Name: Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Aprende a aislar neutrófilos de sangre humana y generar trampas extracelulares (NETs) mediante estímulos químicos o biológicos. Visualiza estas estructuras por inmunofluorescencia y microscopía electrónica de barrido.

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1. PMN aislamiento de la sangre humana Utilice unos 24 ml de sangre humana con EDTA o heparina (10 U / ml) como anticoagulante. <ol><li> Agregar 6 ml Histopaque 1119 a un tubo Falcon de 15 ml y con mucho cuidado la capa de 5 a 7 ml de sangre entera en la parte superior. </li><li> Centrifugar durante 20 minutos a 800 xg sin frenar. </li><li> Aspirar y desechar la capa superior y amarillento claro y la transferencia de la fase inferior rojizo que contiene granulocitos en fresco tubos Falcon. </li><li> Lavar las células llenando tubos Falcon con PBS y centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. </li><li> Mientras tanto preparar una solución de Percoll al 100% mediante la mezcla de 18 ml de Percoll con 2 ml de PBS 10x. Con 1x PBS preparar cuatro soluciones ml de 85%, 80%, 75%, 70% y 65% ​​de Percoll. </li><li> Preparar dos tubos Falcon con un gradiente de Percoll por capas de 2 ml de cada punto porcentual por encima de los demás en orden decreciente. </li><li> Después de la centrifugación separar el sobrenadante, se combinan pellets y resuspender las células sedimentadas en 4 ml de PBS. </li><li> Cuidado de la capa 2 ml de la resuspensión en cada uno de los gradientes. </li><li> Centrifugar durante 20 minutos a 800 xg sin frenar. </li><li> Después de la centrifugación quitar la capa superior y la mayoría de los 65% de la capa de PBMC y recoger blanco interfases restante hasta 85% en la capa de nuevos tubos Falcon. </li><li> Lavar las células llenando los tubos Falcon con PBS y centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. </li><li> Eliminar las células sedimentadas sobrenadante y resuspender (normalmente&gt; 95% PMN) en 2 ml de PBS. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro. </li></ol> 2. PMN activar <ol><li> Prepare una placa celular de 24 pocillos, poniendo una gasa estéril alrededor de 13 mm cubreobjetos de cristal (# 1,5) en cada pocillo </li><li> Semillas de 2 x 10 5 células en 500μl RPMI (que contiene 2% de albúmina sérica humana) por pocillo y se incuba durante 1 hora en CO 2 incubadora a 37 ° C. </li><li> Mientras tanto, preparar una solución de 600 nM PMA en RPMI y añadir a las células de 100μl por pocillo. Incubar de 15 min a 4 h de CO 2 incubadora a 37 ° C. </li><li> Fijar las células en el 4% (concentración final) paraformaldehido disuelto en PBS. </li></ol> PMA sirve como un control positivo y es hasta ahora el agente más potente para inducir la formación NET. Por otra parte, otros estímulos o co-cultivo con patógenos puede ser utilizado para la inducción de NET. Los estatutos respectivos de la formación de NET se puede comprobar mientras que la evolución en el tiempo es lineal, en caso adicional de muestras paralelas están preparados. Si un medio de contraste de ADN no permeables como Sytox Verde (Invitrogen) se añade a las células no-fijo, sólo el ADN extracelular será detectado. Desde la creación de nuevas redes es de alguna manera altera en presencia de Sytox, para cada momento una muestra paralela tiene que ser utilizado. 3. NET detección por inmunomarcación NET son muy frágiles, incluso después de la fijación y deben ser manipulados con mucho cuidado, de lo contrario la mayoría se pierden durante la preparación. <ol><li> Retire con cuidado el cristal de la cubierta se desliza con células adjunto de la placa de cultivo de 24 pocillos levantándolo en el borde con una aguja curva y tomar con una pinza fina. Coloque el cubreobjetos boca abajo sobre una gota de PBS. Esto se puede hacer en una hoja de Parafilm cubrir un puesto de tubo de ensayo. Lavado de la misma familia 3 veces por 5 min. </li><li> Incubar cubreobjetos de la misma manera en una caída del 0,5% Triton X-100 durante 1 minuto a temperatura ambiente para permeabilizar las células. Lavar 3 veces en PBS durante 1 min. </li><li> Preparar una cámara húmeda con Parafilm y un pañuelo de papel mojado. Ponga la tapa se desliza hacia abajo en una gota de tampón de bloqueo (5% burro suero) y se incuba durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Diluir