Name: Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprende a sintetizar y caracterizar nanosondas fosforescentes de platino y paladio para medición de oxígeno en sistemas biológicos. Este método permite obtener imágenes precisas del metabolismo celular.

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1. Descripción general del protocolo de medición de oxígeno (Esta sección no tiene ningún tipo de acción, pero es crucial para entender el resto del documento. Puede ser filmado, por ejemplo, como una secuencia de diapositivas de un Punto de unos pocos de energía, acompañado por la voz.) 1.1) La sonda se introduce en el medio de interés, por ejemplo, se inyecta en la sangre o los líquidos intersticiales de un animal. 1.2) El objeto (la superficie de los tejidos) se ilumina con la luz de longitud de onda apropiada con el fin de promover la investigación sobre su estado excitado triplete. Normalmente, la excitación se produce a través del mecanismo de un fotón. Sin embargo, en el caso de la especial de dos fotones mayor sondas, la excitación se puede hacer a través del mecanismo de dos fotones, lo que permite el uso de las sondas en las aplicaciones de la microscopía de alta resolución. De un fotón de excitación general, ofrece una resolución espacial de menos, pero requiere más simple de instrumentación y se puede utilizar en un solo punto de medición con LED de fibra óptica basada phosphorometers. 1.3) La fosforescencia emitida por la sonda se origina en el estado triplete de larga vida. La molécula de la sonda debe estar especialmente diseñados para dar un alto rendimiento cuántico del estado triplete y emiten fosforescencia en lugar de la fluorescencia. Mientras que en el estado triplete, la sonda puede experimentar encuentros colisión con las moléculas de oxígeno, que puede desactivar el estado de triplete - ". Temple" de un proceso llamado En ausencia de oxígeno, la vida útil del estado triplete, y por lo tanto de la decadencia de la fosforescencia, es τ 0. En presencia de oxígeno, la vida fosforescencia (τ) se reduce como consecuencia de la extinción. Existe una relación directa entre el tiempo de vida del estado triplete y la cantidad de oxígeno en el ambiente. Esta es la bien conocida relación de Stern-Volmer, que conecta la vida (τ) de la fosforescencia de la concentración de oxígeno [O 2] (o la presión parcial de oxígeno PO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="Ecuación" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="ecuación"> En los sistemas biológicos, el oxígeno es de lejos el extintor más efectivo de la fosforescencia, que hace que el método de enfriamiento fosforescencia muy selectiva al oxígeno. 1.4) Con el fin de medir el tiempo de vida t, los fotones emitidos fosforescente se han agrupado en el tiempo. Por ejemplo, después del impulso de excitación, 200 fotones pueden ser recogidos en los primeros 15 microsegundos, 150 fotones recogidos en los próximos 15 microsegundos, y así sucesivamente, hasta que no se recogen los fotones. Los números de los contenedores en función del tiempo dará la decadencia fosforescencia, que se analiza para obtener el tiempo de vida τ. En las imágenes, este procedimiento se aplica en cada pixel de la imagen, dando lugar a mapas de toda la vida fosforescencia. Las mediciones de tiempos de vida no son sensibles a la heterogeneidad de la distribución de la sonda a través del objeto, que es común para las muestras biológicas. Por lo tanto, las vidas único informe sobre el oxígeno. Τ vidas se convierten en las concentraciones de oxígeno mediante la relación de Stern-Volmer. 2. La construcción de sondas fosforescente Sondas fosforescente para mediciones de oxígeno en los sistemas biológicos consisten en cromóforos fosforescente (núcleos), encapsulado en jaulas construidas de dendrímeros - polímeros hiper muy regular [3]. Dendrímeros proteger a los núcleos de las interacciones con el medio ambiente y el control de la velocidad de difusión de oxígeno a los núcleos, lo que permite optimizar la sensibilidad y el rango dinámico de las sondas (q constante k en la relación de Stern-Volmer). Las terminales de los dendrímeros son modificados con polietilenglicol químicamente inerte hidrofílico (PEG) los grupos, por lo que las sondas altamente soluble en agua y la prevención de su interacción con macromoléculas biológicas. Núcleos fosforescentes de las sondas se Pt o Pd complejos de porfirinas y las porfirinas π extendida. π-extendido