Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

Se presentan los principios de la medición de oxígeno por temple fosforescencia y revisión del diseño de la porfirina basada en nanosensores dendríticas para obtener imágenes de oxígeno en los sistemas biológicos.

Presentamos el diseño de sondas fosforescentes para oxígeno basadas en DERs de porfirina de platino y paladio. Las sondas consisten en núcleos de porfirina metálica que encapsulan dendron y una capa de polietilenglicol hidrófilo periférico, la construcción de las sondas y sus calibraciones se ilustrarán en este artículo. Hola, mi nombre es Luis Sinks.

Trabajo con el profesor Sergei OV aquí en el Departamento de Bioquímica y Biofísica de la Universidad de Pensilvania. Soy Emmanuel Losis, también de la Viña. Soy gordo también de la, Y soy Sergei V.Las mediciones biológicas de oxígeno por fósforo y enfriamiento hacen uso de fósforo exógeno y sondas, que se introducen directamente en el medio de interés.

Las sondas de sangre o líquido intersticial son el único componente invasivo del esquema de medición que requiere especial atención a su diseño. Hoy os mostraremos un procedimiento para la síntesis y calibración de nanosondas dendríticas fosforescentes para la medición de oxígeno y sistemas biológicos. Utilizamos este procedimiento para sintetizar y caracterizar sondas para mediciones de oxígeno semi y dobles.

Así que comencemos. Antes de comenzar a construir sondas, primero repasemos la teoría básica detrás de la fosforescencia de la sonda. La fosforescencia se origina en el estado triplete de larga vida.

La molécula de la sonda debe estar diseñada para proporcionar un alto rendimiento cuántico del estado triplete y emitir fosforescencia en lugar de fluorescencia. La excitación de las sondas se produce por un fotón o, en el caso de sondas especiales mejoradas por dos fotones, por el mecanismo de dos fotones. La excitación de un fotón generalmente proporciona menos resolución espacial, pero requiere una instrumentación más simple y se puede usar en mediciones de un solo punto con perímetros de fibra óptica basados en LED.

Mientras está en el estado triplete, la sonda puede experimentar encuentros colisionales con moléculas de oxígeno, lo que puede desactivar el estado triplete, un proceso llamado enfriamiento. Por lo tanto, en presencia de oxígeno, la vida útil de la fosforescencia se acorta. Como resultado del enfriamiento, la dependencia de la vida útil del estado triplete de la cantidad de oxígeno en el ambiente se caracteriza por la ecuación de volumen de popa.

En experimentos in vivo, la sonda se introduce en la sangre o en el líquido intersticial de un animal, y la superficie del tejido se ilumina con luz de una longitud de onda adecuada para llevar la sonda a su estado triplete excitado. Para medir el tiempo de vida fosforescente, los fotones fosforescentes emitidos son bi en el tiempo. Por ejemplo, después del pulso de excitación, se pueden recoger 3.609 fotones en los primeros cinco microsegundos, 1.421 fotones en los cinco microsegundos siguientes y así sucesivamente hasta que no se recojan fotones.

Los números en los bins trazados contra el tiempo dan la desintegración de la fosforescencia, que se analiza para producir la vida útil de la fosforescencia. En la creación de imágenes, este procedimiento se aplica a cada píxel de la imagen, lo que da como resultado mapas de vida fosforescentes. Las mediciones de los tiempos de vida son insensibles a las heterogeneidades de la distribución de la sonda en todo el objeto, lo cual es común para las muestras biológicas.

Ahora veamos cómo construir sondas. Comience el procedimiento de síntesis añadiendo un aldehído aromático a una solución 0,01 molar de tetra hidro iso indol. Revuelva la mezcla de reacción durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.

Luego agregue boro, tri fluoruro dathyl, coma y siga revolviendo durante dos horas más. A continuación, agregue dicloruro cian, benzoquinona o DDQ, lo que da como resultado el color. Cambie de rojo pálido a verde intenso y deje la mezcla durante la noche bajo agitación continua al día siguiente, lave y seque la solución y luego concéntrela al vacío.

La cristalización reg del residuo da el objetivo como un polvo verde. Los rendimientos suelen ser de alrededor del 50%A continuación, trate la porfirina de base libre con acetato de paladio. Monitorice la conversión mediante espectroscopía UV vista.

La conversión se completa después de que desaparece la banda de jabón del Dion entre 468 y 472 nanómetros. La porfirina se aísla por cromatografía en columna sobre gel de sílice. Para preparar la tetra benzo porfirina de paladio, oxida la tetra cicloporfirina de paladio.

Durante el reflejo, el color cambia de rojo oscuro a verde intenso, evapora el solvente, diluye el residuo con lavado de diclorometano, seca y concentra la fase orgánica al vacío. Después de la cromatografía en gel de sílice, aísle paladio tetra benzo porfirina como polvo de color verde azulado. A continuación, hidrolice los grupos etro periféricos del paladio trab benzo porfirina.

Primero trate el tetra benzo porfirina Esther con base en tetra hydro purin. Luego continúe la hidrólisis y la base acuosa, precipite la porfirina mediante la adición de ácido clorhídrico y séquela al vacío. Esto completa la síntesis de la porfirina.

