Name: Un protocolo para la producción de KLRG1 Tetramer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprende a producir tetrámeros de KLRG1 mediante cultivo bacteriano e inducción con IPTG para analizar interacciones ligando-receptor. Este protocolo facilita estudios inmunológicos detallados.

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Agradecemos al Dr. Naidenko para ayudar en la optimización de las condiciones de replegamiento. Este trabajo fue apoyado por el NIH beca de investigación AI58181 a Laurent Brossay. Cindy Banh es apoyado por el NIH AI080230 NRSA F31. Stephanie Terrizzi y Banh Cindy contribuyen igualmente a este trabajo.

Preparación de cuerpos de inclusión <ol><li> Inocular 4 x 500 ml frascos de TB cada uno contienen 50 mg / ml de carbenicilina y cloranfenicol con un cultivo de una noche de bacterias que expresan la construcción KLRG1 plásmido. Cuando el OD alcanza 0,6 A a 600 nm, inducir con la adición de 0,4 M IPTG e incubar la cultura de un adicional de 4 horas con agitación a 37 º C. </li><li> Resuspender las células recogidas en el pH del buffer de resuspensión = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) de sacarosa, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellets se pueden congelar en este momento. </li><li> Piscina no más de 60 ml de resuspensiones bacteriana en un vaso de polipropileno. Si es necesario ajustar a 60 ml con buffer TE pH 8,0 y revuelva la mezcla a una velocidad media. </li><li> Para agitar la mezcla añadir gota a gota: la lisozima (final = 1 mg / ml), MgCl2 (final = 5 mM), 2 mg DNasa I en el 50% de glicerol contenía 75 mM NaCl, Triton-X100 (final = 1%), TDT ( final = 10 mM). </li><li> Sonicar la solución en hielo durante 1,5 minutos y centrifugar los lisados ​​a 5.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Se decanta el sobrenadante. </li><li> Añadir 15 ml de tampón de lavado pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> En el hielo, ultrasonidos solución durante 1,5 minutos hasta que el pellet es completamente resuspendido. </li><li> Centrifugar las muestras a 5.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Repita el lavado 5 veces. </li></ol></li><li> Repita 5b con tampón de lavado sin Triton X-100, se centrifuga y se resuspende en 4 ml de buffer TE. </li><li> Tome la inclusión de peso húmedo cuerpos lodo y almacenar en buffer TE a una concentración de 30 a 100 mg / ml. </li></ol> Replegamiento de KLRG1 <ol><li> Hacer una L de buffer de pH = replegado 8,0 (0,4 M arginina-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8.3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA libre de tabletas de inhibidor de la proteasa, 5 mM de GSH y GSSG 0,5 mM) y el frío a 4 ° C mientras se agita. </li><li> Preparar los cuerpos de inclusión para la inyección en la mezcla de plegado: Lo ideal es hacer 5 10 inyecciones cada uno con 0,25 M de concentración 0.5 a fin de que la concentración final de la proteína será 2 3 M. <ol class="lalpha"><li> Derretir el volumen de 50 mg de suspensión de los cuerpos de inclusión en 7 M GnHCl con 10 mM β-mercaptoetanol. </li><li> Mantenga la inclusión cuerpos / GnHCl mezcla a 37 ° C durante 30 - 40 min y agitar cada 5 minutos para asegurar la fusión completa (purines se pondrá de manifiesto cuando se derrita por completo). </li><li> Centrifugar a máxima velocidad durante 30 minutos en microcentrífuga a 4 ° C y la transferencia del sobrenadante a un tubo de centrífuga de 15 ml. No a la transferencia de cualquiera de los pequeños gránulos negruzcos. </li></ol></li><li> Ajustar el volumen con el tampón de inyección (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA). </li><li> Inyectar 1 ml de cuerpos de inclusión diluye cada hora. Cuando se inyecta, mezcle a alta velocidad, añadir 1 ml de la inclusión diluido gota a gota cuerpos con 2 segundos entre cada gota. Cuando la inyección se realiza, remover a baja velocidad. </li><li> Continuar durante la noche de agitación a baja velocidad a 4 ° C. </li></ol> Concentración de reacciones Replegado <ol><li> Siguiendo el protocolo de Millipore s, se concentran la L 1 de pre-filtrado (0,22 m filtrada) mediante una reacción de repliegue agitado Amicon celular y la membrana YM10 NMWL 10K ultrafiltración (Millipore) a ~ 10 ml. </li><li> Concentrado a ≤ 2 ml con un Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> La purificación de KLRG1 tetrámero <ol><li> Configuración de la AKTAFPLC a 4 ° C de acuerdo con GE manuales de salud. </li><li> Purificar la forma de monómero de KLRG1 por cromatografía de exclusión mediante un Sephacryl S-200 16/60 de alta resolución de la columna (GE Healthcare) en HEPES 20 mM y 150 mM NaCl. (Ver Figura 1). </li><li> Concentrado a 1 ml con Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> Uso de enzimas BirA acuerdo con el protocolo de avidez s de biotinylate el monómero KLRG1. </li><li> La biotina libre se elimina por cromatografía de exclusión, como en 2. </li><li> KLRG1 molécula es tetramerized mediante la mezcla de monómero KLRG1 con 4 veces el exceso molar estreptavidina conjugada con PE (BD Biosciences). </li></ol> Resultados representante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"></a> Figura 1. Representante de los resultados positivos de la cromatografía de AKTA FPLC de exclusión por tamaño de la KLRG1 replegada. El gráfico muestra la separación de los monómeros (83,52 ml), dímero (56,36 ml), y multímero (36,26 ml) de la forma replegada KLRG1. El pico a 94,25 ml representa el intercambio de amortiguamiento.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