porfirinas son las porfirinas en el que los anillos de pirrol se funden con fragmentos aromáticos externo. π-extensión permite el ajuste de las propiedades espectroscópicas de las sondas para satisfacer las necesidades de una aplicación de imagen en particular (por ejemplo, frente a la microscopía tomografía). A modo de ejemplo, se describe la síntesis de tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (PDAR 4 TBP) [4]. PDAR 4 TBP tienen bandas de absorción de gran alcance en el extremo rojo del espectro de la fosforescencia y fuerte, muy adecuado para la medición bioquímica de oxígeno. La síntesis de los cuatro PDAR PDD consta de los siguientes pasos: 2.1) Preparación de tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) por Lindsey condensación [5] de tetrahydroisoindole con benzaldehídos sustituido. Para una solución 0,01 M de tetrahydroisoindole (1 eq) en CH &lt;sub&gt; 2 CL 2, el aldehído aromático (1 eq) se añadió en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente BF 3 O xEt 2 (0,2 eq) se añadió, y la mezcla de reacción se agitó a ta durante 2 h. DDQ (1 eq) se añadió, y la mezcla se deja toda la noche con agitación continua. La solución se lavó con un 10% aq Na 2 SO 3, el 10% aq Na 2 CO 3, 5% HCl aq y finalmente con salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na 2 SO 4, luego se concentró en el vacío. El residuo se recristaliza en CH 2 Cl 2 - terc-butil éter para dar mezcla de Ar 4 TCHP como polvo de color verde. Los rendimientos son alrededor del 50%. 2.2) La inserción de Pd para obtener PDAR 4 TCHPs. Porfirinas base libre (1 eq) fueron tratados con PdCl2 o Pd (OAc) 2 (1,2 eq) en reflujo CH 3 CN en presencia de exceso de Et3N (20 eq). La conversión fue supervisado por espectroscopia UV-vis (disolvente CH 2 Cl 2-AcOH) y se considera completo después de la banda de Soret de 468-472 nm en el dictado desaparecido. La mezcla se deja enfriar, se diluye con CH 2 Cl 2 y se filtra a través de una delgada capa de Celite para eliminar Pd (0). El disolvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice usando CH 2 Cl 2 como solvente. Fracción de color rojo oscuro se recogió, se evaporó el disolvente para dar destino PDAR 4 TCHPs en rendimiento casi cuantitativo. 2.3) PDAR 4 TBP fueron preparados por la oxidación de PDAR 4 TCHPs con el exceso de 2 veces de DDQ (16 eq) en THF a reflujo. Durante el reflujo, el color cambia de rojo oscuro a verde oscuro. El disolvente se evaporó, el ​​residuo se diluyó con CH 2 Cl 2, se lava con aq 10% Na 2 SO 3, agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na 2 SO 4 y se concentró en el vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (eluyente CH 2 Cl 2). La primera fracción de color verde oscuro se recogió, se concentró en vacío para dar un 85-90% de polvo de color azul-verde de PdAr4TBP. 2.4) grupos éster periférica de Pd tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) se hidroliza con 10 veces el exceso de KOH en 1% (v / v) de agua / THF a temperatura ambiente. El disolvente se decantó del precipitado de las sales de potasio forma de derivados de ácidos carboxílicos de la PdAr4TBP. Los sólidos se disuelven en agua, se agita durante 2 horas adicionales, se acidifica con conc. HCl a pH ~ 5.4. El precipitado obtenido se aisló por centrifugación, se lava con agua y se seca al vacío. La protección de dendrones. Cada rama individual del dendrímero se llama dendrón. Dendrones la protección se construye a partir de aril-glicina bloques de construcción (AG). Dendrones AG puede ser fácilmente sintetizado a partir de materias primas baratas y aislado de alta pureza y el rendimiento por cromatografía de métodos libres. Síntesis de la generación 2 (G2) AG-dendrón se compone de los siguientes pasos: 2.4) Síntesis de los bloques de construcción, protegido con Boc 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide y glycineamide 3,5-dibutoxycarbonylphenyl, utilizando el método de Fischer haloacyl haluro. 2.5) El acoplamiento de los bloques de construcción con CDMT / NMM química de péptidos de acoplamiento. 2.6) desprotección del grupo amino focal agitando la solución de la dendrón G2 en TFA durante 2 horas a temperatura ambiente 2.7) Para el montaje de la dendrones mayor generación, acoplamiento / desprotección pasos se repiten. Dendrímero montaje se logra mediante el acoplamiento de la dendrones desprotege para PdAr4TBP (o porfirina otros) utilizando la química de acoplamiento HBTU / DIPEA. 