Preparación ósea descalcificados para histología, histomorfometría y Análisis Fluorocromo
8 de enero de 2010
Histología ósea descalcificados proporciona información importante para una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Es un desafío técnico, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos.
Y la histología de hueso descalcificado demuestra la microarquitectura ósea, mostrando tanto los componentes mineralizados como celulares del hueso, proporcionando información esencial sobre el recambio óseo o la formación y resorción ósea. Esto tiene una importancia considerable en una variedad de aplicaciones clínicas e investigativas. Ofrece imágenes detalladas y permite técnicas como la evaluación con fluorescencia y la histo-optometría.
Realizar histología de hueso debajo del tejido calcificado es técnicamente desafiante, particularmente con especímenes de gran tamaño. Este video demostrará las dificultades técnicas y los métodos para superarlas al obtener secciones de hueso bajo calcificación. No abordará la evaluación histomorfométrica de estas secciones.
Para ello, le remitimos a la siguiente publicación importante. Este video cubrirá la preparación del espécimen y el procesamiento de fijación, inclusión y seccionado, tanto por vía plana como por corte, así como la preparación de portaobjetos y la tinción tras la recolección del tejido. El espécimen.
En este caso, la columna cervical de oveja se coloca en un recipiente hermético y opaco que contiene una solución tamponada con fosfato al 10%. Debe haber una exposición mínima a la luz si se va a realizar un análisis de fluorocromo. Dado que los fluorocromos son sensibles a la luz, la muestra se lleva entonces al laboratorio y se recorta al tamaño adecuado, lo cual mejora la fijación y asegura que quepa en un bloque.
Aunque en este momento es necesario conocer la orientación del tejido en el portaobjetos para que el bloque pueda prepararse en el plano correcto. La seguridad es muy importante y los instrumentos deben usarse de manera que las manos se mantengan alejadas de la hoja. Su área de interés ahora se recorta al tamaño adecuado.
A continuación, se realiza el recorte final con una sierra de cinta más pequeña, lo que resulta en una menor pérdida de tejido. Una vez que se ha cortado un bloque al tamaño adecuado, se coloca en un recipiente hermético y opaco que contiene fórmula fresca para completar la fijación. El volumen del recipiente debe ser aproximadamente 10 veces el tamaño del espécimen.
Para lograr una fijación adecuada, el espécimen debe permanecer en la fórmula y solución entre una y dos semanas, dependiendo de su tamaño, tras lo cual se transfiere al 70% de etanol. A continuación, se realiza el procesamiento de manera lenta, ya que el gran tamaño de los bloques y la baja permeabilidad del hueso dificultan la difusión lenta de los solventes. Luego se lleva a cabo la deshidratación utilizando concentraciones crecientes de etanol y posteriormente la aclaración en butanol. El espécimen se mantiene protegido de la luz y bajo agitación constante.
Recomendamos aproximadamente una semana en cada solución. Por lo tanto, el procesamiento lleva alrededor de cuatro a seis semanas. Este proceso no debe apresurarse, ya que comprometería la calidad final de las secciones.
Existen diversas opciones de inclusión disponibles para hueso calcificado. La elección de la resina o metacrilato depende de lo que se vaya a analizar. Por ejemplo, la inmunohistoquímica no es posible con todas las resinas.
Las resinas epoxi requieren luz UV para el curado, lo cual interferiría con el análisis de fluorocromos. Recomendamos consultar las especificaciones del fabricante antes de realizar una selección cuidadosa. Utilizamos TEVI 7, 100 porque permite obtener cortes y secciones pulidas adecuadas para microscopía óptica y análisis de fluorocromos, además de ser económicamente eficiente.
La consideración importante con la inclusión es que la densidad del hueso y la densidad del medio de inclusión deben ser muy similares. Esto es muy importante al cortar posteriormente los bloques, particularmente para seccionado microscópico. La mezcla se prepara según las instrucciones del fabricante y se agita vigorosamente. Puede ser conveniente incluir muestras desnudas de prueba para optimizar el protocolo.
A diferencia del parafina, este es un paso irreversible. Los bloques se colocan con la superficie de corte hacia abajo dentro del molde. El molde será más grande que el bloque para proporcionar soporte y resistencia.
La infiltración con metacrilato debe realizarse lentamente para permitir una infiltración máxima del metacrilato en el hueso. Nuevamente, se debe minimizar la exposición a la luz. Después de una semana con una solución de infiltración, se cambia la solución de infiltración y se añade la solución endurecedora.
Luego se fabrica una placa de soporte. Para ello, utilizamos tevit 30 40. A continuación, se separa el molde y el bloque ya está listo.
