Name: Medición de la oxigenación sanguínea cerebral basada en el oxígeno-dependiente de enfriamiento de fosforescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a medir la tensión de oxígeno en la microvasculatura cerebral de roedores mediante el apagamiento de fosforescencia dependiente del oxígeno. Este método permite estudiar la entrega y consumo de oxígeno en condiciones normales y patológicas del cerebro.

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Nos gustaría agradecer el apoyo de EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 y R01EB007279 y la American Heart Association conceder 0855772D.

1. Amplio campo de visión de imágenes de la pO2 en la vasculatura cortical de una rata <ol><li> Las ratas (250 g -350 g) son inicialmente anestesiados con isoflurano, y la arteria femoral y la vena se cateteriza para controlar la frecuencia cardiaca, presión arterial y los gases en sangre, así como para la infusión intravenosa. La temperatura corporal se mantiene a 37 ± 0,1 ° C. Traqueotomía se realiza, y las ratas son ventilados con una mezcla de aire y oxígeno. </li><li> Las muestras de sangre para medir los gases en sangre se toman cada 30-45 minutos y la ventilación y la anestesia se ajustan para mantener los gases de la sangre dentro del rango fisiológico normal. </li><li> Una ventana cerrada del cráneo en el hueso parietal 4 mm x 4 mm de tamaño se prepara para la imagen. El hueso y la duramadre se eliminan y la ventana del cráneo está lleno de agarosa al 1,5% y se sella con un cubreobjetos microscopio. Un adicional de 1 mm 2 trepanación en el hueso frontal se utiliza para inducir la CDS por microinyección intracortical de KCl (~ 10 l, 1 M). Deben extremarse las precauciones para evitar cualquier daño de los vasos corticales. El exceso de calor, presión mecánica, o breve período de hipoxia puede comprometer la barrera sanguínea del cerebro y causar fugas de la tintura de los vasos al espacio intersticial. </li><li> Una máscara de material ópticamente opaco se coloca alrededor de las ventanas del cráneo. El propósito de la máscara es la de absorber la señal de fosforescencia que viene de la tinta que se filtró en el tejido de los bordes de la materia dura. El medio de contraste en el espacio intersticial es la fuente de la fosforescencia muy brillante que puede echar a perder la medición. El aumento de brillo de la tinta en el espacio intersticial es el resultado de la acumulación de la tinta en el medio ambiente con baja presión de oxígeno y la baja velocidad de enfriamiento. El daño de los vasos en el experimento es por lo tanto, fácilmente reconocible por la aparición de manchas brillantes fosforescencia, en cuyo caso se rechaza los datos experimentales. </li><li> Después de terminar la cirugía, el isoflurano se interrumpe y la anestesia se pasó a alfacloralosa (50 mg / kg en bolo intravenoso seguido de 40 mg / (kg h) de infusión). </li><li> Animal es trasladado en un carro con la presión arterial ventilador, y controlar la temperatura. Mientras se respira el aire de la habitación, el animal se mueve rápidamente hacia la configuración de imagen y vuelve a conectar el medidor con la mezcla adecuada de aire y oxígeno. </li><li> El marco estereotáxico que tiene el animal se encuentre en el objetivo. La ventana del cráneo se centra en el campo de visión en el objetivo y se coloca paralela al plano focal. </li><li> El láser pulsado se enciende y se puso a la energía de pulso mínimo. El haz óptico se dirige hacia medidor de energía de pulso y pulso de energía entregada a la muestra se ajusta a no más de 10 mJ / cm 2. La ISS rayo centrado en la ventana del cráneo con un ángulo de incidencia oblicua de ~ 60 grados y la ISS láser apagado. </li><li> Mediciones de gases en sangre y los ajustes de la ventilación y la anestesia se llevan a cabo hasta que todos los parámetros fisiológicos de los animales estuvieron dentro del rango fisiológico normal. </li><li> Suponiendo que el volumen de sangre es de aproximadamente el 7% del peso corporal, una cantidad adecuada de la sonda R3 Oxyphor fosforescencia se disuelve en 1 ml de solución salina para alcanzar 4 x 10 -5 M la concentración sanguínea de la sonda. La solución de la sonda se inyecta a través de la vena femoral. </li><li> Una solución 1 M de cloruro de potasio se prepara y ~ 1 ul se inyecta con una jeringa a través de la trepanación en el hueso frontal para inducir a la CDS. </li><li> El láser se enciende y la imagen se inicia inmediatamente después de la inyección de la solución de KCl. Imágenes de fosforescencia se lleva a cabo durante aproximadamente 10 min. </li><li> Otra medición de gases en sangre se realiza para confirmar que los parámetros fisiológicos de los animales se encuentran dentro del rango normal. </li><li> Vidas fosforescencia se obtienen para todos los píxeles mediante el ajuste de la decadencia exponencial con una sola conexión cuadrados no lineal con ponderación estadística en Matlab. Fosforescencia vidas se convierten en los valores de pO2 con una empírica de Stern Volmer-como la relación (vide infra). </li></ol> 2. Alta resolución de dos fotones pO2 imagen en la vasculatura cortical micro de un ratón <ol><li> Los ratones se anestesian con la arteria femoral y isofluorene se cateteriza para controlar la frecuencia cardiaca, presión arterial y los gases en sangre, así como para la administración del medio de contraste. La temperatura corporal se mantiene a 37 ± 0,1 ° C y los animales respiran de manera espontánea una mezcla de aire y oxígeno. </li><li> Una ventana craneal se prepara de acuerdo a la técnica desarrollada originalmente por David Kleinfeld y Winfried Denk. Un buen cuidado se debe tomar para evitar cualquier daño de los vasos para evitar posibles fugas del medio de contraste en el espacio intersticial. </li><li> A pocas muestras de sangre para medir los gases en sangre se toman durante un procedimiento de preparación y de ventilación y anestesia se ajustan para mantener el gas en la sangrees dentro del rango fisiológico normal. </li><li> El animal se mueve a la configuración de imágenes. Un marco estereotáxico modificado que tiene el animal se encuentre en el objetivo. La ventana del cráneo se centra en el campo de visión del objetivo Olympus 4X y se coloca paralela al plano focal. </li><li> Una imagen de la ventana del cráneo es tomada con la cámara digital a través de los oculares, y el objetivo de 4X se reemplaza con el objetivo de Olympus 20X (NA = 0,95). </li><li> Mediciones de gases en sangre y los ajustes de la ventilación y la anestesia se llevan a cabo hasta que todos los parámetros fisiológicos de los animales dentro de un rango fisiológico normal. </li><li> Suponiendo que el volumen de sangre es de aproximadamente el 7% del peso corporal, una cantidad apropiada de la fosforescencia de la sonda PTP-C343 se disuelve en 0,2 ml de solución salina para alcanzar la concentración sanguínea de aproximadamente 15 M de la sonda. La solución de la sonda se inyecta a través de la arteria femoral. </li><li> Comenzar el experimento mediante el establecimiento de los intervalos de tiempo deseado para la excitación del tinte y la recolección de emisión en cada píxel. </li><li> Adquirir un escáner encuesta que es un proceso lento de 2 dimensiones barrido de trama de la decadencia intensidad fosforescencia que muestra la estructura vascular a la profundidad actual. El objetivo se mueve perpendicular a la ventana del cráneo (eje Z) y lento exploraciones estudio de la intensidad de fosforescencia en 2D se realizan usando la potencia del láser en un mínimo de 840 nm para encontrar los microvasos en el plano de la imagen. </li><li> En cada una profundidad de imagen, basado en la exploración encuesta de fosforescencia a esa profundidad, un conjunto de puntos dentro de la vasculatura son seleccionados, y el registro de fosforescencia decae en cada punto se repite para un número predefinido de promedio. </li><li> Establecer la cantidad deseada de un promedio, intervalo de medición, y la duración de la prueba y empezar la medición. PO 2 mediciones se adquieren en los lugares seleccionados en el intervalo de medición especificado para la duración del experimento. </li><li> Durante las mediciones, el software de re-dirige el láser de excitación de las ubicaciones seleccionadas por el cambio de la posición de los espejos galvanómetro de escaneado. Control de los escáneres galvanómetro, modulador óptico electro, y el resto del equipo se realizan por software a medida en LabView. </li><li> Vidas fosforescencia se obtienen todos los puntos seleccionados mediante el ajuste de la decadencia exponencial con una sola conexión cuadrados no lineales en Matlab. Fosforescencia vidas se convierten en los valores de pO2 con una empírica de Stern Volmer-como la relación (vide infra). </li><li> Después de recoger los datos en diferentes profundidades corticales, inyectar dextrano conjugado con fluoresceína en la vasculatura para obtener imágenes de la estructura de la microvasculatura. </li><li> Obtener una pila de imágenes estructurales de los vasos mediante la realización de la imagen de dos fotones de FITC fluorescencia utilizando un canal verde en el detector de cuatro canales. </li><li> Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Subcomité Hospital General de Massachusetts en Investigación en Atención Animal. </li></ol> 3. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Panel (a) en el lado izquierdo de esta figura se muestra un amplio campo de la imagen de vista de la presión de oxígeno antes de la llegada de una ola de CSD. El panel (b) en el lado derecho muestra la evolución temporal de la presión de oxígeno promedio durante la propagación de la CDS en la región de interés marcados en el panel (a). Figura 2 (la película de AVI): Esta película muestra la evolución temporal de la presión de oxígeno en la ventana del cráneo entero durante la propagación de la onda de la CDS. Barra de escala indica la presión de oxígeno en milímetros de mercurio. <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. Proyección en 3D de la pila de vasos imagen. Los tonos de gris representan una máscara de vasos volumétricos, creado en base a la imagen estructural. Medido valores de pO 2 están codificados por color. Barra de escala es de 200 micrómetros. Reproducido con permiso de Nature Publishing Group. 7

