Name: Un protocolo para la producción de KLRG1 Tetramer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprende a producir tetrámeros de KLRG1 mediante cultivo bacteriano e inducción con IPTG para analizar interacciones ligando-receptor. Este protocolo facilita estudios inmunológicos detallados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos al Dr. Naidenko para ayudar en la optimización de las condiciones de replegamiento. Este trabajo fue apoyado por el NIH beca de investigación AI58181 a Laurent Brossay. Cindy Banh es apoyado por el NIH AI080230 NRSA F31. Stephanie Terrizzi y Banh Cindy contribuyen igualmente a este trabajo.

Preparación de cuerpos de inclusión <ol><li> Inocular 4 x 500 ml frascos de TB cada uno contienen 50 mg / ml de carbenicilina y cloranfenicol con un cultivo de una noche de bacterias que expresan la construcción KLRG1 plásmido. Cuando el OD alcanza 0,6 A a 600 nm, inducir con la adición de 0,4 M IPTG e incubar la cultura de un adicional de 4 horas con agitación a 37 º C. </li><li> Resuspender las células recogidas en el pH del buffer de resuspensión = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) de sacarosa, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellets se pueden congelar en este momento. </li><li> Piscina no más de 60 ml de resuspensiones bacteriana en un vaso de polipropileno. Si es necesario ajustar a 60 ml con buffer TE pH 8,0 y revuelva la mezcla a una velocidad media. </li><li> Para agitar la mezcla añadir gota a gota: la lisozima (final = 1 mg / ml), MgCl2 (final = 5 mM), 2 mg DNasa I en el 50% de glicerol contenía 75 mM NaCl, Triton-X100 (final = 1%), TDT ( final = 10 mM). </li><li> Sonicar la solución en hielo durante 1,5 minutos y centrifugar los lisados ​​a 5.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Se decanta el sobrenadante. </li><li> Añadir 15 ml de tampón de lavado pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> En el hielo, ultrasonidos solución durante 1,5 minutos hasta que el pellet es completamente resuspendido. </li><li> Centrifugar las muestras a 5.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Repita el lavado 5 veces. </li></ol></li><li> Repita 5b con tampón de lavado sin Triton X-100, se centrifuga y se resuspende en 4 ml de buffer TE. </li><li> Tome la inclusión de peso húmedo cuerpos lodo y almacenar en buffer TE a una concentración de 30 a 100 mg / ml. </li></ol> Replegamiento de KLRG1 <ol><li> Hacer una L de buffer de pH = replegado 8,0 (0,4 M arginina-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8.3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA libre de tabletas de inhibidor de la proteasa, 5 mM de GSH y GSSG 0,5 mM) y el frío a 4 ° C mientras se agita. </li><li> Preparar los cuerpos de inclusión para la inyección en la mezcla de plegado: Lo ideal es hacer 5 10 inyecciones cada uno con 0,25 M de concentración 0.5 a fin de que la concentración final de la proteína será 2 3 M. <ol class="lalpha"><li> Derretir el volumen de 50 mg de suspensión de los cuerpos de inclusión en 7 M GnHCl con 10 mM β-mercaptoetanol. </li><li> Mantenga la inclusión cuerpos / GnHCl mezcla a 37 ° C durante 30 - 40 min y agitar cada 5 minutos para asegurar la fusión completa (purines se pondrá de manifiesto cuando se derrita por completo). </li><li> Centrifugar a máxima velocidad durante 30 minutos en microcentrífuga a 4 ° C y la transferencia del sobrenadante a un tubo de centrífuga de 15 ml. No a la transferencia de cualquiera de los pequeños gránulos negruzcos. </li></ol></li><li> Ajustar el volumen con el tampón de inyección (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA). </li><li> Inyectar 1 ml de cuerpos de inclusión diluye cada hora. Cuando se inyecta, mezcle a alta velocidad, añadir 1 ml de la inclusión diluido gota a gota cuerpos con 2 segundos entre cada gota. Cuando la inyección se realiza, remover a baja velocidad. </li><li> Continuar durante la noche de agitación a baja velocidad a 4 ° C. </li></ol> Concentración de reacciones Replegado <ol><li> Siguiendo el protocolo de Millipore s, se concentran la L 1 de pre-filtrado (0,22 m filtrada) mediante una reacción de repliegue agitado Amicon celular y la membrana YM10 NMWL 10K ultrafiltración (Millipore) a ~ 10 ml. </li><li> Concentrado a ≤ 2 ml con un Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> La purificación de KLRG1 tetrámero <ol><li> Configuración de la AKTAFPLC a 4 ° C de acuerdo con GE manuales de salud. </li><li> Purificar la forma de monómero de KLRG1 por cromatografía de exclusión mediante un Sephacryl S-200 16/60 de alta resolución de la columna (GE Healthcare) en HEPES 20 mM y 150 mM NaCl. (Ver Figura 1). </li><li> Concentrado a 1 ml con Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> Uso de enzimas BirA acuerdo con el protocolo de avidez s de biotinylate el monómero KLRG1. </li><li> La biotina libre se elimina por cromatografía de exclusión, como en 2. </li><li> KLRG1 molécula es tetramerized mediante la mezcla de monómero KLRG1 con 4 veces el exceso molar estreptavidina conjugada con PE (BD Biosciences). </li></ol> Resultados representante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"></a> Figura 1. Representante de los resultados positivos de la cromatografía de AKTA FPLC de exclusión por tamaño de la KLRG1 replegada. El gráfico muestra la separación de los monómeros (83,52 ml), dímero (56,36 ml), y multímero (36,26 ml) de la forma replegada KLRG1. El pico a 94,25 ml representa el intercambio de amortiguamiento.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