2.8) En primer lugar, los grupos de protección Boc-se eliminan de la dendrón. Por ejemplo, protegido con Boc dendrón G3 (0,58 g) se disolvió en TFA (15 ml), y la mezcla se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. El ácido se elimina por evaporación rotatoria, rindiendo el dendrón como TFA-sal. El residuo seco se disolvió en NMP (10 ml) y unas gotas de DIPEA se han añadido, para calmar las huellas de TFA. 2.9) Antes de iniciar la reacción de acoplamiento, es fundamental que se disuelva completamente la porfirina. Por ejemplo, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) se disolvió en seco NMP (65 ml) mediante calentamiento a 140 º C durante 10 minutos, bajo corriente de nitrógeno. 2.10) La solución se enfrió a temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) se añadió, y la mezcla se agitó durante 5 min. 2.11) DIPEA (0,35 ml) se añadió a la mezcla de una parte, inmediatamente seguido por la adición de la solutiel de TFA-sal de la dendrón en NMP (véase el punto 2.8), y la mezcla se deja toda la noche con agitación. 2.12) La mezcla se vierte en un 3% aq. NaCl (350 ml), y el precipitado resultante se recogió por centrifugación y se lava con agua, metanol, y Et O 2 por la suspensión repetitivas / centrifugación para obtener el objetivo de porfirina-dendrímero. 2.13) para hidrolizar los grupos éster periférica, el dendrímero se trató primero con NME 4 OH (~ 5 mm) en DMSO / MeOH durante 20-60 min período, seguido por la eliminación del disolvente completa. Este procedimiento nos permitió generar dendrímeros con un número suficiente de grupos carboxilato para dar solubilidad acuosa. Para completar la hidrólisis, el dendrímero fue tratado con NaOH acuoso 0,1 N (noche). Como resultado, pura porfirina-dendrímero ácidos carboxílicos pueden ser aislados en los rendimientos de 80-95%. Modificación de la periferia del dendrímero. En este punto, a partir de la misma porfirina-dendrímero, ya sea de uno o sondas de dos fotones pueden ser sintetizadas. En el primer caso, todos los grupos carboxilo periféricos se modifican con las unidades de PEG - una metodología conocida como PEGilación. En este último caso, varios grupos carboxilo son los primeros, junto con cromóforos antena de dos fotones (cumarina-343) modificado con etilendiamina (EDA) enlazadores, seguido por PEGilación de los carboxilos restantes [6]. Los dendrímeros fueron pegilado con monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av.. MW 1000) con HBTU / DIPEA química de acoplamiento. 2.14) a una solución de la dendrón en NMP (o DMF) (1-10 mM) el exceso de 1.25 veces de HBTU se añadió, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Exceso de 6.25 veces de DIPEA se añadió, seguido por la adición inmediata de un exceso de 1,25 veces el de m-PEG-NH2. La mezcla de reacción se agitó durante 2 días a temperatura ambiente. Éter dietílico se añadió a la mezcla de reacción, el precipitado formado se separa por centrifugación y re-precipitado de THF por la adición de éter dietílico. 2.15) Final de la purificación se logró con la cromatografía de exclusión por tamaño de la recogida de la fase del frente primero. Pegilado porfirina-dendrímero se disolvió en una pequeña cantidad de THF (~ 15 ml) y se carga en la parte superior de una columna cromatográfica rellena con poliestireno SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). La columna se eluyó con pura THF, y la banda de color oscuro en movimiento con la parte delantera fue recogida. 2.16) THF se retiró en un evaporador rotatorio, y el material restante se secó en el vacío. 3. Caracterización de la sonda Caracterización fotofísicas incluye mediciones de los espectros de la sonda de absorción y emisión, la fosforescencia vida τ 0 y Stern-Volmer oxígeno enfriamiento constantes k q en condiciones fisiológicas. 3.1) Los espectros de absorción y emisión se obtienen en condiciones ambientales utilizando instrumentación estándar (espectrofotómetro y fluorímetro constante). ~ 1 M de las soluciones de la sonda se utilice. 3.2) A continuación, el gráfico de calibración de Stern-Volmer se obtiene. Esta es la medida más importante, porque nos permite relacionar la vida útil de la sonda a la concentración de oxígeno. 3.3) Una solución de la sonda en tampón PBS (pH 7,2) se coloca en una cubeta especial cilíndrica, que se coloca dentro de la cámara de temperatura controlada, situada dentro de una jaula de luz impermeable con puertos de fibra óptica de excitación y emisión. Las fibras se ponen en contacto con la cubeta interior de la cámara en la geometría en ángulo recto. 