anticuerpos primarios, por ejemplo, ms contra Histon y rb contra la elastasa de los neutrófilos, en tampón de bloqueo. </li><li> La transferencia de la cubierta se desliza en la cámara húmeda directamente desde el amortiguador de bloqueo en una gota de anticuerpo primario y se incuba durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS. </li><li> Diluir secundaria de anticuerpos, por ejemplo, dk contra ms Cy2 y dk contra rb Cy3, en tampón de bloqueo. </li><li> La transferencia de la cubierta se desliza en la cámara húmeda en una gota de anticuerpo secundario y se incuba durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS. Dependiendo de las opciones de microscopía de fluorescencia, el ADN de la mancha durante 5 minutos, ya sea con Hoechst 33342 (1 mg / ml), que tendrá excitación UV o con Draq5 para la excitación del rojo lejano y lavar dos veces con dist. del agua. </li><li> Establecer una gota de 20μl Mowiol en un portaobjetos de vidrio y montaje de la cubierta se desliza con células de al revés. Las células tienen que ser entre el cubreobjetos y la corredera. La caída de Mowiol se forma una fina capa de espesor homogéneo cuando la hoja de la cubierta se coloca en la caída. Normalmente, no hay necesidad de presionar la muestra. Si desea utilizar lentes de no-inmersión, la muestra está lista para inspección.Para el análisis microscópico con lentes de inmersión, que la muestra se seque durante 1 hora hasta que la Mowiol ha solidificado en el borde de la muestra. </li></ol> 4. NET para la preparación de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) <ol><li> Después de fijar las células en las hojas de cubierta de vidrio de 24 y placa con 2,5% de glutaraldehído. </li><li> Eliminar hojas de vidrio cubierta con células de la placa de cultivo de 24 pocillos y poner boca abajo sobre una gota de agua. Lavado de la misma familia 3 veces por 5 min. </li><li> La transferencia de la cubierta se desliza de nuevo en 24 y placa de cultivo celular que contiene 0,5% OsO4 e incubar durante 30 min. </li><li> Eliminar hojas de vidrio cubierta con células de la placa de cultivo de 24 pocillos y poner boca abajo sobre una gota de agua. Lavado de la misma familia 3 veces por 5 min. </li><li> La transferencia de la cubierta se desliza de nuevo en 24 y placa de cultivo celular que contiene 1% de ácido tánico y se incuba durante 30 min. </li><li> Repita los pasos 4,2 hasta 4,4 </li><li> Deshidratan a través del siguiente régimen (5 minutos cada uno): <ul><li> 30% de etanol </li><li> 50% de etanol </li><li> 70% de etanol </li><li> 80% de etanol </li><li> 90% de etanol </li><li> 100% de etanol </li><li> 100% de etanol </li><li> 100% de etanol </li></ul></li><li> La transferencia de la cubierta se desliza en secador de punto crítico y muestras secas. </li><li> Capa superficial de la muestra con 5 nm platino / carbón de capa con evaporador de capa fina </li></ol> 5. Los resultados representativos: El método de aislamiento por lo general los rendimientos de los neutrófilos no estimulados viable con una pureza superior al 95%. Cuando se fija en diferentes puntos de tiempo después de la estimulación, el protocolo de inmunomarcación muestra la secuencia de cambios morfológicos en células NETosis aplanamiento, la pérdida de los lóbulos nucleares, la pérdida de gránulo y la integridad del núcleo que conduce a una creciente superposición de las armas nucleares (es decir, las histonas) y granular (es decir, elastasa de los neutrófilos) tinción. Este protocolo puede servir como punto de partida para analizar las interacciones específicas de los agentes patógenos con los neutrófilos. Esta interacción puede ser diseccionado con más detalle utilizando el protocolo de preparación para microscopía electrónica de barrido. NET de fluorescencia Muestra de neutrófilos estimulados teñidos para NET (azul = ADN, rojo = histonas, verde = elastasa de los neutrófilos). Las imágenes muestran, además de la localización NET, la localización nuclear de ADN y las histonas y el patrón granular para la elastasa de los neutrófilos. SEM PMA estimulación Micrografía electrónica de barrido que muestra no neutrófilos estimulados y PMA estimulada. Después de la estimulación, los neutrófilos se aplanan y producir NET. SEM NET y Shigella Mayor resolución de imagen SEM de la bacteria Shigella atrapados en las redes.

