Name: Preparación ósea descalcificados para histología, histomorfometría y Análisis Fluorocromo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende a preparar secciones óseas descalcificadas de alta calidad para histología, histomorfometría y análisis de fluorocromos. Este método permite estudiar la microarquitectura ósea mineralizada y celular en aplicaciones clínicas e investigación biomédica.

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Los autores desean agradecer la asistencia de la Sra. Sue Connell por su experiencia en la incrustación de resina y tumbas Sra. Stephania por su experiencia de laboratorio. Los autores desean agradecer al profesor Frank Kandziora y la Dra. Marie-Anne Polboth por sus consejos.

<ol><li> El tejido se coloca en un recipiente sellado que contiene un 10% de tampón fosfato solución de formalina al 3. Garantizar una mínima exposición a la luz, si el análisis fluorocromo se va a realizar, como los fluorocromos son sensibles a la luz. </li><li> Establecer que la orientación de los tejidos será necesario. </li><li> Desbastar la muestra con el tamaño, la orientación correcta, usando una sierra de cinta. Garantizar las medidas de seguridad se cumplen. La muestra se coloca en un recipiente opaco, el volumen de lo que debe ser de aproximadamente diez veces el tamaño de la muestra para lograr una adecuada fijación. El espécimen debe permanecer en la solución de formalina un total de entre una y dos semanas dependiendo de su tamaño. Se sugiere el uso de tejido de control para fines de prueba y optimización. </li><li> Compruebe que el tejido se ajusta al molde y coloque la incorporación de tejido en un recipiente sellado opaco que contiene 70% de etanol. </li><li> Proceso de tejido en forma ascendente las concentraciones de etanol, protección de la luz y con agitación constante. <ol class="lalpha"><li> Etanol al 70% una semana </li><li> Etanol al 80% una semana </li><li> 90% de etanol 1 semana </li><li> Etanol al 100% una semana </li></ol></li><li> El tejido se borra en butanol durante 1 semana, de nuevo blindaje de la luz y con agitación constante. </li><li> La densidad de la resina y el hueso debe ser muy igualados. La densidad de la resina se puede modificar (consulte el paso 8) y se recomienda incorporar un primera muestra de análisis para asegurar la densidad correcta. Usamos Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) para microscopía óptica y análisis fluorocromo. Si inmunohistoquímica se requiere una resina de alternativas debe ser utilizado como Technovit 9100 (Heraeus Kulzer). </li><li> La preparación de la solución Technovit 7100 puede ser mezclado con pequeñas partes alícuotas de la solución de ablandamiento suministrado con el kit, si es necesario, pero a no más de 5% el volumen de la preparación de la solución, en nuestra experiencia, la solución de ablandamiento es requerido en raras ocasiones. Partes iguales de etanol absoluto y Technovit base líquida de 7100 se mezclan y se aplica a los tejidos como una solución pre-infiltración durante 24 horas, se minimiza la exposición de luz y con agitación. </li><li> La solución de infiltración se hace entonces usando un endurecedor g I (= 1 bolsa) que se disuelve en 100 ml de líquido de base. Esto reemplaza la solución pre-infiltración y se le permite infiltrarse durante 1 semana en agitación constante. </li><li> Coloque el tejido en el molde, con la cara de superficie de corte hacia abajo. Asegurarse de que existe un margen (lo ideal es al menos 5 milímetros) en todo el tejido de la resina, lo que garantiza la fuerza del bloque. Mix 15mls de solución Technovit preparación 7100 con 1 ml de endurecedor II y verter alrededor de espécimen en el molde y se cubre por lo menos 5 millimietres. El curado se iniciará a las 2 horas, pero será completa durante la noche. </li><li> A continuación se realiza el montaje de configuración de un bloque de apoyo con Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mix Technovit 3040 en una proporción de volumen de 2 partes de polvo por parte de líquido 1 para obtener un líquido viscoso. Vierta Technovit 3040 en el hueco en la parte posterior del bloque a un nivel de al menos 2 mm por encima de la base del bloque. Después de 10 minutos el molde puede ser desprendido y el bloque está listo. </li><li> La densidad y por lo tanto las propiedades de corte de resina de metacrilato son susceptibles a la humedad del ambiente en la habitación. Por lo tanto, los bloques deben ser almacenados en un desecador. </li><li> Seccionamiento del suelo produce grandes secciones de 20-50 micrómetros de espesor. Es útil para el análisis de fluorocromo (véase la sección siguiente) como las secciones más gruesas producen fluorescencia más brillante. Asegure la cuchilla de diamante para macrotome. Agregue lubricante, como el espíritu de petróleo a la reserva en el macrotome. Asegure el bloque de la pinza y orientar a la hoja. Permiten moler a ocurrir lentamente (aproximadamente 20-30 minutos por sección) asegurar una lubricación adecuada. La primera sección expone la cara de corte y orienta la sección-que debe ser desechada. </li><li> La siguiente sección se coloca en un portaobjetos Superfrost Plus. El tramo tiene una tendencia a enrollarse por lo que recomendamos