A reversible, método no invasivo para las mediciones de resistencia de las vías y Toma de Muestras Líquido del Lavado broncoalveolar en ratones

Antes de iniciar este procedimiento, el avaro anestesiaba con tomate inyectado por vía intraperitoneal. Luego, los animales se colocan en una mesa y se inserta un catéter de calibre 20 por vía oral en la tráquea. Los ratones intubados se colocan en un ventilador mecánico y se inicia una vía intravenosa en la vena de la cola.

A continuación, los ratones se encierran en un SIGGRAPH para roedores conectado a dos transductores de presión. La electrónica permite la medición continua de la resistencia del sistema respiratorio durante el desafío con acetilcolina. Después de desconectar el ventilador y la vía intravenosa, el catéter traqueal se introduce en el pulmón izquierdo, donde se lava con solución salina inyectada y se retira a través del catéter.

Hola, soy Simone Phar del Departamento de Medicina del Baylor College of Medicine. Hoy os vamos a enseñar la intubación oral de ratones de forma que se pueda recoger repetidamente la mecánica de la vía aérea y el líquido broncoalvelar lage. Utilizamos este procedimiento para estudiar la enfermedad alérgica experimental, que es un modelo experimental del asma, y este procedimiento también se puede adaptar a otras aplicaciones.

Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, el ratón es anestesiado profundamente mediante una inyección intraperitoneal de 48 miligramos por kilogramo de comida. A continuación, el ratón se coloca en una caja de tipo luz suave para mantenerlo tranquilo.

Para ello, se puede utilizar una jaula de ratón limpia cubierta con una cortina de tela: después de cinco a 10 minutos, confirme con un pellizco en el dedo del pie que el animal está completamente anestesiado y luego colóquelo en posición recostada. Con el lado ventral hacia arriba sobre una pequeña mesa ajustada a un ángulo de 45 grados. Para asegurar el sujeto en su lugar, inserte una banda elástica ENC que rodee la mesa detrás de la fila superior de dientes.

Se debe usar una lámpara de calor para mantener el mouse caliente con la mano derecha. Use pinzas para agarrar, extender y levantar la lengua de la boca. A continuación, inserte suavemente un depresor lingual metálico que sostenga en la mano izquierda.

Esto permitirá una vía aérea sin obstáculos y la visualización de las cuerdas vocales para la intubación. A continuación, inserte una rosca de fibra óptica de 0,8 milímetros de diámetro conectada a una fuente de luz a través del catéter angioico y extiéndala 10 milímetros más allá de la punta. Mientras estudia el depresor con la mano izquierda, use la mano derecha para guiar el extremo iluminado del hilo de fibra óptica a través de la cavidad oral y la faringe hasta que se visualicen las cuerdas vocales.

Luego, bajo visualización directa y cronometrándolo cuando las cuerdas estén máximamente abiertas, pase el hilo a través de las cuerdas vocales en movimiento y dentro de la tráquea. Ahora pase el catéter de angio sobre la rosca de fibra óptica hacia la tráquea hasta que la punta del catéter se encuentre dentro de la porción media de la tratraquea. Para un ratón de 17 a 22 gramos, esto corresponde a un segmento de catéter de 10 milímetros que queda fuera de la boca.

Retire la rosca de fibra óptica para confirmar que la intubación se ha realizado correctamente. Observe respiraciones profundas regulares que terminan inmediatamente después de la oclusión del conector con el pulgar. Baje la mesa del pletismógrafo hasta que quede paralela al banco de trabajo y gire el sujeto 180 grados hasta que quede frente al puerto del ventilador de aire.

Gire al animal de costado antes de conectarlo al ventilador. Asegure una conexión hermética y active el ventilador. Una intubación exitosa se confirma aún más cuando se observa que la excursión raso abdominal se acelera con el ventilador más tarde.

Para preparar la aguja para la vía intravenosa, retire una aguja de calibre 27 de 10 milímetros de su conector de jeringa y dóblela 90 grados en el punto medio para que el bisel quede en ángulo. Conecte el extremo no biselado al tubo de PE 10 que conduce al puerto de inyección intravenosa. Para prevenir la embolización gaseosa potencialmente mortal.

Purgue el tubo y la aguja con cloruro de sodio al 0,9% a 37 grados centígrados a través de la jeringa de un mililitro. El puerto de inyección consiste en una aguja de calibre 27 empujada a través de un orificio perforado en la tapa de un tubo de centrífuga de 15 mililitros. La tapa está llena de solución salina de modo que el extremo de la aguja se sumerge constantemente, lo que reduce la probabilidad de que el aire se arrastre en la aguja y se inyecte por vía intravenosa.

Alinea la aguja en el extremo codal de la cola. Paralela y sobre la vena lateral. Pasa la aguja ligeramente por debajo de la piel mientras la diriges.

Craneal a lo largo de las venas y empujando subcutáneamente hasta el pliegue. Para confirmar la colocación exitosa de la vía intravenosa, tire ligeramente del émbolo de la jeringa. Debería ver un reflujo de sangre hacia el tubo intravenoso.

Además, debe haber un flujo sin obstáculos a través de la vía intravenosa tras la inyección de 50 a 100 microlitros de solución salina en la vena de la cola. Después de quitar la lámpara de calor de la configuración, encierre el sujeto en el gráfico de plasmo y asegúrelo herméticamente con la aplicación de cuatro abrazaderas. La extracción de la lámpara de calor es importante para evitar que se caliente el aire en la cámara del plasmográfico y se pueda alterar la posible alteración de las mediciones posteriores de la resistencia del sistema respiratorio o RRS, la resistencia del sistema respiratorio o RRS se determina mediante la cuantificación continua del cociente.