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

El protocolo deberá permitir que el aislamiento de los neutrófilos no estimulados con una pureza considerable, la inducción de la formación de NET y el análisis de los cambios morfológicos durante NETosis. Cuando se manipulan las muestras con cuidado, es decir, evitar las duras condiciones de lavado que se traducirá en la pérdida de la mayoría de las redes unen libremente, la cantidad de formación de NET en condiciones diferentes de estimulación (duración, estímulo) se pueden comparar. En este sentido, los protocolos que pueden servir como punto de partida para establecer los métodos para analizar los escenarios más sofisticados: las interacciones de neutrófilos / patógeno, la secuencia de estímulos, la interacción con otras células inmunes.

las trampas de neutrófilos extracelular: cómo generar y visualizarlas

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Granulocitos neutrófilos son el grupo más abundante de los leucocitos en la sangre periférica. Como fagocitos profesionales, las bacterias hundir y matar a intracelularmente cuando el fusible de gránulos de antimicrobianos con el fagosoma. Hemos encontrado que los neutrófilos tienen una forma adicional de matar a los microorganismos: la activación, liberan proteínas granulares y de la cromatina que en conjunto forman las fibras extracelulares que se unen los patógenos. Estas nuevas estructuras, o las trampas de neutrófilos extracelular (TNE), la degradación de los factores de virulencia y matar las bacterias 1, 2 hongos y parásitos 3. La columna vertebral estructural de la TNE es el ADN, y se degrada rápidamente en la presencia de DNasas. Por lo tanto, las bacterias que expresan DNasas son más virulentas 4. Utilizando microscopía correlativa combinar TEM, SEM, las técnicas de inmunofluorescencia de células y en directo de imágenes, podemos demostrar que la estimulación, los núcleos de los neutrófilos pierden su forma y homogeneizar la UE y la heterocromatina. Más tarde, la envoltura nuclear y las membranas de gránulos se desintegran permitiendo la mezcla de componentes NET. Por último, las redes se lanzan como los saltos de la membrana celular. Este programa de muerte celular (NETosis) es distinta de la apoptosis y la necrosis y depende de la generación de especies reactivas del oxígeno por la NADPH oxidasa 5. Neutrófilos trampas extracelulares son abundantes en los sitios de inflamación aguda. NET parece ser una forma de respuesta inmune innata que los microorganismos se unen, evitar que se propaguen, y asegurar una alta concentración local de agentes antimicrobianos para degradar los factores de virulencia y matar a los patógenos permitiendo así que los neutrófilos para cumplir con su función antimicrobiana incluso más allá de su vida. Cada vez hay más evidencia, sin embargo, que las redes también están implicados en enfermedades que van desde la auto-inmune síndromes de infertilidad 6. Se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de 7 de sangre periférica humana y estimular a formar NET. También se incluyen los protocolos para visualizar las redes en microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Los granulocitos neutrófilos son el grupo más abundante de leucocitos en la sangre periférica. Como fagocitos profesionales, envuelven a las bacterias y las eliminan...