colocar una porción de una bolsa de más de ella y luego mantenerla plana con otra diapositiva sujeta en su lugar. Luego se coloca en una incubadora de entre 60-80 grados Celsius durante 1 hora. Esto ablanda el metacrilato y ayuda a la sección de adherirse a la diapositiva de una manera plana. </li><li> La sección de la tierra puede ser limpiado y pulido de materiales mediante lija de grano fino de una manera suave. </li><li> El microtomo trineo cortes de secciones delgadas, que ofrece las mejores secciones de microsocopy luz. Use un microtomo trineo, ya que ha añadido la rigidez, lo que se requiere para el corte de los bloques duros. Alternativamente, un micrótomo rotatorio alimentado puede ser utilizado. Utilizar una cuchilla de acero inoxidable. Es preferible tener dos hojas a disposición como puede ser afiladas como el otro se usa. La hoja debe hacer un ángulo de 45 grados con el bloque. Suablandamiento rface se puede lograr mediante la aplicación de un papel mojado en el bloque si es necesario. Puede tomar varias secciones para lograr las condiciones de corte deseado para obtener una sección de calidad. La sección se presentó en ese entonces en un baño de agua y se coloca en una diapositiva como en el 16. </li><li> Reactivos de tinción se enumeran en los materiales a continuación. Protocolos se basan en 4 Bancroft et al. Debido a las variaciones de espesor se recomienda optimizar las manchas en los portaobjetos. Tinción bastidor puede causar que el tejido de flotar fuera de la diapositiva así que la adición de las manchas directamente a una compuerta plana puede ser requerida. Un protocolo idéntico o manchas bastidor es necesario para obtener resultados consistentes tinción necesarios para histomorfometría. <ol class="lalpha"><li> Hematoxilina y eosina <ol class="lroman"><li> Mancha con Haematoxyilin 5-10 minutos </li><li> Lavar bien con agua del grifo de Scott s </li><li> Se tiñen con eosina 5 minutos </li><li> Lavar con agua corriente </li><li> Aclarar en xileno </li><li> Montar </li><li> Resultados <ol><li> Osteoide = rosa </li><li> Hueso calcificado = marrón morado </li><li> Núcleos = azul </li></ol></li></ol></li><li> Von Kossa <ol class="lroman"><li> Lugar en la solución de nitrato de plata y exponer a la luz fuerte hasta que el hueso mineralizado se vuelve negro (aprox. 10 minutos) </li><li> Lave con agua destilada tres veces </li><li> Amenaza con tiosulfato de sodio durante 5 minutos </li><li> Lave con agua destilada </li><li> De contraste con Safrinin O </li><li> Aclarar en xileno </li><li> Montar </li><li> Resultados <ol><li> Hueso mineralizado = negro </li><li> Osteoide = rojo / rosado </li></ol></li></ol></li><li> Masson Goldner s tricrómica <ol class="lroman"><li> Lavar con alcohol alcalina (90mls de etanol al 80% y 10ml de 25% de amoníaco durante 20 minutos) </li><li> Enjuague con agua </li><li> Enjuague con agua destilada </li><li> Tinción con hematoxilina de Weigert s durante 10 minutos </li><li> Enjuague con agua destilada </li><li> Tinción con Ponceau-fucsina solución últimos 5 minutos </li><li> Enjuague con 1% de ácido acético 15 segundos </li><li> Mancha en fosfomolíbdico ácido-naranja solución G 5 minutos </li><li> Enjuague con 1% de ácido acético 15 segundos </li><li> Mancha con la luz verde 5 minutos </li><li> Enjuague con 1% de ácido acético al 3 cambios </li><li> Enjuague con agua destilada </li><li> Montar </li><li> Resultados <ol><li> Hueso mineralizado = verde </li><li> Osteoide = rojo / naranja </li><li> Núcleos = azul gris </li><li> Cartílago = púrpura </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Preparaciones fluorocromo: </li><li> Estos se administran por inyección intravenosa lenta, por lo menos dos semanas de diferencia. </li><li> Dosis <ol class="lalpha"><li> Calceína Verde 10 mg / kg IV </li><li> Oxitetraciclina 50 mg / kg IV </li><li> Alizarina complexona 30 mg / kg IV </li></ol></li><li> Preparación de calceína Verde <ol class="lalpha"><li> Un gramo de calceína Verde se titula con NaOH 1 M hasta que se disuelva. </li><li> pH se ajusta con un 1% NaOH hasta pH = 7.1-7.2. </li><li> Filtro y mantener a salvo de la luz </li></ol></li><li> Preparación de alizarina complexona <ol class="lalpha"><li> Tres gramos de alizarina complexona se titula con NaOH 1 M hasta que se disuelva. </li><li> pH se ajusta con un 1% HCl o NaOH hasta pH = 7.1-7.2. </li><li> Filtro y mantener a salvo de la luz </li></ol></li><li> Preparación de oxitetraciclina <ol class="lalpha"><li> Oxitetraciclina está disponible como fuera de la plataforma anti-microbiana de drogas. No requiere preparación. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerr%2C+J+%22Atlas+of+Functional+Histology%22">Atlas of Functional Histology</a>. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).</li>
<li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry%3A+standardization+of+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li>
<li>An, Y. H., Martin, K. l <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAn%2C+YH+%22Handbook+of+histology+methods+for+bone+and+cartilage%22">Handbook of histology methods for bone and cartilage</a>. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).</li>
<li>Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).</li>
</ol>