<ol><li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinfeld%2C+D+%22Contemporary+Neuroscience+Series%22">Contemporary Neuroscience Series</a>. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials & Interfaces. , (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li>
<li>Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li>
<li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li>
<li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li>
</ol>

Hemos demostrado dos aplicaciones de la medición de pO2 en la microvasculatura cortical basada en el oxígeno-dependiente de extinción de la fosforescencia. Aunque el primer método basado en imágenes CCD ofrece amplio campo de vista del control pO2, la medición de la presión parcial de oxígeno en la microvasculatura cortical sobre la base de dos fotones microscopía capilar ofrece una resolución de imagen y permite en profundidad. Ambos métodos proporcionan alta velocidad y las mediciones de relación señal-ruido. Además, ...

<table><tbody><tr><td>Glicopirrolato</td><td>Reactivo</td><td>American Regent Inc.</td><td>NDC 0517-4605-25</td><td>Se utiliza para controlar las secreciones faríngeas, traqueales y bronquiales.</td></tr><tr><td>Lidocaína HCL</td><td>Reactivo</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4277-01</td><td>Se utiliza como anestesia local durante cirugías.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Reactivo</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>Se utiliza como anestésico inhalatorio general durante cirugías y como anestesia general durante experimentos con ratones.</td></tr><tr><td>Alfa-cloralosa</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0128</td><td>Se utiliza como anestesia general durante experimentos con ratas.</td></tr><tr><td>Dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína&amp;#8211;</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td>Se administra para obtener una concentración de ~ 500 nM en sangre.</td></tr></tbody></table>

medición de la oxigenación sanguínea cerebral basada en el oxígeno-dependiente de enfriamiento de fosforescencia

Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Seguimiento de las características espacio-temporales de la sangre cerebral y la oxigenación tisular es crucial para una mejor comprensión de la relación neuro-metabólico-vasculares. Desarrollo de nuevas modalidades de medición pO2 con un control simultáneo de pO2 en grandes campos de visión con mayor resolución espacial y / o temporal que permitirá una mayor penetración en el funcionamiento del cerebro normal y también tendrá un impacto significativo en el diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades neurovasculares como accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer, y lesiones en la cabeza. Modalidades de imágenes ópticas han demostrado un gran potencial para proporcionar alta resolución espacio-temporal y de imagen cuantitativa de pO2 basado en la absorción de la hemoglobina en el rango visible e infrarrojo cercano del espectro óptico. Sin embargo, la medición multiespectral de la oxigenación sanguínea cerebral se basa en la migración de fotones a través del tejido cerebral de alta dispersión. Estimación de parámetros y modelado de tejidos ópticos, que pueden sufrir cambios dinámicos durante el experimento, que normalmente se requiere una estimación precisa de la oxigenación de la sangre. Por otro lado, la estimación de la presión parcial de oxígeno (pO2) basada en el oxígeno-dependiente de extinción de la fosforescencia no debe verse afectado significativamente por los cambios en los parámetros ópticos de los tejidos y proporciona una medida absoluta de pO2. Sistemas experimentales que utilizan tintes sensibles al oxígeno se ha demostrado en estudios in vivo del tejido perfundido, así como para monitorear el contenido de oxígeno en cultivos de tejidos, demostrando que la fosforescencia de enfriamiento es una tecnología potente capaz de obtener imágenes precisas de oxígeno en el rango fisiológico pO2. Aquí se demuestra con dos modalidades de imágenes diferentes de cómo realizar la medición de la pO2 en la vasculatura cortical sobre la base de imágenes de toda la vida fosforescencia. En la primera demostración se presenta amplio campo de visión de imágenes de la pO2 en la superficie cortical de una rata. Esta modalidad de imagen tiene la configuración experimental relativamente simple basado en una cámara CCD y un láser pulsado verde. Un ejemplo de control de la propagación de la depresión cortical sobre la base de toda la vida fosforescencia de tinte R3 Oxyphor fue presentado. En segunda manifestación se presenta una alta resolución de dos fotones pO2 imagen en la vasculatura cortical micro de un ratón. El dispositivo experimental incluye una hecha a la medida de 2 fotones con microscopio láser de femtosegundo, modulador electro-óptico, y el fotón-contando tubo foto multiplicador. Se presenta un ejemplo de imagen de la heterogeneidad pO2 en la microvasculatura corticales incluyendo capilares, utilizando un nuevo punto a punto-C343 colorante con una mejora de dos fotones sección transversal de excitación. Haga clic aquí para ver el artículo relacionado <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en los sistemas biológicos.</a>

Se presenta un procedimiento experimental para la medición de la presión parcial de oxígeno (pO2) en la vasculatura cerebral basada en el oxígeno-dependiente de extinción de la fosforescencia. Preparación de animales y los procedimientos de imagen se describe, tanto para el campo visual amplio CCD basado en imágenes de la pO2 de las ratas y 2-fotones de imágenes basado en la excitación de la pO2 de ratones.

Medición de la oxigenación sanguínea cerebral basada en el oxígeno-dependiente de enfriamiento de fosforescencia

El monitoreo de las características espaciotemporales de la oxigenación de la sangre y los tejidos cerebrales es fundamental para comprender mejor el...