En este protocolo, se muestra cómo purificar, biotinylate y KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrámero puede ser utilizada para etiquetar KLRG1 ligandos por citometría de flujo. Aunque las condiciones de replegamiento tendrá que ser probado empíricamente para cada proteína, otras de tipo C-lectinas podrían ser tetramerized utilizando un protocolo similar. El uso de proteínas tetramerized como sondas, los ligandos para los receptores de lectina tipo huérfano C-podrían ser identificados.

<table><tbody><tr><td>Enzima y tampón BirA</td><td>Kit de biotinilación</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Tabletas completas de inhibidores de proteasas, sin EDTA</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Celda agitada Amicon</td><td>Equipo</td><td>EMD Millipore</td><td>Modelo #8400</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Membrana de ultrafiltración YM10 NMWL 10K</td><td>Material de filtración</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador YM10 de 15 ml</td><td>Material de filtración</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Equipo</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Columna de alta resolución Sephacryl S-200 16/60</td><td>Equipo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina PE</td><td>Reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>o equivalente</td></tr></tbody></table>

un protocolo para la producción de klrg1 tetramer

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Las células asesinas tipo lectina G1 receptor (KLRG1) es un tipo de receptores transmembrana II glicoproteína inhibitoria que pertenecen al tipo C-lectina como superfamilia. KLRG1 existe como monómero y como un homodímero disulfuro-ligado. Este receptor, bien conservada se encuentra en las células NK más madura y activa recientemente, así como en un subconjunto de células T efectoras / memoria. Utilizando KLRG1 tetrámero, así como otros métodos, E, N, R y-cadherinas fueron identificados como KLRG1 ligandos. Estos Ca 2 +-dependiente de la célula-célula moléculas de adhesión forma parte de un dominio extracelular que contiene cinco repeticiones cadherina responsables de las interacciones célula-célula, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que se vincula con el citoesqueleto de actina. Generación del tetrámero KLRG1 era esencial para la identificación de los KLRG1 ligandos. KLRG1 tetrámero es también una herramienta única para dilucidar la cadherina roles y jugar KLRG1 en la regulación de la respuesta inmune y la integridad del tejido.

Este protocolo describe la producción de KLRG1 tetrámero, que es una poderosa herramienta para el análisis de KLRG1 ligandos.

Un protocolo para la producción de KLRG1 Tetramer

El receptor inhibitorio G1 de la lectina similar a las células asesinas (KLRG1) es un receptor inhibitorio glucoproteico transmembrana de tipo II que pertenece a la superfamilia de lectinas similares al tipo C. ...