Las trampas extracelulares de neutrófilos, o redes, son un mecanismo recientemente identificado mediante el cual los neutrófilos eliminan patógenos liberando una combinación de proteínas citoplasmáticas y de gránulos, así como cromatina, formando fibras extracelulares que atrapan a los patógenos. En este video, los granulocitos se aíslan de sangre total humana mediante centrifugación en gradiente de densidad histopatológico. Los neutrófilos se aíslan de la preparación de granulocitos mediante gradiente Percoll.Después de sembrar por centrifugación sobre cubreobjetos y estimular la formación de redes mediante estímulos químicos o biológicos, las células se procesan para inmunomarcado o microscopía electrónica con el fin de visualizar las redes. Hola, soy Christian Gosman del servicio central de microscopía del Instituto Max Plunk de Biología de la Infección. Hoy les mostraremos un procedimiento para purificar granulocitos neutrófilos a partir de sangre humana y estimularlos para que generen trampas extracelulares de neutrófilos, o redes.Luego visualizaremos las redes mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de barrido. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los mecanismos que conducen a la formación de redes y para analizar las propiedades antimicrobianas de las mismas. Así que comencemos.Comience este protocolo en una cabina de flujo laminar preparando seis mililitros de histo 1119 en cada uno de cuatro tubos Falcon de 15 mililitros. Deposite cuidadosamente cinco a siete mililitros de sangre total sobre el histo en cada tubo, centrifugue los tubos durante 20 minutos a aproximadamente 800 × g, asegurándose de que el freno esté desactivado una vez finalizada la centrifugación. Retire cuidadosamente los tubos del centrífugo.El tubo contendrá cuatro capas claramente separadas de arriba hacia abajo. Estas son una capa rojo oscuro que contiene eritrocitos, una capa rojo claro que contiene los granulocitos neutrófilos con algunos eritrocitos, una capa amarillenta blanquecina que contiene leucocitos y suero, y una capa amarilla transparente de suero.De nuevo, trabajando en la cabina de flujo laminar. Utilice el pera acoplado a un sistema de vacío para aspirar cuidadosamente la capa superior amarilla. Luego, usando una pipeta, transfiera la fase rojiza que contiene granulocitos de cada tubo a un nuevo tubo cónico.A continuación, llene los tubos con PBS para lavar los granulocitos. Luego, haga un pellet por centrifugación durante 10 minutos a aproximadamente 300 ×g mientras las células giran. Prepare una solución al 100 % per coll mezclando 18 mililitros de per co con 2 mililitros de PBS 10 veces concentrado.Luego, utilice la solución al 100 % per coll y PBS al uno por ciento para preparar cuatro mililitros de cada una de las siguientes concentraciones: 65, 70, 75, 80 y 85 % per call. Use estas soluciones para preparar gradientes per core, superponiendo cuidadosamente dos mililitros de cada solución en cada uno de dos tubos. Comience agregando dos mililitros de la solución al 85 % en cada tubo.Luego, encima del 85% per coll, coloque cuidadosamente dos mililitros del 80% per co. Continúe agregando capas de dos mililitros de cada solución en orden decreciente, de modo que la solución al 65% quede en la parte superior. Retire los leucocitos sedimentados del centrífugo dentro de la campana extractora.Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de PBS. Luego, combine las células resuspendidas en un tubo nuevo. Aplique cuidadosamente dos mililitros de los granulocitos resuspendidos sobre cada uno de los gradientes de percol.Luego, centrifugue durante 20 minutos a aproximadamente 800 × g, asegurándose de que la desaceleración esté desactivada tras la centrifugación. Las interfaces deben ser claramente visibles debido a la mayor densidad celular. Descarte la capa superior y la mayor parte de la capa del 65 %, que contienen células mononucleares de la sangre periférica o pBMCs.Recolecte la interfase del 65%-70% junto con la interfase del 70%-75% y del 80%-85% de cada gradiente y transfiéralas a nuevos tubos cónicos. Lave las células llenando el tubo con PBS y centrifugue durante 10 minutos a aproximadamente 300 ×g para formar el sedimento celular tras la centrifugación. Retire el sobrenadante y re suspenda los leucocitos polimorfonucleares o PMN sedimentados en