Hola, soy Sava Saje del Laboratorio de Imagen por Migración Fotográfica de David Bo en el Centro Martino de Imagen Biomédica del Hospital General de Massachusetts. Y también soy jefe del Laboratorio David Bow. Soy del mismo laboratorio. Hoy les mostraremos dos procedimientos para medir la tensión de oxígeno en la microvasculatura cortical de roedores pequeños, basados en el apagado dependiente del oxígeno de la fosforescencia.Utilizamos estas técnicas en nuestro laboratorio para estudiar la entrega y el consumo de oxígeno bajo condiciones cerebrales normales y patológicas. Comencemos. Primero, prepare varias piezas de cubreobjetos rodeadas por máscaras ópticamente absorbentes hechas de cinta adhesiva negra.Las máscaras deben tener aberturas de aproximadamente 3,5 milímetros de diámetro. Estos cubreobjetos se utilizan para sellar las ventanas craneales, mientras que la máscara absorbente bloquea la señal fosforescente de cualquier colorante que haya filtrado desde los bordes de las ventanas craneales. Ahora prepare la ventana craneal sellada sobre el hueso parietal.Los detalles de la preparación se pueden encontrar en artículos de Kleinfeld et al. y Masini et al. citados en esta publicación. En esta preparación, se elimina la duramadre. Asegúrese de que la máscara cubra todos los bordes de la ventana craneal.Ahora, utilizando un taladro dental, haga un orificio adicional de un milímetro de diámetro en el hueso frontal. Este orificio se utilizará posteriormente para inducir la depresión cortical propagada. Tenga cuidado de no dañar la vascularización cortical en ningún paso.El sistema de imagen está compuesto por un láser pulsado YAG de neodimio cuántico brillante a 532 nanómetros y 10 hercios, en el cual una pequeña parte de la energía del pulso se acopla a una fibra multimodo y se dirige a la muestra. La energía de cada pulso también se muestrea con un fotodiodo. Un dispositivo de imagen CCD.El QE del sistema de visión se monta sobre una platina vertical en Z. Utilizamos un objetivo Olympus de cuatro aumentos con una distancia de trabajo de 29 milímetros. Un filtro paso alto con una longitud de onda de corte de 650 nanómetros y una lente tubular de distancia focal de 100 milímetros se colocan delante de la cámara con el animal en su lugar.Ajuste la posición del objetivo. Ahora configure el láser a energía de pulso mínima y enciéndalo. Mida la energía del haz con un medidor de energía de pulso óptico y ajuste el conmutador Q.Tiempo de retardo de modo que la energía del pulso entregada a la muestra no supere los 10 milijulios por centímetro cuadrado. A continuación, asegúrese de que todos los parámetros fisiológicos del animal se encuentren dentro del rango fisiológico normal. Luego, disuelva una cantidad adecuada en peso de la sonda de fosforescencia sensible al oxígeno.Oxy cuatro R tres, desarrollado por Libi Dev et al., en un mililitro de solución salina para alcanzar una concentración de 40 micromolar en sangre. Inyecte lentamente la solución en la vena femoral. Ahora inyecte aproximadamente un microlitro de una solución un molar de cloruro de potasio a través del orificio en el hueso frontal para inducir la depresión cortical propagada e inicie el software de adquisición de datos.La obtención de imágenes de la fosforescencia debería durar aproximadamente 10 minutos. Durante el experimento, las imágenes de fosforescencia se muestran en tiempo real en la pantalla. Después de la adquisición de imágenes, tome otra muestra de sangre para confirmar que los gases sanguíneos del animal aún se encuentran dentro del rango fisiológico normal.A continuación se presentan algunos resultados representativos de la imagen CCD de campo amplio de PO₂ durante la depresión cortical propagada. El lado izquierdo de esta figura muestra una imagen de campo amplio de la presión de oxígeno antes de la llegada de una