Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

La determinación del contenido y la composición de la lignina de las paredes celulares de las plantas comienza con el material vegetal seco, que se somete a varias extracciones. El material resultante consiste solo en paredes celulares y luego se divide para determinar el contenido de lignina. El material de la pared se somete a hidrólisis por bromuro de acetilo y los mono ales solubilizados se cuantifican mediante espectrometría UV para la determinación de la composición de la lignina.

El material de la pared se hidroliza por citólisis. A continuación, los componentes de lignina solubilizados se derivan de sus derivados salinos trimetilsalinos volátiles, que pueden separarse y cuantificarse mediante cromatografía de gases junto con espectrometría de masas. La determinación de la composición de polisacáridos de la matriz y el contenido de celulosa se demuestra en otro video titulado Análisis composicional integral de las paredes celulares de las plantas, parte dos Carbohidratos.

Hola, soy Marcus Pauley, jefe de las instalaciones analíticas de Wall en el Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos aquí en la Universidad Estatal de Michigan. Soy Cliff Foster, director del centro de análisis de la pared celular. Le mostraremos el procedimiento para determinar el contenido y la composición de las muestras de biomasa vegetal.

Las plantas convierten la energía luminosa del sol en energía química como la biomasa. La biomasa vegetal consiste principalmente en paredes celulares, una red compleja de una variedad de polímeros que recubren todas las células vegetales. Aquí determinamos la composición de los materiales de la pared celular de las plantas para evaluar el potencial de transformación de estas ligninas Celosa X, que son un recurso renovable muy abundante, en biocombustibles.

Hoy nos centraremos en el polifenol lignina en otro video titulado Análisis composicional integral de las paredes celulares de las plantas, parte dos carbohidratos. Nos centraremos en el análisis de polisacáridos. Para comenzar este procedimiento, agregue tres bolas de acero inoxidable de 5.5 milímetros a un tubo de rosca sared de dos mililitros y aproximadamente 60 a 70 miligramos de material vegetal liofilizado o al aire.

El material se puede moler hasta convertirlo en un polvo fino mediante el uso de eyewall, un robot de molienda y dispensación. La pared del ojo toma el tubo y lo agita durante 30 segundos, donde debido a las bolas de metal, el material se muele hasta convertirlo en un polvo fino, luego el polvo vegetal molido, pero compacto, se afloja en un procedimiento alternativo no robótico de bajo rendimiento. En la segunda parte se presenta la facilitación de una retro, se añade 1,5 M de etanol acuoso al 70% del vórtice del material molido y se centrifuga a temperatura ambiente.

Este tratamiento solubiliza la mayoría de las proteínas y orgánulos celulares, aspira el sobrenadante y añade un volumen de uno a uno. La solución de metanol de cloroformo para el pellet insoluble en alcohol agite bien para volver a girar el pellet y la centrífuga. El metanol de cloroformo extrae los compuestos hidrofóbicos, como los lípidos, después de la centrifugación, aspira el sobrenadante y resuspende el pellet y 500 microlitros de acetona.

Para secar la muestra, evapore el solvente con una corriente de aire a 35 grados centígrados hasta que se seque, las muestras secas se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento. Para iniciar la eliminación del almidón de la muestra reus, suspenda el pellet y 1,5 milésimas de pulgada de acetato de sodio 0,1 molar pH cinco tape los tubos y caliéntelos en un bloque calefactor para gelatinizar el almidón. Después de enfriar la suspensión en hielo, agregue la mezcla de enzimas degradadoras de almidón, tape el tubo y el vórtice, incube completamente la suspensión durante la noche.

En el agitador a 37 grados centígrados, un agitador de rotación asegura una mezcla adecuada. Después de la incubación nocturna, termine la digestión calentando en un bloque calefactor a 100 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, centrifugar y desechar el sobrenadante, que contiene un almidón solubilizado.

Lave el pellet restante tres veces usando 1.5 milésimas de pulgada de pulgada de agua cada vez mediante vórtice, centrifugado y decantación como se demostró anteriormente. Finalmente, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de acetona y evapore el solvente con una corriente de aire a 35 grados centígrados hasta que se seque. Las muestras secas que contienen pared celular aislada o pata, sin celulosas, están listas para un análisis posterior y se pueden almacenar a temperatura ambiente.

Comience pesando de uno a 1.5 miligramos de material de pared celular preparado. El material se puede pesar a mano o de forma automatizada con la pared del ojo, como se demuestra en la segunda parte. Enjuague las paredes del tubo con 250 microlitros de acetona para recoger el material de la pared celular en la parte inferior del tubo y evapore la acetona muy suavemente bajo el flujo de aire.

Después de que la acetona se haya evaporado, agregue suavemente 100 microlitros de bromuro de acetilo recién hecho al 25% de volumen a volumen en ácido acético glacial a lo largo de las dos paredes. Para evitar salpicaduras, un bromuro sutil descompone el polímero de lignina en sus monos acetilados. A continuación, tape el matraz volumétrico y caliente a 50 grados centígrados durante dos horas.