En este protocolo, se muestra cómo purificar, biotinylate y KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrámero puede ser utilizada para etiquetar KLRG1 ligandos por citometría de flujo. Aunque las condiciones de replegamiento tendrá que ser probado empíricamente para cada proteína, otras de tipo C-lectinas podrían ser tetramerized utilizando un protocolo similar. El uso de proteínas tetramerized como sondas, los ligandos para los receptores de lectina tipo huérfano C-podrían ser identificados.

<table><tbody><tr><td>Enzima y tampón BirA</td><td>Kit de biotinilación</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Tabletas completas de inhibidores de proteasas, sin EDTA</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Celda agitada Amicon</td><td>Equipo</td><td>EMD Millipore</td><td>Modelo #8400</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Membrana de ultrafiltración YM10 NMWL 10K</td><td>Material de filtración</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador YM10 de 15 ml</td><td>Material de filtración</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Equipo</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Columna de alta resolución Sephacryl S-200 16/60</td><td>Equipo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina PE</td><td>Reactivo</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>o equivalente</td></tr></tbody></table>

un protocolo para la producción de klrg1 tetramer

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Las células asesinas tipo lectina G1 receptor (KLRG1) es un tipo de receptores transmembrana II glicoproteína inhibitoria que pertenecen al tipo C-lectina como superfamilia. KLRG1 existe como monómero y como un homodímero disulfuro-ligado. Este receptor, bien conservada se encuentra en las células NK más madura y activa recientemente, así como en un subconjunto de células T efectoras / memoria. Utilizando KLRG1 tetrámero, así como otros métodos, E, N, R y-cadherinas fueron identificados como KLRG1 ligandos. Estos Ca 2 +-dependiente de la célula-célula moléculas de adhesión forma parte de un dominio extracelular que contiene cinco repeticiones cadherina responsables de las interacciones célula-célula, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que se vincula con el citoesqueleto de actina. Generación del tetrámero KLRG1 era esencial para la identificación de los KLRG1 ligandos. KLRG1 tetrámero es también una herramienta única para dilucidar la cadherina roles y jugar KLRG1 en la regulación de la respuesta inmune y la integridad del tejido.

Este protocolo describe la producción de KLRG1 tetrámero, que es una poderosa herramienta para el análisis de KLRG1 ligandos.

Un protocolo para la producción de KLRG1 Tetramer

El receptor inhibitorio G1 de la lectina similar a las células asesinas (KLRG1) es un receptor inhibitorio glucoproteico transmembrana de tipo II que pertenece a la superfamilia de lectinas similares al tipo C. ...