onda de DCP. El lado derecho muestra la evolución temporal de la presión media de oxígeno durante la propagación de la DCP dentro de la región de interés marcada en la izquierda.Esta película muestra la evolución temporal de la presión de oxígeno en toda la ventana craneal. Durante la propagación de la onda de DSC, la barra de escala indica la presión de oxígeno en milímetros de mercurio para la imagenología de dos fotones de la tensión de oxígeno y de la microvasculatura cortical de un ratón. Prepare la ventana craneal como se describe en el artículo número seis 80 de JoVE e inserte la cánula en la arteria femoral.Para la obtención de imágenes, utilizamos un objetivo de inmersión en agua recubierto para infrarrojo de 20x de Olympus, disolvemos una cantidad adecuada en peso de la sonda de fosforescencia sensible al oxígeno, PTPC 3 43, desarrollada por Kova et al. en 0,2 mililitros de solución salina y la filtramos a través de un filtro de dos micrómetros. Después de asegurarnos de que los parámetros fisiológicos del animal se encuentran dentro del rango fisiológico normal, inyectamos muy lentamente la solución de PTP C3 43 en la arteria femoral. Los componentes principales del montaje experimental son un láser de femtosegundos ajustado a 840 nanómetros, un modulador electroóptico, escáneres galvanométricos, lentes de escaneo y de tubo de Olympus, y un detector de cuatro canales con PMTs.Un canal de detección contiene tanto un PMT como un discriminador. Los conteos de fotones se recopilan con una tarjeta digital de alta velocidad. Todos los aspectos del experimento son controlados por un software escrito en LabVIEW y C.Comience el experimento estableciendo los intervalos de tiempo deseados para la excitación del colorante y la recopilación de emisiones. En cada píxel, adquiera primero un escaneo de reconocimiento, que es un escaneo raster bidimensional lento de la decadencia de la intensidad de la fosforescencia que muestra la estructura del sistema vascular a la profundidad actual. Utilizando la imagen del escaneo de reconocimiento, seleccione ubicaciones intravasculares para medir el PO₂. Durante las mediciones, el software redirige el láser de excitación a las ubicaciones seleccionadas cambiando la posición de los espejos de escaneo del galvanómetro.Establezca la cantidad deseada de intervalo de medición promediado y la duración del experimento, y comience la medición. Se adquieren dos mediciones PO en las ubicaciones seleccionadas al intervalo de medición especificado durante la duración del experimento. Después de recopilar datos a diversas profundidades corticales, inyecte un colorante fluorescente conjugado con dextrina en la vasculatura para la obtención de imágenes.La estructura de la microvasculatura. Obtenga una serie de imágenes estructurales de la vasculatura realizando la imagen de dos fotones de la fluorescencia de fitc mediante un canal verde en el detector de cuatro canales. Aquí presentamos una proyección 3D de la serie de microvasculatura obtenida por imagen.Las tonalidades de gris representan una máscara de vasos volumétricos creada a partir de la imagen estructural. Los valores medidos de PO₂ se codificaron por colores. La barra de escala es de 200 micrómetros.Acabamos de mostrarle dos procedimientos para medir la tensión de oxígeno en la microvasculatura cortical, en roedores pequeños, basados en el apagado dependiente del oxígeno de la fosforescencia. Al realizar estos procedimientos, es importante realizar cirugías cerebrales muy limpias y también usar gafas de seguridad al operar los láseres. Eso es todo.Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se presentan los principios de la medición de oxígeno por temple fosforescencia y revisión del diseño de la porfirina basada en nanosensores dendríticas para obtener imágenes de oxígeno en los sistemas biológicos.

Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

Aquí se describe un método para visualizar directamente la hipoxia tisular microrregional en la corteza del...

La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

Se combinaron dominio de la frecuencia del infrarrojo cercano las medidas de espectroscopia de oxigenación cerebral difusa con hemoglobina medidas de espectroscopia de correlación del índice de flujo sanguíneo cerebral para estimar un índice de metabolismo del oxígeno. Pusimos a prueba la utilidad de esta medida como una herramienta de detección de cabecera para evaluar la salud y el desarrollo del cerebro del recién nacido.

No invasiva de medición óptica del metabolismo cerebral en lactantes y Hemodinámica

Este protocolo describe el precondicionamiento hipóxico repetitivo, o exposiciones breves a la hipoxia sistémica que reducen los volúmenes de infarto y la interrupción de la barrera hematoencefálica después de una oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. También detalla la cuantificación dual del volumen del infarto y la alteración de la barrera hematoencefálica después de un accidente cerebrovascular para evaluar la eficacia de la protección neurovascular.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

simulación hipoxia en los seres humanos por lo general se ha realizado por la inhalación de mezclas de gases hipóxicas. Para este estudio, los buceadores de apnea se utilizan para simular la hipoxia dinámico en los seres humanos. Además, los cambios fisiológicos en la desaturación y re-saturación cinéticas fueron evaluados con herramientas no invasivas tales como el Infrarrojo Cercano-Espectroscopía (NIRS) y la saturación de oxigenación periférica (SpO2).

Un modelo para simular la hipoxia clínicamente relevantes en seres humanos

Aquí, presentamos un método para la caracterización espectroscópica de moléculas orgánicas por medio de espectroscopia tiempo-resolved de la fotoluminiscencia en la escala de tiempo de nanosegundos a milisegundos en condiciones libres de oxígeno. También se describen métodos para quitar eficientemente el oxígeno de las muestras y, así, limitar el amortiguamiento de luminiscencia.

Tiempo-resolved fotofísicas caracterización de trío cosecha compuestos orgánicos en un libre de oxígeno ambiente usando un iCCD cámara

Este protocolo muestra cómo medir la conectividad funcional del estado en reposo en la corteza prefrontal humana utilizando un instrumento de espectroscopia de correlación difusa hecho a medida. El informe también analiza aspectos prácticos del experimento, así como pasos detallados para analizar los datos.

Conectividad funcional del cerebro humano basada en el flujo sanguíneo cerebral mediante espectroscopia óptica de correlación difusa

Aquí se presenta un protocolo para monitorear de forma no invasiva la hemodinámica cerebral de pacientes neurocríticos en tiempo real y al lado de la cama utilizando óptica difusa. Específicamente, el protocolo propuesto utiliza un sistema óptico difuso híbrido para detectar y mostrar información en tiempo real sobre la oxigenación cerebral, el flujo sanguíneo cerebral y el metabolismo cerebral.

Monitorización en tiempo real de pacientes neurocríticos con espectroscopias ópticas difusas

El protocolo describe la generación de esferoides de alto rendimiento para la bioimpresión utilizando el análisis multiparamétrico de su oxigenación y muerte celular en un microscopio de fluorescencia estándar. Este enfoque se puede aplicar para controlar la viabilidad de los esferoides y realizar la estandarización, lo cual es importante en el modelado de tejido 3D, el microambiente tumoral y la biofabricación (micro) tisular exitosa.

Biofabricación asequible asistida por microscopía de oxígeno de esferoides multicelulares

Este artículo describe el uso de un nuevo y rápido generador de imágenes ópticas para la obtención de imágenes macroscópicas de la vida útil de la fotoluminiscencia de muestras que emiten descomposición larga. Se describen los procedimientos de integración, adquisición de imágenes y análisis, junto con la preparación y caracterización de los materiales del sensor para la obtención de imágenes y la aplicación del generador de imágenes en el estudio de muestras biológicas.

Macro Imager de vida útil de fluorescencia para aplicaciones biomédicas

Describimos un protocolo para medir de forma no invasiva y continua el índice de flujo sanguíneo microvascular absoluto y la saturación de oxígeno en sangre utilizando un dispositivo multimodal basado en óptica difusa de infrarrojo cercano. A continuación, evaluamos la tasa metabólica del consumo de oxígeno y la hiperemia reactiva mediante una prueba de oclusión vascular.

Monitorización no invasiva de la oxigenación microvascular y la hiperemia reactiva mediante espectroscopia óptica difusa híbrida de infrarrojo cercano para cuidados intensivos

Aprende a medir la tensión de oxígeno en la microvasculatura cerebral de roedores mediante el apagamiento de fosforescencia dependiente del oxígeno. Este método permite estudiar la entrega y consumo de oxígeno en condiciones normales y patológicas del cerebro.

Medición de la oxigenación sanguínea cerebral basada en el oxígeno-dependiente de enfriamiento de fosforescencia

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