Cambio en la presión de las vías respiratorias sobre el flujo de aire o delta P sobre V en puntos de igual volumen pulmonar. Delta P se determina mediante el uso de un transductor de presión conectado al catéter de angio traqueal V. El diferencial del volumen del injerto plasmático a lo largo del tiempo se calcula mediante el módulo de preamplificación. Después de establecer una línea de base estable, RRS inyecta cinco dosis sucesivas de concentraciones crecientes de cloruro de acetilcolina o un CH durante un segundo por vía intravenosa.

Cada dosis subsiguiente se administra tras el retorno de RRS a la línea de base hasta que se logra un aumento del 200% en la resistencia de las vías respiratorias. Retire la vía intravenosa de la vena de la cola y desconecte el ratón del ventilador. Mantener una vía respiratoria permeable manteniendo la cánula traqueal en su lugar, asegúrese de que el ratón haya reanudado la respiración espontánea.

De lo contrario, se puede estimular la respiración masajeando suavemente el tórax. Una vez que el ratón haya reanudado la respiración espontánea, transfiéralo con una cánula traqueal colocada a una cámara purgada con oxígeno al 100% y mantenida a 37 grados centígrados con la lámpara de calor. La cánula traqueal debe permanecer en su lugar hasta que el animal esté despierto para evitar la muerte relacionada con la asfixia causada por la hipersalivación inducida por acetilcolina.

El lavado broncoalveolar o el líquido BAL solo se pueden recoger cuando el ratón ha recuperado suficientemente su reflejo nauseoso, lo que debe ocurrir unos 20 minutos después del reemplazo en la cámara de recuperación. Para evaluar el reflejo nauseoso, deslice suavemente el catéter angiológico hacia adentro y hacia afuera; la tos evidente o la lucha indican que el reflejo nauseoso ha regresado para acumular líquido BAL. Se inserta en el catéter de angio un alambre guía metálico de intubación con una curva continua de unos 30 grados dirigida al lóbulo izquierdo del pulmón.

Avance el alambre G y el catéter de angioscopia juntos en el lóbulo izquierdo del pulmón de modo que el cubo del catéter, excluido, se extienda más allá de los dientes frontales solo un milímetro. Asegúrese de que la punta del alambre G no pase a través del extremo abierto del catéter de angio. Para evitar la laceración o ruptura traqueal mientras se mantiene el catéter de angio en su lugar, enjuague 300 microlitros de PBS estéril pH 7.4 en el pulmón izquierdo con una jeringa de un mililitro inmediatamente después mientras extrae el émbolo de la jeringa.

Para crear presión negativa, retire el catéter de angio lentamente mientras masajea intensamente el pulmón. Se espera un retorno de BAL de 100 a 200 microlitros. Regrese inmediatamente el ratón de lavado a la cámara de oxígeno al 100% a 37 grados centígrados.

Coloque al animal sobre su lado izquierdo hasta que se recupere por completo unos 20 minutos y luego vuelva a colocarlo en su jaula. Presentamos aquí resultados representativos de las mediciones de resistencia de las vías respiratorias, la hiperreactividad de las vías respiratorias definida como valores de RRS que son significativamente más altos a cualquier dosis de acetilcolina en comparación con los valores naïve desarrollados después de cinco desafíos de alérgenos a la cuarta dosis. Sin embargo, se observó una hiperreactividad de las vías respiratorias mucho mayor después del sexto desafío, sin un mayor aumento en la capacidad de respuesta.

En el séptimo desafío, se suspendió la administración de CH después de que los valores de RRS se triplicaron con respecto a los valores basales, y los aumentos posteriores en la dosificación resultarían en un broncoespasmo letal. Los ratones desafiados repetidamente con el vehículo por vía intranasal para que no desarrollen hiperreactividad en las vías respiratorias y en todas las dosis de un CH dados, las mediciones de RRS no varían significativamente de los valores basales, como se muestra en estos trazados representativos de RRS en tiempo real de un ratón naïve y seis veces desafiado con alérgenos que recibió dosis intravenosas consecutivas de un CH antes de la aparición de un HR A robusto. La cinta celular dominante de la vía aérea inducida por el alérgeno fue el neutrófilo, similar a la tendencia a la HR. Sin embargo, la eosinofilia se fortaleció gradualmente con el desafío repetido de alérgenos y el eosinófilo se convirtió en el tipo de célula numéricamente dominante en el líquido BAL. Después del sexto desafío coincidió con una marcada disminución en el número de neutrófilos.

En el control, PBS desafió a ratones. Las mediciones de la resistencia de las vías respiratorias tampoco variaron significativamente con el tiempo. También se observó un aumento del reclutamiento de macrófagos en los neutrófilos, pero no de los eosinófilos en el líquido BAL, en estos ratones, similar a los cambios observados en los ratones que recibieron solo muestras repetidas de líquido BAL.

Así que acabamos de mostrarle cómo intubar ratones de forma reversible por vía oral y acceder a la vía intravenosa para recopilar datos de fisiología de las vías respiratorias y líquido broncoalveolar grande. Antes de realizar estas técnicas en animales vivos, es esencial practicar y perfeccionar cada técnica por separado. Sobre animales cric.

Un manejo estricto y suave es esencial y se debe realizar una técnica aséptica estricta en todo momento. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.