Hola, soy Stephanie Resi del laboratorio de Lauren Parce en el Departamento de Microbiología Molecular e Inmunología de la Universidad de Brown. Hoy les mostraremos un procedimiento para la generación de tetrámeros de K LRG uno. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las interacciones coherentes de K LRG uno.Comencemos. Primero, inocule cuatro matraces de 500 mililitros de tampón TB que contengan antibióticos apropiados con bacterias que expresen el constructo plasmídico K LRG uno y cultívelos a 37 grados Celsius con agitación hasta que la DO alcance 0,6 unidades a 600 nanómetros; induzca la expresión mediante el promotor T siete mediante la adición de IPTG 0,4 molar e incube el cultivo durante cuatro horas adicionales con agitación a 37 grados Celsius. Tras la incubación de cuatro horas, transfiera las bacterias a tubos de centrífuga y centrifugue los cultivos durante 20 minutos a 3000 RPM y 4 grados Celsius.Si es necesario, los pellet se pueden congelar a menos 80 grados Celsius en este momento para su uso en un momento posterior. Suspender las células recolectadas en 30 mililitros de tampón de suspensión Resus. A continuación, reunir las suspensiones bacterianas Resus hasta un volumen de 60 mililitros en un vaso de polipropileno.Si es necesario, a&ntilde;ada tamp&oacute;n TE pH 8 hasta completar un volumen total de 60 mililitros y agite la mezcla a media velocidad en una placa calefactora con agitaci&oacute;n magn&eacute;tica, mientras la suspensi&oacute;n de Resus en pool se agita. A&ntilde;ada gota a gota a la mezcla las siguientes soluciones: lisozima, cloruro de magnesio, D NS uno, TRITON X-100 y, finalmente, DTT.Transfiera la solución a tubos para ultracentrífuga utilizando un homogenizador con convertidor ultrasónico al 30 % de amplitud. Somete la solución a sonicación en hielo durante 1,5 minutos y centrifugue el lisado a 5.000 RPM durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, deseche el sobrenadante y agregue 15 mililitros de tampón de lavado. Repita la sonicación como antes hasta que el precipitado se resuspenda completamente y repita la centrifugación; repita los pasos de lavado y precipitación cinco veces.Finalmente, resuspenda el precipitado utilizando tampón de lavado que no contenga Triton X-100. Centrifugue una vez más y resuspenda en cuatro mililitros de tampón TE. Estos son sus cuerpos de inclusión.Cuantifique sus cuerpos de inclusión por peso húmedo. La suspensión de cuerpos de inclusión puede mantenerse a cuatro grados Celsius en soluciones amortiguadoras a concentraciones de 30 a 100 miligramos por mililitro. Con los cuerpos de inclusión listos, ahora puede prepararse para el plegamiento. Comience el procedimiento de plegamiento preparando un frasco fresco de un litro de tampón de plegamiento y agite a baja velocidad a cuatro grados Celsius para enfriarlo. A continuación, prepare siete inyecciones de los cuerpos de inclusión para inyectarlos en el tampón de plegamiento. Primero, derrita el stock de la suspensión de cuerpos de inclusión en un tubo de microcentrífuga que contenga un volumen final de 1,4 mililitros en clorhidrato de guanidina 7 M más 10 milimolares de β-mercaptoetanol en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 a 40 minutos.Agite en vórtex cada cinco minutos. Sabrá que la fusión está completa cuando la suspensión se vuelva transparente.Centrifugar la mezcla fundida a velocidad máxima durante 30 minutos en una microcentrífuga a cuatro grados Celsius. Luego, teniendo cuidado de no recoger ningún fragmento del pequeño sedimento oscurito. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mililitros.Ajuste el volumen a siete mililitros con tampón de inyección para inyectar. Primero, aumente la velocidad de agitación de la mezcla de plegamiento a alta. Luego agregue un mililitro de cuerpos de inclusión diluidos.Gotee gota a gota con dos segundos entre cada gota únicamente. Añada un mililitro de cuerpos de inclusión diluidos cada vez, con una hora de intervalo entre cada inyección. Vuelva a colocar la velocidad de agitación en baja o.Continúe agitando a baja velocidad a cuatro grados Celsius durante la noche. Las proteínas estarán listas entonces para la concentración y purificación. Para comenzar a concentrar los tetrámeros de KLRG1 plegados nuevamente.Primero, prefiltre la reacción utilizando un filtro de 0,22 micrómetros. Luego, concentre la reacción de un litro a aproximadamente 10 mililitros utilizando una celda agitada Millipore Amicon y una membrana de ultrafiltración con un límite nominal de peso molecular de 10 kilodaltonons, según las instrucciones del fabricante y de S. A continuación, utilizando una membrana de ultrafiltración Millipore con corte de peso molecular de 10 kilodaltonos, concéntrelo aún más hasta menos de o igual a dos mililitros.Configure el sistema de cromatografía según las instrucciones del fabricante. Utilizamos el sistema de cromatografía líquida de proteínas rápidas GE healthcare ACTA a cuatro grados Celsius con una columna de alta resolución. Purifique la forma monomérica de K lrg, en 20 milimolares de heaps y 150 milimolares de cloruro de sodio, mediante cromatografía de exclusión por tamaño.El volumen inyectado debe ser inferior al 2% del volumen total del gel de la columna. Nuevamente, utilizando una membrana de ultrafiltración de Millipore con un límite de corte de peso molecular de 10 kilodalton, concentrar hasta un volumen final de un mililitro según las instrucciones del fabricante. Eliminar la biotina libre mediante purificación como antes, usando cromatografía de exclusión por tamaño para obtener el tetrámero.Mezcle los monómeros de KL LRG uno con un exceso molar cuatro veces mayor de tetrámeros de estreptavidina conjugados con FICO. Ahora están disponibles para la marcación de ligandos receptores. Este gráfico muestra un resultado positivo de la separación de las proteínas de KL LRG uno plegadas nuevamente mediante cromatografía de exclusión por tamaño de izquierda a derecha. Los picos ilustran las formas multímero, dímero y monómero de KL LRG uno.El pico más a la derecha representa el intercambio de tampón. Aunque las condiciones de plegamiento deben probarse empíricamente para cada proteína, otros receptores de tipo lectina C deberían poder formar tetrámeros utilizando un protocolo similar, lo que permitiría la posible identificación de otros ligandos. Acabamos de mostrarle cómo generar el tetrámero de KLRG1 al realizar este procedimiento.Es importante recordar verificar los niveles de inducción y adherirse estrictamente a las condiciones de plegamiento. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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