Disolventes: <ul><li> 10% normal formol, etanol, xileno y butanol ácido Todos los histología de grado, sin azufre. GRALE Ciencia Pty Ltd. http://www.grale.com.au </li></ul> Moldes: <ul><li> Despegue, moldes de plástico GRALE Científico </li></ul> Diapositivas: <ul><li> Superfrost Plus portaobjetos Lomb Ciencia Pty Ltd. <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> Resina: <ul><li> GlycolMethacrylate Technovit 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Respaldo de bloques de resina Technovit 3040 bloques Histo Heraeus Kulzer </li></ul> Las manchas (Reactivos de GRALE Científica) Tricrómico de Goldner mancha </li> 1. Férrica de Weigert hematoxilina (DeGroat) <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) hematoxilina solución </td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> 1g </td></tr><tr><td> El alcohol absoluto </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Solución de Hierro </td></tr><tr><td> 30% de cloruro férrico acuoso </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> El ácido clorhídrico (concentrado) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> agua destilada </td><td> 95mL </td></tr></table> Filtra y se añade a un volumen igual de hematoxilina inmediatamente antes de utilizar la mancha. 2. Ponceau-fucsina-azophloxin soluciones de archivo <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Ponceau xilidina de solución </td></tr><tr><td> Ponceau de xilidina </td><td> 0,75 g </td></tr><tr><td> ácido fuchsion </td><td> 0,25 g </td></tr><tr><td> El ácido acético </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mezclar y añadir agua destilada (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) azophloxin solución </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> El ácido acético </td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mezclar y añadir agua destilada (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> c) Solución de trabajo de final de la mancha </td></tr><tr><td> Ponceau-fucsina solución </td><td> 5-10mL </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 0,2% de solución de ácido acético </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. Solución La luz verde <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Luz verde </td><td> 1g </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezclar y añadir agua destilada (500 ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic ácido-Orange G solución <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Fosfomolíbdico ácido </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Orange G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> Se disuelven en 500 ml de agua destilada y añadir timol cristal. </td></tr></table> Von Kossa <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1% de nitrato de plata acuoso </td></tr><tr><td> 2,5% de tiosulfato de sodio </td></tr><tr><td> 1% safranina O </td></tr></table> Alcian mancha azul <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alcian blue 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% de solución de ácido acético </td><td> 100 ml </td></tr></table> Hematoxilina y eosina <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) hematoxilina de Harris </td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> 2.5g </td></tr><tr><td> Alcohol absoluto </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> Alumbre de potasio </td><td> 50g </td></tr><tr><td> agua destilada </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> óxido de mercurio </td><td> 1,25 g O </td></tr><tr><td> El yodato de sodio </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Eosina solución </td></tr><tr><td colspan="2"> Eosina producidos comercialmente se utilizó. </td></tr></table> Todos los polvos colorantes mancha se Gurr polvos colorantes. Todos los reactivos son reactivos para análisis, y no reactivos de laboratorio Fluorocromos <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Fabricante </td><td> Fluorocromo </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Calceína Verde </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarina complexona </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Australia, Victoria </td><td> Oxitetraciclina (De la droga útil a los antimicrobianos) </td><td> Nombre comercial; Engemycin 100 </td></tr></table>

