Name: Preparación de los cromosomas politénicos de Drosophila Calabazas para el Etiquetado de anticuerpos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprende la técnica de aplastamiento para preparar cromosomas politénicos de Drosophila melanogaster destinados al etiquetado de anticuerpos. Este método permite visualizar proteínas específicas mediante microscopía.

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Agradecemos a la Sra. V. Lephart para el mantenimiento de poblaciones de moscas Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención (GM62916) y la National Science Foundation (MCB0817107).

El siguiente protocolo para la preparación de la calabaza politénicos cromosoma es una adaptación del procedimiento descrito en Johansen et al. (2009). 1. Cultura de tercer estadio las larvas de Drosophila Con el fin de obtener óptimos cromosomas politénicos de alta calidad de las preparaciones squash, las condiciones de cultivo con poca gente son esenciales (es decir, el lugar alrededor de 20 huevos moscas hembra en un estándar de 4 botellas vuelan "y el cambio de una botella nueva cada día). Elija el más gordo de los individuos de la primera cosecha de la escalada tercera larvas mientras que todavía están vagando, pero justo antes de la pupación. De manera rutinaria la cultura a 21 ° C, pero 18 ° C se producen mayores cromosomas que pueden ser más adecuados para ciertos fines, como por ejemplo, cuando la banda / regiones interbandas necesidad de ser visualizadas en alta resolución. 2. Materiales politénicos de squash <ul><li> Drummond pinzas de disección (2) </li><li> Placas de Petri (60 x 15 mm) </li><li> Frosted portaobjetos de microscopio (Fisher N º 12-544-3) (poli-lisina) </li><li> 22 x 22 mm N º 15 cubreobjetos (Fisher No. 12-520B) (recubierto con Sigmacote; Sigma # SL2) </li><li> 22 x 40 mm N º 15 cubreobjetos (Fisher No. 12-530B) </li><li> Kim-toallitas </li><li> Microscopio de contraste de fase con el objetivo de 20X </li><li> Dewar pequeña (por ejemplo, termo o botella termo) </li><li> Unas pinzas largas </li><li> Hojas de afeitar </li><li> Coplin Jar </li><li> De goma-Maid o en la bandeja de Tupperware (o la bandeja de cierre hermético equivalente) </li><li> Parafilm (cortadas en cuadrados de 22 mm) </li><li> 175 g de peso </li></ul> 3. Fijadores y soluciones <ol><li> Acciones de formaldehído 5X. Prepare una solución fresca de 0,74 g. paraformaldehído en 4,0 ml de dH 2 O y con 28 l de KOH 1N. Calentar a 65 ° C para disolver el paraformaldehído y luego almacenar en hielo. </li><li> Fijador 1. Prepare una solución fresca de 0,5 ml de PBS 10X, 50μl Triton X-100, 3,45 ml dH 2 O y 1,0 ml de una reserva de formaldehído 5X. Caliente para dispersar a la Triton X-100 y su uso dentro de una hora. </li><li> Fijador 2. Prepare una solución fresca de 1,5 ml de dH 2 O, 2,5 ml de ácido acético glacial, y 1,0 ml de una reserva de formaldehído 5X y su uso dentro de una hora. </li><li> Solución de ácido Lactoacetic. Prepare una solución de ácido láctico de 1 ml, 2 ml de dH 2 O, y 3 ml de ácido acético. </li></ol> 4. Cromosomas politénicos de squash preparación: <ol><li> Enjuague con agua las larvas y la transferencia de PBS en una placa de cultivo de tejidos para la disección. </li><li> Agarre la punta de la boca ganchos con un par de pinzas, sujete el cuerpo aproximadamente 2 / 3 del camino hacia abajo con la otra pareja, y tirar de la boca ganchos para las glándulas salivales están expuestos. Separar las glándulas salivales del cerebro y los ojos-antenal discos, y diseccionar la grasa corporal y los tejidos asociados a otros de las glándulas. </li><li> Añadir 200 microlitros de un fijador para el primer pozo de una diapositiva de la depresión y dos y 200 a 300 microlitros de fijador y 2 a dos. La transferencia de un par de glándulas salivales en un momento en que un fijador en un bien e incubar la cantidad de tiempo requerido para el epítopo objetivo, por lo general unos 1-2 minutos. (Nota: algunos epítopos, como la mayoría de las modificaciones de las histonas, puede requerir 5 minutos o más la fijación.) </li><li> Pinzas mediante la transferencia de las glándulas salivales de fijador y 2 en 2 y se incuba durante dos minutos. </li><li> Transferencia de las glándulas de 10-30 l de solución de ácido Lactoacetic en un cubreobjetos Sigmacoted limpio. Baje suavemente el portaobjetos del microscopio recubiertos con polilisina sobre el cubreobjetos y, sin aplicar presión vertical, levante el cubreobjetos para las glándulas se encuentran entre el portaobjetos y un cubreobjetos