El corte por abrasión produce secciones más grandes, con un grosor entre 20 y 50 micrones. Es útil para el análisis de fluorescencia, ya que secciones más gruesas generan una fluorescencia más intensa. Para obtener la sección por abrasión, se necesita un microtomo, preferiblemente con una cuchilla de diamante. Utilizamos una cuchilla de diamante curva de 0,6 milímetros.
Un lubricante es imprescindible. Preferimos un lubricante a base de petróleo, aunque los lubricantes a base de silicona también funcionan bien. A continuación, se coloca el bloque en la abrazadera.
Se fija en el portaobjetos macro y el bloque se avanza hacia la cuchilla. La primera sección expone la cara de corte y orienta el corte. Debe descartarse.
La molienda es un proceso lento y no debe apresurarse. Se debe asegurar una lubricación adecuada durante la molienda de la sección. Luego se coloca sobre un portaobjetos.
Se puede limpiar y pulir según sea necesario. La sección tiende a enrollarse, por lo que recomendamos colocar una porción de una bolsa para sándwich sobre ella y mantenerla plana, con otra portaobjetos colocada encima.
Luego se coloca en un incubador entre 60 y 80 grados Celsius durante una hora. Esto ablanda un metacrilato y ayuda a que la sección se adhiera al portaobjetos de manera plana. Aquí observamos una imagen fluorescente compuesta de tres fluorocromos diferentes inyectados a intervalos mensuales.
Esto permite la identificación del sitio de mineralización en un momento específico. Las dosis y la preparación de estas etiquetas se pueden encontrar en el texto. El término micro proporciona secciones delgadas, lo cual es ideal para microscopía óptica.
Es un proceso técnicamente desafiante. Sugerimos utilizar un microtomo de cuchilla deslizante por la mayor resistencia que proporciona al cortar estos bloques duros. Se pueden usar diversos tipos de cuchillas, incluyendo cuchillas de carburo de tungsteno.
Sin embargo, recomendamos una cuchilla de acero inoxidable, ya que esta puede ser reafilada fácilmente y con frecuencia según sea necesario. La cuchilla debe orientarse de modo que forme un ángulo de 45 grados con un bloque. La densidad del metacrilato es susceptible a muchos factores, incluyendo la humedad ambiental en la habitación.
Por lo tanto, el bloque debe almacenarse en una superficie desecante. Si es necesario, la ablandamiento puede lograrse aplicando un papel húmedo al bloque; puede ser necesario realizar varias secciones para alcanzar las condiciones adecuadas de corte y obtener una sección de calidad. Nuevamente, la bolsa tipo sándwich y el portaobjetos adicional se sujetan para aplanar la sección antes de colocarla en la incubadora.
La tinción es similar a la histología estándar con inclusión en parafina, excepto que obviamente no se requiere la parafinación. Las tinciones comunes utilizadas para el hueso incluyen VSA con contratiñido de safranina, safranina, verde luz de ol, y másson tricrómica. El protocolo para estas se menciona en el texto.
Los reactivos se seleccionan y filtran antes de su uso. Golden. La tinción se utiliza frecuentemente para optometría histológica. Recomendamos optimizar las tinciones primero en portaobjetos de prueba.
Después de cada paso, se puede observar la preparación al microscopio para asegurar las coloraciones correctas. Esto permite determinar los tiempos adecuados para cada tinción componente. Una vez optimizado el patrón de tinción, todas las preparaciones del experimento se tiñen simultáneamente en una gradilla con el mismo protocolo, para evitar que la variabilidad en la tinción afecte su geometría térmica.
A continuación, las laminillas se cubrirán de forma estándar. Le deseamos suerte con su experimento.
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Resumen
La histología de hueso sin descalcificar es fundamental para comprender la microarquitectura ósea, incluyendo los componentes mineralizados y celulares. Este video ilustra los desafíos técnicos y los métodos para producir secciones de calidad a partir de especímenes grandes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Historia ósea
- Aplicaciones clínicas
- Metodologías de investigación
Antecedentes
- El recambio y la formación ósea son vitales para la salud.
- Las secciones sin descalcificar proporcionan imágenes detalladas de la estructura ósea.
- Técnicas como la evaluación con fluoruro mejoran el análisis.
- Surgen dificultades con especímenes grandes en la preparación histológica.
Objetivo del estudio
- Demostrar el proceso de obtención de secciones óseas de calidad sin descalcificar.
- Destacar las dificultades técnicas en la preparación histológica.
- Proporcionar soluciones para superar estos desafíos.
Métodos Utilizados
- Preparación de especímenes de hueso sin descalcificar.