preparación ósea descalcificados para histología, histomorfometría y análisis fluorocromo

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Histología ósea descalcificados demuestra la microarquitectura del hueso. Muestra tanto los componentes mineralizados y celular del hueso, que proporciona información vital sobre el recambio óseo o formación y resorción ósea. Esto tiene una importancia enorme en una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Se produce bellas imágenes 1 y permite técnicas tales como la evaluación y el fluorocromo histomorfometría 2. Análisis fluorocromo es una técnica donde los tintes fluorescentes que se unen al calcio se inyectan en un momento determinado punto, lo que permite la cuantificación de la cantidad de mineralización en ese momento dado. Histomorfometría es un proceso de cuantificación de hueso a nivel microscópico. Realización de la histología del hueso descalcificados es técnicamente difícil, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Se requiere de variaciones en la técnica de los utilizados en parafina estándar integrado histología. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos. La preparación de muestras, fijación y el procesamiento se obtienen con una forma similar a otros tejidos blandos, sin embargo debido a la densidad y baja permeabilidad de los huesos mucho más tiempo de fijación y los tiempos de procesamiento se requieren, a menudo tomando durante varias semanas. Incrustación se logra utilizando un medio de soporte con una dureza similar o igual y la densidad de los huesos, tales como resinas basadas en metacrilato, pero a diferencia de la infiltración de parafina y la inclusión, este es un paso irreversible. Seccionamiento se puede lograr mediante molienda que produce una sección más gruesa, lo cual es óptimo para los estudios como el análisis de fluorocromo. Esto se logra mejor usando una cuchilla de diamante en una macrotome. Por otra parte, las secciones más finas pueden ser producidos por microscopía de luz y esto se logra utilizando un micrótomo de trineo con una cuchilla muy afilada. El microtomo trineo ofrece la mayor resistencia y estabilidad necesaria para los bloques grandes y duras. Resina incrustada secciones se pueden teñir con una variedad de manchas, que se demuestran.

Histología ósea descalcificados proporciona información importante para una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Es un desafío técnico, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos.

Preparación ósea descalcificados para histología, histomorfometría y Análisis Fluorocromo

La histología de hueso no descalcificado demuestra la microarquitectura ósea. Muestra tanto los componentes mineralizados como los celulares del hueso, lo que proporciona...