Ahora veamos cómo sintetizar entrones. Antes de que se ensamblen las sondas, los entrones, que son las ramas de la Dinamarca, deben sintetizarse previamente. Utilizamos aerodinámica, los mismos DER, que se pueden preparar convenientemente a partir de materiales de estudio económicos utilizando métodos sin cromatografía.

Los therones con grupos amino en sus puntos focales se unen a los grupos caril en el phy, que acabamos de mostrarte cómo hacer. Luego, los grupos éster en la periferia del DME se hidrolizan de manera similar a los grupos carboxílicos en la periferia de la porfirina. En este punto, a partir del ácido policarboxílico DME de porfirina, se pueden sintetizar una o dos sondas de fotones para sintetizar las dos sondas de fotones.

En primer lugar, unen divergentemente unos pocos fragmentos de dos antenas de fotones a varios grupos carboxilo en la periferia del demer. Ahora proceda con la modificación de los residuos de ácido carboxílico restantes en el demer. Comience agregando un exceso de 1,25 veces de HBTU a una solución altamente concentrada del rimer de porfirina y revuelva la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Ahora, agregue di isopropil etilamina y metoxi polietilenglicolamina. Revuelva la mezcla de reacción durante dos días a temperatura ambiente y luego agregue éter etílico. Separe la forma para precipitar por centrifugación y vuelva a precipitarla a partir del tetraedro unas cuantas veces agregando éter datílico.

Por último, purifique la sonda mediante cromatografía de exclusión por tamaño en perlas de poliestireno utilizando tetraedro como disolvente. Ahora veamos la caracterización y calibración de la sonda. Los espectros de absorción y emisión de la sonda se obtienen utilizando soluciones de sonda de un micromolar en condiciones ambientales con un espectrofotómetro estándar y un fluorímetro de estado estacionario.

A continuación, para obtener el gráfico de calibración de Ulmer de popa, que nos permite relacionar la vida útil de la sonda con la concentración de oxígeno, coloque una solución de la sonda en una hoja cilíndrica especial. El vete se coloca dentro de una cámara de temperatura controlada dentro de una jaula impermeable ligera con puertos para fibras ópticas de excitación y emisión. Cierre el veta con un tapón, que tiene insertado un electrodo de oxígeno tipo Clark altamente sensible.

El tapón también tiene dos puertos de aguja para la entrada y salida de Argonne. Ajuste la temperatura a 36 a 37 grados centígrados y deje la solución revolviendo hasta que alcance el equilibrio. Conecte la fibra de excitación al vertido de excitación de un perímetro de fosfo digital controlado por un PC.

La fuente de luz y el perímetro de phos es un LED de alta potencia, cuya salida está controlada por una placa digital a analógica de 333 kilohercios. La fibra de emisión está conectada a otro puerto óptico del perímetro del phos, que está acoplado a un fotodiodo de avalancha sensible al infrarrojo. La salida del diodo se amplifica y se alimenta al canal de anuncios de la misma placa de control, lo que permite la sincronización entre los canales de excitación y emisión.

El software de control escrito en casa genera pulsos de excitación de cualquier longitud deseada, seguidos de la recopilación de la desintegración de la fosforescencia. La salida del electrodo de oxígeno se amplifica y se dirige a otra placa digital analógica en la misma PC. Se trata de una placa de baja frecuencia, de un kilohercio como máximo, que se utiliza para registrar la corriente del electrodo en puntos de tiempo seleccionados, normalmente 10 veces por segundo.

Una vez que se equilibra la temperatura de la solución, tanto el perímetro de phos como el programa de electrodos se inicializan al mismo tiempo. Para realizar mediciones cada 10 segundos, sus salidas se registran de forma sincrónica en dos archivos separados. Después de eso, Argonne se conecta al puerto de entrada en el tapón veterinario.

A medida que Argonne fluye sobre la superficie de la solución agitada, reemplaza gradualmente al oxígeno. Esto da como resultado una disminución de la corriente del electrodo y un aumento en la vida útil del fósforo, que se mide por el perímetro del fósforo. Por lo general, el oxígeno se desplaza por completo de la solución.

Después de aproximadamente dos horas después de la ejecución de la valoración, los datos del electrodo y la vida útil del fósforo se importan a un programa de análisis estándar, que crea un gráfico de la vida útil inversa del fósforo frente a la presión parcial del oxígeno. Esta parcela está equipada con una línea recta utilizando el método de mínimos cuadrados para dar la constante de enfriamiento de oxígeno como su pendiente. La vida útil fosforescente se obtiene a partir del mismo ajuste o directamente de la medición con oxígeno cero.

La valoración puede repetirse utilizando una solución de la sonda en presencia de albúmina, una proteína presente en el plasma sanguíneo para emular las condiciones que se cumplen en la sangre de un animal in vivo. Los diagramas de Ulmer de popa obtenidos deben ser idénticos si el ER está protegiendo la sonda. Bueno, y los grupos peg aíslan la sonda del contacto con la albúmina.

La sugerencia aquí, pasos seleccionados en la síntesis de oxígeno, luego tratados y su calibración. Al realizar la calibración. Es importante asegurarse de que las condiciones sean lo más parecidas a las del sistema biológico de interés.

Es importante asegurarse de que la molécula de la sonda no se vea afectada por biomoléculas, como la albúmina. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tu experiencia.