3.4) La cubeta se cierra con un tapón, en la que una alta sensibilidad de tipo Clark electrodo de oxígeno (CK-electrodo de oxígeno) se inserta. El tapón también contiene dos puertos de la aguja de entrada y salida de argón. El electrodo se sumerge en la solución, mientras que las agujas se limitan a proporcionar para la circulación de flujo de gas por encima de la superficie de la solución. Al principio, el argón no está conectado a la entrada. 3.5) La temperatura se ajusta al valor deseado (normalmente 36-37 ° C) y la solución se deja en agitación para el equilibrio. 3.6) La fibra de excitación se conecta al puerto de excitación de un phosphorometer digital, operado por una PC. La fuente de luz en el phosphorometer es un LED de alta potencia, cuya producción es controlada por una kHz D 333 / A bordo. La fibra de emisión está conectado a otro puerto óptico de la phosphorometer, que está acoplado a un APD altamente sensible al infrarrojo (fotodiodo de avalancha). La salida del diodo se amplifica y se introduce en el A / D del canal de la tarjeta de control mismo, lo que permite la sincronización entre la excitación y los canales de emisión. 3.7) El software de control almínimos de generación de pulsos de excitación de la longitud deseada (por ejemplo 5 o 10 ms), seguido por la recolección de la decadencia fosforescencia durante cualquier período arbitrario elegido (generalmente 2-3 ms). Tiempo para una medición de toda la vida solo es típicamente 0,5-1 s, sin embargo, las mediciones se pueden obtener con la mayor rapidez 20.10 por segundo. 3.8) La salida del electrodo de oxígeno se amplifica y se dirigió a otro un consejo / D en el mismo PC. Este es un tablero de baja frecuencia (1 kHz máx), que se utiliza para registrar el electrodo de corriente en determinados periodos de tiempo. El programa para la grabación de los datos de electrodos se ejecuta simultáneamente con el software phosphorometer. 3.9) Una vez que la temperatura de la solución es equilibrado, tanto en el phosphorometer y los programas de electrodos se inician al mismo tiempo para realizar las mediciones cada 10 s. Sus resultados son registrados de forma sincrónica en dos archivos separados. Después de eso, el argón se conecta al puerto de entrada en el tapón de la cubeta. 3.10) como el argón fluye sobre la superficie de la solución agitada, poco a poco reemplaza al oxígeno. Esto se traduce en una disminución de la corriente del electrodo y un incremento en la duración de la fosforescencia, que se mide por el phosphorometer. Por lo general, el oxígeno se desplaza forma la solución del todo después de 2 h, tiempo durante el cual los datos están totalmente automáticamente registrado en los archivos. 3.11) Después de la final de la carrera de titulación, los datos del electrodo y la vida fosforescencia se importan a un programa de análisis estándar (Origen Miocrocal por ejemplo). La corriente del electrodo depende linealmente de la concentración de oxígeno, y para el electrodo utilizado es prácticamente cero en el cero de oxígeno. A presión atmosférica, pO 2 es conocida (alrededor de 150 mm Hg). Por lo tanto, los datos de electrodo puede ser convertido directamente en la escala de oxígeno, y la trama de la vida de fosforescencia inversa vs PO 2 puede construir. Esta parcela está equipado con una línea recta por el método de mínimos cuadrados para dar el kq bloqueo del oxígeno constante como su pendiente. Vida fosforescencia t0 se obtiene a partir del mismo corte (como la inversa de la intersección) o directamente desde la medición a cero oxígeno. 3.12) Si es necesario, la valoración se repite con una solución de la sonda en la presencia de albúmina - una proteína presente en el plasma de la sangre en altas concentraciones, - con el fin de emular las condiciones que se encuentran en el sistema experimental real (la sangre de un animal en vivo). La obtención de Stern-Volmer parcelas deberán ser idénticas si el dendrímero es la protección de la sonda y así aislar a los grupos de la sonda PEG de los contactos con la albúmina. De lo contrario, la sonda y las proteínas en la sangre va a interactuar, y que dará lugar a una alteración de Stern-Volmer trama, haciendo que la ambigüedad en la medición de oxígeno. Así obtenido constantes de calibración se utilizan en experimentos de imagen donde las concentraciones de oxígeno son un desconocido a priori.