el. Inmediatamente facilitar la lisis celular y la difusión de los cromosomas con cuidado agarrando el cubreobjetos con unas pinzas en un borde y suavemente mueve un poco hacia atrás y hacia delante, tratando de minimizar cualquier presión vertical sobre el tejido. También puedes utilizar el lado de goma de un lápiz o un dedo para mover suavemente el cubreobjetos de ida y vuelta. Tenga en cuenta que cualquier retraso en el movimiento de la cubreobjetos de ida y vuelta es probable que disminuya la difusión de los brazos cromosómicos ya que tienden a ser más rígidos con la exposición a la solución de ácido Lactoacetic. Enturbiamiento de la solución es a menudo una buena indicación de la separación de células. Golpeando suavemente el cubreobjetos oblicua (para evitar la presión vertical) con la cara de goma de un lápiz un par de veces también puede ayudar en la difusión de los cromosomas. </li><li> Inmediatamente examinar el tejido bajo un microscopio de contraste de fase con un objetivo de 20 o 40 veces para determinar si los cromosomas están bien extendidas. </li><li> Cuando la difusión de los cromosomas es suficiente, establezca la diapositiva con la parte cubreobjetos abajo en una pila de agua limpia Kim-toallitas. Coloque un segundo Kim-borrar en la parte superior y aplanar los cromosomas, colocando el pulgar sobre el lugar donde se coloca el cubreobjetos y presionar con firmeza, evitando cualquier movimiento horizontal del cubreobjetos que se cortelos cromosomas. </li><li> Examinar el portaobjetos de nuevo bajo el microscopio para determinar si la preparación es adecuada para el propósito previsto. Si los cromosomas se han movido de manera significativa a aplastar, usar menos volumen de solución ácida Lactoacetic en su preparación posterior. Repita los pasos 4.1-4.8 hasta un número suficiente de diapositivas adecuadas se han obtenido. Lugar 175 pesos g en el cubreobjetos de las diapositivas. </li><li> Llenar un pequeño Dewar (por ejemplo, termo) con nitrógeno líquido. Con una pinza larga, baño caer en N 2 líquido hasta que deje de hervir, retire de diapositivas, e inmediatamente utilizar el borde de una hoja de afeitar limpia en una esquina para voltear de la cubreobjetos. Si de diapositivas se puede utilizar de inmediato, colocar en un frasco Coplin con PBS a 4 ° C. Cualquier forma de recolectar la diapositiva en una jarra Coplin llena de etanol al 95%. Examinar el portaobjetos una vez que el hielo se ha sublimado lejos de confirmar que el tejido adherido a la diapositiva y no quedarse con el cubreobjetos. Repita con el resto de las diapositivas hasta que todas las diapositivas se almacenan en PBS (para su uso dentro de varias horas) o etanol (para un almacenamiento más largo plazo). </li></ol> Resultados representante El primer paso crítico para la obtención de politénicos de alta calidad de la preparación de squash es hacer crecer las larvas de grasa con núcleos grandes glándulas salivales. El segundo es una buena técnica con el procedimiento de difusión, que puede tomar un poco de práctica. Un consejo para el éxito de la mejora se está extendiendo para encontrar el volumen mínimo de solución de ácido lactoacetic durante el paso de aplastamiento. Esto promoverá la suficiente difusión de los cromosomas sin generar excesivas fuerzas de transmisión que puede lavarse los brazos cromosómicos de distancia. Es también digno de mención que cualquier retraso en el movimiento de la cubreobjetos de ida y vuelta se reducirá la difusión de los brazos cromosómicos, ya que se vuelven más rígidos cuando son expuestos a la solución de ácido Lactoacetic. Si todo va bien, debería haber numerosas y difundir los cromosomas politénicos. La figura 1 muestra un ejemplo de este tipo de preparación, el doble etiquetado con un marcador para las regiones interbandas en verde y con un colorante que tiñe las regiones con bandas de color azul. Si es insuficiente la difusión se obtiene, los cromosomas se verá como bolitas, como se muestra en la Figura 2. Por otro lado, si mucho la difusión que ha ocurrido, el chomosomes será demasiado delgada y se extendió en algunos casos, fragmentado en pedazos pequeños, como se muestra en la Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparación de calabaza politénicos doble etiquetado con anticuerpos contra el JIL-1 histona H3S10 quinasa (en rojo) y Hoechst (azul). <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Politénicos calabaza con la difusión suficiente. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Calabaza politénicos con demasiada difusión.