- Técnicas para seccionar especímenes grandes.
- Métodos de evaluación visual.
- Demuestra técnicas histológicas.
Resultados principales
- Producción exitosa de secciones óseas de alta calidad.
- Identificación de desafíos técnicos comunes.
- Métodos efectivos para superar dificultades de preparación.
- Comprensión mejorada de la microarquitectura ósea.
Conclusiones
- La histología de hueso sin descalcificar es esencial para aplicaciones clínicas y de investigación.
- Los desafíos técnicos pueden gestionarse eficazmente con métodos adecuados.
- Las secciones de calidad proporcionan información valiosa sobre la salud ósea.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La histología de hueso sin descalcificar permite la visualización directa de los componentes mineralizados y celulares del hueso, proporcionando datos fundamentales sobre el recambio, formación y reabsorción ósea. Este enfoque facilita la validación de objetivos en modelos de enfermedades esqueléticas al preservar la arquitectura tisular nativa para análisis cuantitativo. El método aumenta la confianza predictiva en estudios preclínicos al permitir la evaluación longitudinal de la dinámica de mineralización mediante marcado con fluorocromos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas al preservar tanto los compartimentos óseos mineralizados como celulares para el análisis mecanicista.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la observación directa de los procesos de formación y reabsorción ósea en especímenes relevantes para la enfermedad.
- Valor traslacional: Facilita la confianza en el blanco al permitir la correlación entre puntos finales histológicos y resultados funcionales en modelos preclínicos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona resultados cuantitativos de histomorfometría y análisis de fluorocromos para la evaluación estandarizada de las tasas de mineralización ósea.
- Valor operativo: Permite la reproducibilidad del ensayo mediante protocolos estandarizados de seccionado, tinción e imagenología aplicables a flujos de trabajo con grandes cantidades de especímenes.
- Valor traslacional: Facilita la preparación para cribado al generar datos cuantitativos de mineralización con resolución temporal, adecuados para la evaluación de compuestos en farmacología esquelética.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Ofrece continuidad en sistemas relevantes para enfermedades al permitir el seguimiento longitudinal del recambio óseo desde la etapa de descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Valor operativo: Aborda decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la entrega de datos cuantitativos y validados histomorfométricamente sobre el fenotipo óseo.
- Valor traslacional: Mejora la reducción predictiva de riesgos mediante la correlación directa de los patrones de marcado con fluorocromos con eventos temporales de mineralización en estudios de intervención terapéutica.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación de compuestos activos y las pruebas de eficacia preclínica, particularmente para terapéuticas dirigidas al hueso y la farmacología de seguridad esquelética.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la visualización directa de la actividad de osteoblastos y osteoclastos en tejido sin descalcificar.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante protocolos estandarizados de seccionado por corte y pulido que generan resultados cuantificables de fluorescencia y de histomorfometría.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes, incluyendo la tasa de aposición mineral, la tasa de formación ósea y las cronologías de mineralización derivadas de fluorocromos, para comparaciones entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica al permitir la evaluación longitudinal de la dinámica del recambio óseo, fundamental para la validación de modelos de enfermedades esqueléticas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de histología reutilizable para programas de farmacología esquelética mediante protocolos estandarizados de inclusión en resina, seccionado y tinción aplicables a múltiples modelos óseos y modalidades terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante evaluación directa y cuantitativa de la formación y la reabsorción ósea sin artefactos de descalcificación.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante protocolos validados de inclusión, corte y tinción para especímenes grandes y densos.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción en el desarrollo de terapias esqueléticas al reducir la ambigüedad mecanicista en los puntos finales del recambio óseo.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de candidatos dirigidos al hueso mediante señales preclínicas de eficacia y seguridad validadas histomorfométricamente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología ósea, técnicas de inclusión en resina y protocolos de manejo de fluorocromos.
- Necesita instrumentación especializada, incluyendo microtomos de cuchilla deslizante, macrotomos con hoja de diamante y entornos de procesamiento protegidos de la luz para garantizar la estabilidad de los fluorocromos.
- Exige la estandarización entre equipos de los tiempos de fijación, deshidratación e infiltración para asegurar la calidad de los cortes en especímenes grandes y de baja permeabilidad.
- Implica consideraciones de adaptación para densidades óseas y tamaños de espécimen variables, lo que requiere medios de inclusión compatibles con la densidad y tiempos de procesamiento prolongados.
- Incluye limitaciones prácticas, como pasos de inclusión irreversibles, sensibilidad a la luz de los fluorocromos y artefactos de enrollamiento de los cortes que requieren aplanamiento mecánico durante el montaje.
