cinco encapsuladas y cultivadas en matriz pura en los días 1, 3, 5 y 7.Así que acabamos de mostrarle cómo encapsular en cultivo la línea celular de cáncer de ovario CAR cinco y una matriz sintética llamada Pure Matrixx. Al usar Pure Matrixx, es importante tener en cuenta que este protocolo ha sido optimizado para la línea celular O Car cinco. Cada investigador deberá optimizar y ajustar finamente el protocolo para su línea celular particular.Y recuerde que al realizar cambios de medio, es muy importante no perturbar el lecho de matriz, ya que es muy frágil; nunca aspire y siempre use una pipeta. Eso es todo. Muchas gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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