Hola, soy Stephanie Resi del laboratorio de Lauren Parce en el Departamento de Microbiología Molecular e Inmunología de la Universidad de Brown. Hoy les mostraremos un procedimiento para la generación de tetrámeros de K LRG uno. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las interacciones coherentes de K LRG uno.Comencemos. Primero, inocule cuatro matraces de 500 mililitros de tampón TB que contengan antibióticos apropiados con bacterias que expresen el constructo plasmídico K LRG uno y cultívelos a 37 grados Celsius con agitación hasta que la DO alcance 0,6 unidades a 600 nanómetros; induzca la expresión mediante el promotor T siete mediante la adición de IPTG 0,4 molar e incube el cultivo durante cuatro horas adicionales con agitación a 37 grados Celsius. Tras la incubación de cuatro horas, transfiera las bacterias a tubos de centrífuga y centrifugue los cultivos durante 20 minutos a 3000 RPM y 4 grados Celsius.Si es necesario, los pellet se pueden congelar a menos 80 grados Celsius en este momento para su uso en un momento posterior. Suspender las células recolectadas en 30 mililitros de tampón de suspensión Resus. A continuación, reunir las suspensiones

a-protocol-for-the-production-of-klrg1-tetramer

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La producción de C. elegans Los transgenes a través de recombinería con la GALK Marcador seleccionable

Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Complejos de proteínas catalizan las funciones celulares clave. Caracterización detallada funcional y estructural de muchos complejos esenciales requiere la producción recombinante. MultiBac es un sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para la expresión de proteínas eucarióticas y sus complejos. MultiBac se implementó como una plataforma de acceso libre, y los procedimientos operativos estándar desarrollados para maximizar su utilidad.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Kindlins son fundamentales para la adhesión celular a través de las integrinas, pero los estudios de ellos se han visto obstaculizados por la dificultad para expresarlos de forma recombinante en huéspedes bacterianos. Se describen aquí métodos para su producción eficiente en células de insecto infectadas con baculovirus.

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

La proteína Cpf1 asociada con CRISPR puede ser guiada por un ARN CRISPR (crRNA) especialmente diseñado para escindir ADN de doble hebra en los sitios deseados, generando extremos pegajosos. Basándose en esta característica, se estableció un estándar de ensamblaje de ADN (C-Brick), y se describe aquí un protocolo que detalla su uso.

Protocolos para el ensamblaje estándar de ADN de C-Brick usando Cpf1

Aquí, presentamos cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR), un método para multiplexar fácilmente gRNA vectores para CRISPR/Cas9 enfoques. Fantasía STAgR hace gRNA multiplexación simple, eficiente y adaptable.

Un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR)

Este protocolo describe cómo establecer un sistema de reportero que puede utilizarse para identificar y cuantificar las interacciones receptor-ligando.

Un sistema reportero BW para el estudio de las interacciones Receptor-ligando

Aquí se presenta un protocolo para la realización de la transferencia de energía de resonancia de una sola molécula de la resonancia de la unidad para estudiar la resolución hj. La excitación alterna de dos colores se utiliza para determinar las constantes de disociación. El smFRET de lapso de tiempo de un solo color se aplica en ensayos de escisión en tiempo real para obtener la distribución del tiempo de permanencia antes de la resolución de HJ.

Métodos de transferencia de energía por resonancia de una sola molécula para la investigación en tiempo real de la resolución de Holliday Junction por GEN1

En este trabajo se describe la metodología utilizada para generar cepas de L. panamensis y L . donovani que expresan el gen de eGFP como un transgén integrado estable utilizando el sistema pLEXSY. Los parásitos transfectados se clonaron limitando la dilución, y se seleccionaron los clones con la mayor intensidad de fluorescencia en ambas especies para su posterior uso en ensayos de detección de fármacos.

Desarrollo de cepas de especies de Leishmania con expresión constitutiva de eGFP

Este artículo presenta un protocolo paso a paso que demuestra cómo se puede adaptar la clonación modular (MoClo) para la clonación de operones policistrónicos.

Ensamblaje modular estandarizado de operones policistrónicos con clonación modular (MoClo) utilizando el kit de herramientas In-Cloning

Este estudio estableció un método que utiliza la expansión del código genético para incorporar con éxito la lactillisina (Klac) en sitios específicos de la enolasa-1 humana (hENO1) y la GFP superplegadora (sfGFP) en Escherichia coli y células de mamíferos.

Lactilación de lisina específica del sitio mediante expansión del código genético en E. coli y células de mamíferos

Aprende a producir tetrámeros de KLRG1 mediante cultivo bacteriano e inducción con IPTG para analizar interacciones ligando-receptor. Este protocolo facilita estudios inmunológicos detallados.

Un protocolo para la producción de KLRG1 Tetramer

Explorar más videos