<ol><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li>
<li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li>
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<li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited%3A+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porphyrins+and+Phthalocyanines%22%5BJournal%5D)">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li>
</ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abreviatura</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Nombre y apellidos</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Ácido trifluoroacético</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropiletilamina</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfato</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimetilsulfóxido</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-cloro-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

La medición de oxígeno por temple fosforescencia [1, 2] se compone de los siguientes pasos: 1) la sonda se introduce en el medio de interés (por ejemplo la sangre o el líquido intersticial), 2) el objeto está iluminado con luz de longitud de onda adecuada para excitar la sonda en su estado triplete, 3) la fosforescencia emitida se recoge, y su evolución en el tiempo se analiza para obtener el tiempo de vida fosforescencia, que se convierte en la concentración de oxígeno (o presión parcial, pO<sub&gt; 2</sub&gt;). La sonda no debe interactuar con el entorno biológico y, en algunos casos a ser 4) excretado por el medio a la finalización de las mediciones. Cada uno de estos pasos impone requisitos en el diseño molecular de las sondas fosforescente, que constituyen el único componente invasivo del protocolo de medición. Aquí hacemos una revisión del diseño de nanosensores dendríticas fosforescente para mediciones de oxígeno en los sistemas biológicos. Las sondas consisten en Pt y Pd porfirina basada en polyarylglycine (AG) dendrímeros, modificar periféricamente con polietilenglicol (PEG) de residuos. Para la eficacia de dos fotones de excitación, terminales de los dendrímeros se puede modificar con dos fotones cromóforos antenas, que captan la energía de excitación y canalizarla a los núcleos de triplete de las sondas a través de intramolecular FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster). Se describen las propiedades clave fotofísicas de las sondas y presentar los protocolos de calibración detallada.

Se presentan los principios de la medición de oxígeno por temple fosforescencia y revisión del diseño de la porfirina basada en nanosensores dendríticas para obtener imágenes de oxígeno en los sistemas biológicos.

Síntesis y caracterización de nanosondas fosforescentes de imágenes de oxígeno en sistemas biológicos

La medición de oxígeno mediante la desactivación de la fosforescencia [1, 2] consiste en los siguientes pasos: 1) la sonda se introduce en el medio de interés (p. ej., sangre...

Presentamos el diseño de sondas fosforescentes para el oxígeno basadas en DER de porfirina de platino y paladio. Las sondas consisten en núcleos de porfirina metálica que encapsulan dendrones y una capa periférica hidrófila de polietilenglicol; en este artículo se ilustrará la construcción de las sondas y sus calibraciones. Hola, mi nombre es Luis Sinks.Trabajo con el profesor Sergei OV en el Departamento de Bioquímica y Biofísica de la Universidad de Pensilvania. Soy Emmanuel Losis, también de la Vina. Yo también soy de la, y soy Sergei. Las mediciones biológicas de oxígeno mediante el apagado de fósforo aprovechan sondas exógenas de fósforo, que se introducen directamente en el medio de interés.Las sondas de sangre o líquido intersticial son el único componente invasivo del esquema de medición que requiere atención especial en su diseño. Hoy les mostraremos un procedimiento para la síntesis y calibración de nano sondas dendríticas fosforescentes para la medición de oxígeno en sistemas biológicos. Utilizamos este procedimiento para sintetizar y caracterizar sondas para mediciones de oxígeno semiplenas y dobles.Así que comencemos. Antes de empezar a construir las sondas, repasemos primero la teoría básica detrás de la fosforescencia de las sondas. La fosforescencia se origina a partir del estado triplete de larga duración.La molécula sonda debe diseñarse para proporcionar un alto rendimiento cuántico del estado triple y para emitir fosforescencia en lugar de fluorescencia. La excitación de las sondas ocurre mediante un fotón o, en el caso de sondas especiales con mejora de dos fotones, mediante el mecanismo de dos fotones. La