Calentar una hora adicional con cuatro mensajes de texto cada 15 minutos, y finalmente enfriar en hielo A temperatura ambiente, después de enfriar el matraz, agregue 400 microlitros de hidróxido de sodio de dos molares y 70 microlitros de vórtice de clorhidrato de hidroxilamina molar 0,5 molar recién preparado, los matraces volumétricos. A continuación, neutralice la solución llenando el matraz volumétrico exactamente hasta la marca de dos mililitros con tapa de ácido acético glacial e invierta varias veces para mezclar con pipeta 200 microlitros de la solución que contiene los mono lales hidrolizados y solubilizados en una placa de 96 pocillos específica para UV y lea la placa en un lector de placas de pocillos a 280 nanómetros. Lea la placa al menos tres veces y promedie la absorbancia, ya que las partículas pueden causar una ligera variación en los valores de absorbancia.

Determine el porcentaje de lignina soluble en bromuro sutil o A BSL utilizando el coeficiente vegetal apropiado con la fórmula presentada en el protocolo escrito. La lignina es una red de polifenoles que consta principalmente de tres subunidades, P hidroxifenol, gua ACell y unidades de rollo de primavera para determinar la composición de la lignina en el material vegetal. Comience transfiriendo aproximadamente dos miligramos de material de la pared celular a un tubo de vidrio con tapa de rosca para la citólisis.

A continuación, prepárese para preparar la solución de etilo de trifluoruro de boro al 2,5 % y tiol de etano al 10 % en dioxano. Dado que el dioxano es muy peligroso, no saque ninguna muestra o equipo del capó. Recuerde trabajar con mucho cuidado y utilizar un globo lleno de gas nitrógeno para desplazar el volumen perdido en la botella de dioxano con nitrógeno.

Prepare la solución mezclando los siguientes volúmenes por muestra: 175 microlitros, dioxano, 20 microlitros, ETSH cinco, microlitros, BF tres. Después de mezclar, agregue 200 microlitros de la solución a cada muestra. Purgue el espacio de cabeza del vial con gas nitrógeno y tapón.

Proceda inmediatamente a calentar las muestras a 100 grados centígrados durante cuatro horas con una mezcla suave cada hora al final. Reacción de lisis de Theo Ace en hielo durante cinco minutos. A continuación, añadir 150 microlitros de bicarbonato sódico 0,4 molar para neutralizar y vórtice.

Para la limpieza de los productos de descomposición de la lignina, agregue una milésima de pulgada de agua y 0,5 milésimas de pulgada de vórtice de acetato y deje que las fases se separen. La capa de acetato de etilo estará en la parte superior y el agua en la parte inferior. Transfiera 150 microlitros de la capa superior de acetato de Ethel que contiene los componentes de lignina a un tubo de dos milésimas de pulgada, asegurándose de que no se transfiera agua.

Después de la transferencia desde la capa superior de acetato de Ethel, evapore el solvente usando un concentrador con aire. Añadir 200 microlitros de acetona y evaporar. Repite el tratamiento con acetona dos veces para eliminar el exceso de agua.

A continuación, derivar los componentes de la lignina a sus derivados volátiles trimetil Cy Lane. Agregue 500 microlitros de acetato de etilo, 20 microlitros de purina y 100 microlitros de trimetilcilacetamida NO biss a cada tubo. Incubar durante dos horas a 25 grados centígrados.

Al final de las dos horas, transfiera 100 microlitros de la reacción a un vial de GC MS y agregue 100 microlitros de acetona. Analice las muestras por GC equipado con un espectrómetro de masas cuádruple o un detector de ionización de llama. Para conocer la columna y los detalles de la ejecución, consulte el protocolo escrito adjunto.

A continuación, se presentan algunos resultados representativos del análisis de lignina utilizando madera de álamo como material vegetal. Según este análisis, el 22% del material de álamo consiste en el polifenol lignina. La composición de los componentes de la lignina se analizó mediante GCMS.

Los picos se identifican por los tiempos de retención relativos utilizando el patrón interno de tetra coane o por iconos de espectro de masas característicos de 2 99 MZ, 2 69 MZ y 2 39 MZ para los monómeros sg y h, respectivamente. La composición de los componentes de la lignina se cuantifica estableciendo el área de pico total en 100%El análisis de composición muestra que esta muestra en particular contiene principalmente unidades de cadena o S. Sin embargo, también abundan las unidades Goya, AOL o G.

Obviamente, la cantidad y la composición de la unidad monolial pueden variar según el tejido y la especie de la planta. Acabamos de mostrarle cómo determinar el contenido y la composición de lignina del material vegetal para el análisis de polisacáridos. Pasar a la segunda parte.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.