Y la histología de hueso descalcificado demuestra la microarquitectura ósea, mostrando tanto los componentes mineralizados como celulares del hueso, proporcionando información esencial sobre el recambio óseo o la formación y resorción ósea. Esto tiene una importancia considerable en una variedad de aplicaciones clínicas e investigativas. Ofrece imágenes detalladas y permite técnicas como la evaluación con fluorescencia y la histo-optometría.Realizar histología de hueso debajo del tejido calcificado es técnicamente desafiante, particularmente con especímenes de gran tamaño. Este video demostrará las dificultades técnicas y los métodos para superarlas al obtener secciones de hueso bajo calcificación. No abordará la evaluación histomorfométrica de estas secciones.Para ello, le remitimos a la siguiente publicación importante. Este video cubrirá la preparación del espécimen y el procesamiento de fijación, inclusión y seccionado, tanto por vía plana como por corte, así como la preparación de portaobjetos y la tinción tras la recolección del tejido. El espécimen.En este caso, la columna cervical de oveja se coloca en un recipiente hermético y opaco que contiene una solución tamponada con fosfato al 10%. Debe haber una exposición mínima a la luz si se va a realizar un análisis de fluorocromo. Dado que los fluorocromos son sensibles a la luz, la muestra se lleva entonces al laboratorio y se recorta al tamaño adecuado, lo cual mejora la fijación y asegura que quepa en un bloque.Aunque en este momento es necesario conocer la orientación del tejido en el portaobjetos para que el bloque pueda prepararse en el plano correcto. La seguridad es muy importante y los instrumentos deben usarse de manera que las manos se mantengan alejadas de la hoja. Su área de interés ahora se recorta al tamaño adecuado.A continuación, se realiza el recorte final con una sierra de cinta más pequeña, lo que resulta en una menor pérdida de tejido. Una vez que se ha cortado un bloque al tamaño adecuado, se coloca en un recipiente hermético y opaco que contiene fórmula fresca para completar la fijación. El volumen del recipiente debe ser aproximadamente 10 veces el tamaño del espécimen. Para lograr una fijación adecuada, el espécimen debe permanecer en la fórmula y solución entre una y dos semanas, dependiendo de su tamaño, tras lo cual se transfiere al 70% de etanol. A continuación, se realiza el procesamiento de manera lenta, ya que el gran tamaño de los bloques y la baja permeabilidad del hueso dificultan la difusión lenta de los solventes. Luego se lleva a cabo la deshidratación utilizando concentraciones crecientes de etanol y posteriormente la aclaración en butanol. El espécimen se mantiene protegido de la luz y bajo agitación constante.Recomendamos aproximadamente una semana en cada solución. Por lo tanto, el procesamiento lleva alrededor de cuatro a seis semanas. Este proceso no debe apresurarse, ya que comprometería la calidad final de las secciones.Existen diversas opciones de inclusión disponibles para hueso calcificado. La elección de la resina o metacrilato depende de lo que se vaya a analizar. Por ejemplo, la inmunohistoquímica no es posible con todas las resinas.Las resinas epoxi requieren luz UV para el curado, lo cual interferiría con el análisis de fluorocromos. Recomendamos consultar las especificaciones del fabricante antes de realizar una selección cuidadosa. Utilizamos TEVI 7, 100 porque permite obtener cortes y secciones pulidas adecuadas para microscopía óptica y análisis de fluorocromos, además de ser económicamente eficiente.La consideración importante con la inclusión es que la densidad del hueso y la densidad del medio de inclusión deben ser muy similares. Esto es muy importante al cortar posteriormente los bloques, particularmente para seccionado microscópico. La mezcla se prepara según las instrucciones del fabricante y se agita vigorosamente. Puede ser conveniente incluir muestras desnudas de prueba para optimizar el protocolo.A diferencia del parafina, este es un paso irreversible. Los bloques se colocan con la superficie de corte hacia abajo dentro del molde. El molde será más grande que el bloque para proporcionar soporte y resistencia.La infiltración con metacrilato debe realizarse lentamente para permitir una infiltración máxima del metacrilato en el hueso. Nuevamente, se debe minimizar la exposición a la luz. Después de una semana con una solución