dos mililitros de PBS.En este momento, el 95 % o más de las células en la preparación serán mns. Determinar el recuento celular utilizando un hemocitómetro, luego colocar 200 000 células en 500 microlitros de RPMI sobre cubreobjetos redondos estériles colocados en placas de cultivo con pozos de 15 milímetros de tamaño. Incubar durante una hora en un incubador con 5 % de CO2 a 37 grados Celsius para permitir que las células se adhieran a los cubreobjetos tras una hora.Añada 100 microlitros de RPMI que contenga el estimulante deseado. Para un experimento de curso temporal, agregue el estimulante secuencialmente, comenzando con el tiempo de estimulación más largo para cada punto temporal condicional. Asegúrese de preparar un control positivo añadiendo 600 nanomolares de PMA en RPMI.Además, para cada condición o punto de tiempo, prepare un control negativo agregando solo RPMI e incube hasta cuatro horas en un incubador de CO2 a 37 grados Celsius. Durante la estimulación, la formación de redes puede monitorearse mediante microscopía de campo brillante. Poco después de la estimulación, los núcleos cambian drásticamente su forma. Pierden sus LOEs, se redondean y luego se expanden en el punto de tiempo deseado; agregue 600 microlitros de solución al 8 % de paraformaldehído a temperatura ambiente a cada pocillo.Para llevar la concentración final a 4 %, incubar de dos a cuatro horas para la marcación inmunológica. Coloque una lámina de paraformo encima de un soporte para tubos de ensayo con tres veces ocho orificios de aproximadamente 15 milímetros de diámetro. Para formar pozos, llene los pozos con PBS.Utilice una aguja curva para levantar cada una de las laminillas del paraldehído en la placa de cultivo. Luego, con pinzas, tome la laminilla e inviértala sobre la superficie de una gota de PBS en la paraform. En este momento, las trampas extracelulares de neutrófilos son muy frágiles y se debe tener mucho cuidado durante la manipulación para evitar la pérdida celular.Después de cinco minutos, repita el lavado transfiriendo las cubreobjetos a nuevas gotas de PBS. Repita un total de tres lavados. A continuación, transfiera las cubreobjetos a una gota de Triton X-100 al 0,5 % a temperatura ambiente durante un minuto para permeabilizar las células.Luego, lave tres veces con PBS durante un minuto cada vez después del lavado. Continúe con la tinción según el protocolo escrito adjunto. Realice cada una de las incubaciones y pasos de lavado invirtiendo el cubreobjetos sobre el paraformaldehído.Una vez que las células hayan sido teñidas, coloque una gota de 20 microlitros de MO sobre un portaobjetos de vidrio y monte las cubreobjetos con la cara hacia abajo, dejando las células entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Después de una hora, el MOY debería haberse solidificado y las células estarán listas para el análisis microscópico. Con lentes de inmersión, prepare las células para microscopía electrónica de barrido bajo una campana extractora de gases químicos.Posteriormente, fije las células sobre los cubreobjetos de vidrio en una placa de 24 pocillos con glutaraldehído al 2,5 % en PBS durante 30 minutos. Durante la incubación, coloque una hoja de paraform sobre la parte superior de un tubo de ensayo. Coloque con tres hileras de ocho orificios de aproximadamente 15 milímetros de diámetro.Para formar pozos. Llene los pozos con agua destilada. Utilice una aguja curva para levantar cada una de las laminillas de la solución de glutaraldehído.Luego, utilizando pinzas, sostenga el cubreobjetos y transfiéralo a una gota de agua destilada en el lavado de Paraform, transfiriendo los cubreobjetos a gotas de agua destilada en Paraform. Repita un total de tres lavados, de cinco minutos cada uno; transfiera nuevamente los cubreobjetos a los pocillos de la placa de cultivo celular que contienen tetróxido de osmio al 0,5 % en agua destilada e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Retire los cubreobjetos de la placa y lávelos tres veces con agua destilada como antes.Luego, devuélvalos a la placa de 24 pocillos con 0,5 mililitros de ácido tánico al 1% en cada pocillo e incube durante 30 minutos. A continuación, lave las laminillas tres veces, cinco minutos cada vez. Después, repita la fijación con tetraóxido de osmio y el lavado.A continuación, tape el tubo de ensayo. Coloque con un