excitación con un fotón generalmente ofrece una resolución espacial menor, pero requiere instrumentación más sencilla y puede utilizarse en mediciones puntuales con perfiles fosforimétricos de fibra óptica basados en LED.En el estado triplete, la sonda puede experimentar encuentros por colisión con moléculas de oxígeno, lo que puede desactivar el estado triplete en un proceso denominado extinción. Por lo tanto, en presencia de oxígeno, la vida media de la fosforescencia se acorta. Como resultado de la extinción, la dependencia de la vida media del estado triplete respecto a la cantidad de oxígeno en el entorno se describe mediante la ecuación de Stern-Volmer.En experimentos in vivo, la sonda se administra en la sangre o en el líquido intersticial de un animal, y la superficie del tejido se ilumina con luz de una longitud de onda adecuada para llevar la sonda a su estado triplete excitado. Con el fin de medir la vida media de la fosforescencia, los fotones fosforescentes emitidos se distribuyen en el tiempo. Por ejemplo, después del pulso de excitación, podrían recolectarse 3.609 fotones en los primeros cinco microsegundos, 1.421 fotones en los siguientes cinco microsegundos, y así sucesivamente hasta que ya no se recolecten fotones.Los números en los contenedores graficados frente al tiempo dan lugar al decaimiento de la fosforescencia, que se analiza para obtener el tiempo de vida fosforescente. En la obtención de imágenes, este procedimiento se aplica a cada píxel de la imagen, generando mapas del tiempo de vida fosforescente. Las mediciones de tiempos de vida son insensibles a las heterogeneidades en la distribución del indicador a través del objeto, lo cual es común en muestras biológicas.Ahora veamos cómo construir las sondas. Inicie el procedimiento de síntesis añadiendo un aldehído aromático a una solución 0,01 molar de tetra hidro iso indol. Agite la mezcla de reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad.Luego, agregue boro, trifluoruro de daticilo, y continúe agitando durante otras dos horas. A continuación, agregue dicloruro de cianógeno, benzoquinona o DDQ, lo que provoca un cambio de color, de rojo pálido a verde intenso, y deje la mezcla durante la noche bajo agitación continua. Al día siguiente, lave y seque la solución, y luego concéntrela al vacío.La cristalización del residuo proporciona el producto objetivo como un polvo verde. Los rendimientos suelen ser aproximadamente del 50 %. A continuación, trate el porfirina en forma de base libre con acetato de paladio. Monitoree la conversión mediante espectroscopía UV-visible.La conversión se completa cuando desaparece la banda de absorción del Dion entre 468 y 472 nanómetros. El porfirino se aísla mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice. Para preparar el porfirino tetra benceno de paladio, oxide el porfirino tetra ciclo de paladio.Durante la reflexión, el color cambia de rojo oscuro a verde intenso, se evapora el disolvente, se diluye el residuo con lavado de diclorometano, se seca y se concentra la fase orgánica al vacío. Tras la cromatografía sobre gel de sílice, se aísla el porfirino de tetra-benzo paladio como un polvo azulverdoso. A continuación, se hidrolizan los grupos periféricos etro del porfirino de paladio trabenzo.Primero trate el éster de tetra benceno porfirina con base en tetrahidrofurano. Luego continúe la hidrólisis con base acuosa, precipite la porfirina mediante la adición de ácido clorhídrico y séquela al vacío. Esto completa la síntesis de la porfirina.Ahora veamos cómo sintetizar los entrones. Antes de ensamblar las sondas, los entrones, que son las ramas del Denmark, deben pre-sintetizarse. Utilizamos aero glicol, mismos DER, que pueden prepararse convenientemente a partir de materiales de estudio económicos mediante métodos libres de cromatografía.Los dendrímeros con grupos amino en sus puntos focales se unen luego a los grupos caril del fito, cuya síntesis acaban de mostrar. A continuación, los grupos éster en la periferia del DME se hidrolizan de manera similar a los grupos carboxílicos en la periferia de la porfirina. En este punto, a partir del ácido poli-carboxílico de porfirina DME, se puede sintetizar uno o dos sondas de fotones para obtener las sondas de dos fotones.Primero, fije divergentemente algunos fragmentos de antena de dos fotones a varios grupos carboxilo en la periferia del dímero. Ahora continúe con la modificación de los restantes residuos de ácido carboxílico en el dímero. Comience añadiendo un exceso de 1,25 veces de HBTU a una solución altamente concentrada del porfirín dímero y agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos.Ahora, agregue diisopropiletilamina y metoxi polietilenglicolamina. Agite la mezcla de reacción durante dos días a temperatura ambiente y luego agregue éter etílico. Separe el precipitado mediante centrifugación y vuelva a precipitarlo varias veces a partir de tetrahedrano añadiendo éter etílico.Finalmente, purifique la sonda mediante cromatografía de exclusión por tamaño en bolas de poliestireno utilizando tetrahedrano como disolvente. Ahora analicemos la caracterización y calibración de la sonda. Los espectros de absorción y emisión de la sonda se obtienen usando soluciones de sonda de un micromolar en condiciones ambientales con un espectrofotómetro estándar y un fluorímetro en estado estacionario.A continuación, para obtener la gráfica de calibración de Stern Ulmer, que nos permite relacionar la vida media del indicador con la concentración de oxígeno, coloque una solución del indicador en un vial cilíndrico especial. El vial se coloca dentro de una cámara con control de temperatura, ubicada dentro de una jaula impermeable a la luz que tiene puertos para las fibras ópticas de excitación y emisión. Cierre el vial con un tapón que tiene insertado un electrodo de oxígeno de tipo Clark altamente sensible.El tapón también tiene dos puertos para agujas de entrada y salida de Argón. Ajuste la temperatura a entre 36 y 37 grados Celsius y deje que la solución se agite hasta que alcance el equilibrio. Conecte la fibra de excitación a la entrada de excitación de un fosforímetro digital controlado por una computadora.La fuente de luz y el perímetro fósforo es un LED de alta potencia, cuya salida está controlada por una placa digital a analógica de 333 kilohercios. La fibra de emisión está conectada a otro puerto óptico del perímetro fósforo, que a su vez está acoplado a un fotodiodo de avalancha sensible al infrarrojo. La salida del fotodiodo se amplifica y se introduce en el canal ad de la misma placa de control, lo que permite la sincronización entre los canales de excitación y emisión.El software de control desarrollado en casa genera pulsos de excitación de cualquier duración deseada, seguidos por la recopilación del decaimiento de la fosforescencia. La salida del electrodo de oxígeno se amplifica y dirige a otra placa analógica digital en el mismo ordenador. Esta es una placa de baja frecuencia, con un máximo de un kilohercio, que se utiliza para registrar la corriente del electrodo en puntos de tiempo seleccionados, típicamente 10 veces por segundo.Una vez que la temperatura de la solución se ha equilibrado, se inicializan simultáneamente el perímetro Phos y los programas del electrodo. Para realizar mediciones cada 10 segundos, sus resultados se registran de forma sincrónica en dos archivos separados. A continuación, Argonne se conecta al puerto de entrada del tapón de goma.Mientras el argón fluye sobre la superficie de la solución agitada, reemplaza gradualmente al oxígeno. Esto provoca una disminución de la corriente del electrodo y un aumento en la vida media del fósforo, que se mide mediante el perímetro de fósforo. Por lo general, el oxígeno se desplaza completamente de la solución.Después de aproximadamente dos horas de finalizada la corrida de titulación, los datos del electrodo y los tiempos de vida del fósforo se importan a un programa estándar de análisis, que genera una gráfica del inverso del tiempo de vida del fósforo frente a la presión parcial de oxígeno. Esta gráfica se ajusta mediante una línea recta utilizando el método de mínimos cuadrados, obteniéndose la constante de extinción por oxígeno como su pendiente. El tiempo de vida fosforescente se obtiene bien a partir del mismo ajuste o directamente a partir de la medición a oxígeno cero.La titulación puede repetirse utilizando una solución del sonda en presencia de albúmina, una proteína presente en el plasma sanguíneo para emular las condiciones encontradas en la sangre de un animal in vivo. Las gráficas de Stern-Volmer obtenidas deberían ser idénticas si el ER está protegiendo al sonda. Bueno, y los grupos peg aíslan al sonda del contacto con la albúmina.La sugerencia aquí es seleccionar pasos en la síntesis de oxígeno, luego tratar las sondas y su calibración. Al realizar la calibración, es importante asegurarse de que las condiciones sean lo más parecidas posible a las del sistema biológico de interés.Es importante asegurarse de que la molécula sonda no se vea afectada por biomoléculas, como la albúmina. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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