de infiltración, se cambia la solución de infiltración y se añade la solución endurecedora.Luego se fabrica una placa de soporte. Para ello, utilizamos tevit 30 40. A continuación, se separa el molde y el bloque ya está listo. El corte por abrasión produce secciones más grandes, con un grosor entre 20 y 50 micrones. Es útil para el análisis de fluorescencia, ya que secciones más gruesas generan una fluorescencia más intensa. Para obtener la sección por abrasión, se necesita un microtomo, preferiblemente con una cuchilla de diamante. Utilizamos una cuchilla de diamante curva de 0,6 milímetros.Un lubricante es imprescindible. Preferimos un lubricante a base de petróleo, aunque los lubricantes a base de silicona también funcionan bien. A continuación, se coloca el bloque en la abrazadera.Se fija en el portaobjetos macro y el bloque se avanza hacia la cuchilla. La primera sección expone la cara de corte y orienta el corte. Debe descartarse.La molienda es un proceso lento y no debe apresurarse. Se debe asegurar una lubricación adecuada durante la molienda de la sección. Luego se coloca sobre un portaobjetos.Se puede limpiar y pulir según sea necesario. La sección tiende a enrollarse, por lo que recomendamos colocar una porción de una bolsa para sándwich sobre ella y mantenerla plana, con otra portaobjetos colocada encima.Luego se coloca en un incubador entre 60 y 80 grados Celsius durante una hora. Esto ablanda un metacrilato y ayuda a que la sección se adhiera al portaobjetos de manera plana. Aquí observamos una imagen fluorescente compuesta de tres fluorocromos diferentes inyectados a intervalos mensuales.Esto permite la identificación del sitio de mineralización en un momento específico. Las dosis y la preparación de estas etiquetas se pueden encontrar en el texto. El término micro proporciona secciones delgadas, lo cual es ideal para microscopía óptica.Es un proceso técnicamente desafiante. Sugerimos utilizar un microtomo de cuchilla deslizante por la mayor resistencia que proporciona al cortar estos bloques duros. Se pueden usar diversos tipos de cuchillas, incluyendo cuchillas de carburo de tungsteno.Sin embargo, recomendamos una cuchilla de acero inoxidable, ya que esta puede ser reafilada fácilmente y con frecuencia según sea necesario. La cuchilla debe orientarse de modo que forme un ángulo de 45 grados con un bloque. La densidad del metacrilato es susceptible a muchos factores, incluyendo la humedad ambiental en la habitación.Por lo tanto, el bloque debe almacenarse en una superficie desecante. Si es necesario, la ablandamiento puede lograrse aplicando un papel húmedo al bloque; puede ser necesario realizar varias secciones para alcanzar las condiciones adecuadas de corte y obtener una sección de calidad. Nuevamente, la bolsa tipo sándwich y el portaobjetos adicional se sujetan para aplanar la sección antes de colocarla en la incubadora.La tinción es similar a la histología estándar con inclusión en parafina, excepto que obviamente no se requiere la parafinación. Las tinciones comunes utilizadas para el hueso incluyen VSA con contratiñido de safranina, safranina, verde luz de ol, y másson tricrómica. El protocolo para estas se menciona en el texto.Los reactivos se seleccionan y filtran antes de su uso. Golden. La tinción se utiliza frecuentemente para optometría histológica. Recomendamos optimizar las tinciones primero en portaobjetos de prueba.Después de cada paso, se puede observar la preparación al microscopio para asegurar las coloraciones correctas. Esto permite determinar los tiempos adecuados para cada tinción componente. Una vez optimizado el patrón de tinción, todas las preparaciones del experimento se tiñen simultáneamente en una gradilla con el mismo protocolo, para evitar que la variabilidad en la tinción afecte su geometría térmica.A continuación, las laminillas se cubrirán de forma estándar. Le deseamos suerte con su experimento.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Identificación de inmuno periféricos subtipos de fibras nerviosas sensoriales (y la detección de la expresión de proteínas en ella) son fundamentales para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la sensación periférica. A continuación se describen los métodos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral, como los huesos y la piel del miembro, por inmunotinción específica de las fibras nerviosas sensoriales periféricas.

Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

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Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Hemos desarrollado dos conjuntos de rastreo de combinaciones en Rosa26 tdtomato (ubicuamente expresado en todas las células) / Cre (expresa específicamente en condrocitos) ratones: uno con 2.3Col1a1-GFP (específico para los osteoblastos) y uno con inmunofluorescencia (específico de células óseas). Los datos demuestran la transformación directa de los condrocitos en las células óseas.

Co-localización de los marcadores de linaje de la célula y la señal de tomate

El cultivo ex vivo de explantes óseos puede ser una herramienta valiosa para el estudio de la fisiología ósea y la evaluación potencial de fármacos en la remodelación ósea y enfermedades óseas. El protocolo presentado describe la preparación y el cultivo de calvarias aisladas de cráneos de ratones recién nacidos, así como sus aplicaciones.

Medición de la remodelación ósea y recreación del microambiente tumor-óseo utilizando la cocultura calvaria y la histomorfometría

Aquí, presentamos un protocolo detallado para detectar y cuantificar los niveles de proteínas durante la morfogénesis/patogénesis craneofacial mediante inmunoutilización utilizando tejidos craneofaciales de ratón como ejemplos. Además, describimos un método para la preparación y criosección de tejidos duros no descalcificados de ratones jóvenes para inmunostaining.

Preparación de tejidos e inmunomanchación de tejidos craneofaciales de ratón y hueso no descalcificado

Los adipocitos existen en depósitos discretos y tienen diversos roles dentro de sus microambientes únicos. A medida que se descubren las diferencias regionales en el carácter y la función de los adipocitos, la identificación y el aislamiento estandarizados de los depósitos es crucial para el avance del campo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la escisión de varios depósitos adiposos de ratón.

Identificación y disección de diversos depósitos de adipose de ratón

Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para el establecimiento de una fractura diafisaria en el fémur de ratones, que se estabiliza con un alambre intramedular, para estudios de cicatrización de fracturas.

Establecimiento de un modelo de fractura de fémur diafisario en ratones

Este protocolo presenta un modelo de ratón estandarizado de expansión de sutura y un método de visualización 3D para estudiar los cambios mecanobiológicos de la sutura y la remodelación ósea bajo carga de fuerza de tracción.

Una técnica de visualización en 3D para la remodelación ósea en un modelo de ratón de expansión de sutura

Este protocolo presenta un método económico y eficiente para la evaluación cuantitativa de la microarquitectura ósea en un modelo murino de osteoporosis mediante la combinación de técnicas de tinción de hematoxilina-eosina (HE) y microtomografía computarizada (Micro-CT).

Evaluación de la microarquitectura ósea trabecular en un modelo murino de osteoporosis

En este trabajo describimos un método que permite la descalcificación de los tejidos óseos recién obtenidos y la conservación de ARN de alta calidad. También se ilustra un método para seccionar muestras de huesos no desmineralizados con formalina fija (FFPE) para obtener resultados de buena calidad si no se dispone de tejidos frescos o no se pueden recolectar.

Métodos para permitir la transcriptómica espacial de los tejidos óseos

Este protocolo incluye un flujo de trabajo paso a paso para muestras vasculares calcificadas: manipulación de tejidos, descalcificación, validación de ARN, detección de niveles de calcificación y estrategias de selección de regiones de interés en el Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). El objetivo es presentar un método integral para preservar la morfología del tejido vascular y el ARN para un análisis transcriptómico espacial fiable.

Preparación y procesamiento de arterias calcificadas con morfología y ARN preservados para perfilado espacial digital

Aprende a preparar secciones óseas descalcificadas de alta calidad para histología, histomorfometría y análisis de fluorocromos. Este método permite estudiar la microarquitectura ósea mineralizada y celular en aplicaciones clínicas e investigación biomédica.

Preparación ósea descalcificados para histología, histomorfometría y Análisis Fluorocromo

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