nuevo trozo de paraformaldehído. Deshidrate las células mediante una serie de incubaciones en las siguientes soluciones de etanol durante cinco minutos cada una: 30, 50, 70, 80, 9100, 100.Y finalmente, una vez más en etanol al 100 %. Sumerja el soporte en un recipiente para muestras lleno de etanol. Coloque rápidamente las laminillas en el soporte metálico, asegurándose de que las muestras no se sequen.Luego, transfiera el bote del espécimen a un secador de punto crítico refrigerado o CPD. Llene la cámara del CPD con CO2 líquido. Mantenga la válvula de entrada completamente abierta para mantener el nivel de líquido y, tan pronto como una fase de etanol sea visible debajo de la fase de CO2 en la parte inferior de la cámara, abra la válvula de drenaje en la base.Para eliminar la mayor parte del etanol. Deje que la cámara se enjuague durante aproximadamente 30 minutos. Después del enjuague, cierre la válvula de entrada y reduzca el nivel del líquido hasta que esté justo por debajo de la parte superior del barco.Haga pasar agua caliente a través de la camisa del CPD. Cuando la temperatura alcance entre 36 y 38 grados Celsius y la presión aumente a 1 200 libras por pulgada cuadrada, la línea límite entre el estado líquido y el gaseoso desaparecerá y las muestras estarán por encima del punto crítico. Una vez alcanzado el punto crítico, libere lentamente el gas durante un período de cinco minutos.Para evitar la condensación, la temperatura debe mantenerse alrededor de 40 grados Celsius. Durante este tiempo, abra la puerta y retire la embarcación. Confirme que el disolvente deshidratante ha evaporado.Pegue los cubreobjetos con el lado correcto hacia arriba sobre el adhesivo del soporte de aluminio para muestras y transfiéralos al sistema de recubrimiento de alta resolución. Evacúe el cilindro de recubrimiento hasta dos veces 10 a la menos cinco milibares. Luego configure el instrumento a 1,8 kilovoltios y 70 miliamperios, y controle el grosor de la capa de carbono platon con un cristal de cuarzo hasta que la capa alcance cinco nanómetros.Vente el cilindro de recubrimiento del sistema de recubrimiento de alta resolución. Luego, utilizando pinzas, retire las muestras del coter. Lleve la cámara del MEB a presión normal.Abrir la puerta. Luego insertar las muestras en el portamuestras y evacuar la cámara. Para análisis por MEB.Cuando se fijan en diferentes momentos tras la estimulación, pueden observarse mediante microscopía de inmunofluorescencia los cambios morfológicos durante la NETosis. En esta figura, el ADN se muestra en azul con histona. El complejo de ADN se muestra en rojo y la elastasa de neutrófilos.Un marcador de gránulos se muestra en verde durante la primera fase de la NETosis; solo el perímetro nuclear en núcleos condensados. Posteriormente, cuando la cromatina está más descondensada, la mayor parte del núcleo se tiñe en las redes descondensadas. La tinción es homogénea.Este conjunto de imágenes detalla la superposición de la tinción nuclear y granular que ocurre durante la NETosis. Esta micrografía electrónica de barrido muestra neutrófilos no estimulados tras la estimulación con la bacteria Ella; los neutrófilos se aplanan y producen trampas extracelulares de neutrófilos. Trampas. Aquí, una bacteria gel ha quedado atrapada en las redes.Las bacterias, como el gel, quedan inmovilizadas y son destruidas por las enzimas presentes en las redes. Acabamos de mostrarle cómo aislar granulocitos neutrófilos de sangre humana y estimularlos para inducir la formación de trampas extracelulares de neutrófilos. Estas luego pueden analizarse más a fondo mediante inmunofluorescencia o microscopía electrónica de barrido.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las redes son muy frágiles incluso después de la fijación. Para minimizar la pérdida de redes, tomamos las laminillas con los neutrófilos estimulados de las cavidades de la placa y realizamos la mayor parte del procedimiento sobre la superficie de gotas de tampón. Aun así, es fundamental mover las muestras suave y lentamente.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra la tinción fluorescente de trampas extracelulares (NETs) de neutrófilos, los componentes extracelulares del ADN expulsados por los neutrófilos. Esta técnica permite la visualización de la interacción adhesiva entre las células cancerosas y los NET.

Microscopía de fluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs: una técnica para observar la interacción adhesiva entre las células cancerosas y los NETs

Este video muestra una técnica in vitro para generar y aislar trampas extracelulares (NETs) de neutrófilos. Los neutrófilos se aíslan de la sangre periférica y se estimulan con acetato de forbol miristato (PMA) para producir NET. Durante la incubación, los neutrófilos se someten a un proceso de muerte celular (NETosis) para liberar NETs que comprenden cromatina descondensada mezclada con proteínas citoplasmáticas granulares.

Una técnica in vitro para generar trampas extracelulares de neutrófilos humanos

Este video demuestra la inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs en neutrófilos premarcados utilizando suero del paciente que contiene anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilos. Además, el uso de un tinte de ADN impermeable y la microscopía de fluorescencia permite la visualización de los NET.

Inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos premarcados

Las trampas extracelulares macrófago son una entidad nuevamente descrita. Este artículo se centrará en los métodos de microscopía confocal y cómo son visualizados en vitro y en vivo de las muestras de pulmón.

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

Aquí, presentamos un método en el que neutrófilos baja densidad humanos (LDN), recuperados del líquido de lavado peritoneal postoperatorio, producen enormes trampas extracelulares neutrófilos (redes) y atrapan eficientemente las células tumorales libres que posteriormente crecen.

Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales

Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Este protocolo describe un ensayo de neutrófilos trampa extracelular (red) altamente sensible y de alto rendimiento para la cuantificación semiautomática de ex vivo red formación por microscopia confocal tridimensional de la inmunofluorescencia. Este protocolo puede utilizarse para evaluar la red formación y degradación después de diferentes estímulos y se puede utilizar para estudiar terapias potenciales orientada en la red.

Un análisis de alto rendimiento para evaluar y cuantificar la formación de neutrófilos trampa extracelular

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras tridimensionales generadas por granulocitos neutrófilos estimulados. En los últimos años ha quedado claro que los NET están implicados en una amplia variedad de enfermedades. La detección de NETs en el tejido puede tener relevancia diagnóstica, por lo que se requieren protocolos estandarizados para etiquetar los componentes NET.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.

Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) se asocian con diversas enfermedades, y la inmunofluorescencia se utiliza a menudo para su visualización. Sin embargo, existen varios protocolos de tinción y, en muchos casos, solo se examina un tipo de tejido. Aquí, establecemos un protocolo de aplicación general para la tinción de NET en tejido de ratón y humano.

Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos

Aprende a aislar neutrófilos de sangre humana y generar trampas extracelulares (NETs) mediante estímulos químicos o biológicos. Visualiza estas estructuras por inmunofluorescencia y microscopía electrónica de barrido.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

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