<ol><li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li>
<li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dros.+Inf.+Serv%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li>
<li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li>
</ol>

La inclusión de los ácidos acético y láctico en los protocolos convencionales de squash fijación facilita tanto la resolución interbandas y brazo cromosómico de propagación, pero, lamentablemente, algunos epítopos no sobreviven a este tratamiento. Un ejemplo de este tipo es un epítopo H3S10ph (Cai et al., 2008). Dado que el tratamiento con ácido también tiene la desventaja de que apaga la fluorescencia intrínseca de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas, DiMario et al. (2006) ha desarro...

preparación de los cromosomas politénicos de drosophila calabazas para el etiquetado de anticuerpos

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila ha sido durante mucho tiempo un sistema modelo preferido para el estudio de la relación entre la estructura de la cromatina y la regulación de genes debido a las ventajas citológico siempre por el gigante de los cromosomas politénicos de las glándulas salivales de las larvas. En este tejido se someten a los cromosomas de muchas rondas de replicación en la ausencia de división celular que da lugar a unas 1000 copias. El ADN permanece alineado después de cada ciclo de replicación de los cromosomas que resulta muy ampliado que proporcionan una oportunidad única para relacionar la morfología de la cromatina con la localización de proteínas específicas. En consecuencia, ha habido un alto nivel de interés en la definición de las modificaciones epigenéticas presentes en genes diferentes y en diferentes etapas del proceso de transcripción. Una herramienta importante para estos estudios es el etiquetado de los cromosomas politénicos con anticuerpos frente a la enzima, el factor de transcripción, o modificación de las histonas de interés. Este protocolo de vídeo muestra la técnica de squash utilizados en el laboratorio para preparar Johansen Drosophila cromosomas politénicos para el etiquetado de anticuerpos.

Este protocolo de vídeo muestra la técnica de squash utilizados en el laboratorio para preparar Johansen<em&gt; Drosophila</em&gt; Cromosomas politénicos para el etiquetado de anticuerpos.

Preparación de los cromosomas politénicos de Drosophila Calabazas para el Etiquetado de anticuerpos

Drosophila ha sido durante mucho tiempo un sistema modelo predilecto para estudiar la relación entre la estructura de la cromatina y la regulación génica debido a la citológica...

Este procedimiento comienza con el cultivo de larvas de tercer estadio de drosófila en botellas para moscas. Utilizando dos pares de pinzas, se diseccionan las glándulas salivales de las larvas. Luego, las glándulas salivales se fijan correctamente en dos fijadores diferentes en un portaobjetos con dos cavidades.Finalmente, las glándulas se aplastan en una solución de ácido láctico acético entre una lámina de cobertura y una portaobjetos. Hola, soy la doctora Kristen Johansen del Departamento de Bioquímica, Biofísica y Biología Molecular de la Universidad Estatal de Iowa. Hola, soy estudiante de posgrado asistente de enseñanza en el laboratorio de Johansen.Hoy les vamos a mostrar un procedimiento para realizar preparaciones de cromosomas politénicos de drosófila, adecuadas para la marcación con anticuerpos. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar modificaciones epigenéticas de la cromatina y su relación con la estructura de la cromatina y la expresión génica. Así que comencemos.Para obtener cromosomas politénicos óptimos para preparaciones de calidad alta por aplastamiento, son esenciales condiciones de cultivo no congestionadas. Coloque aproximadamente 20 moscas hembras ponedoras en un frasco estándar de cuatro pulgadas y cámbielas a un frasco nuevo cada día. El cultivo a 21 grados Celsius es adecuado para la mayoría de los propósitos, pero la incubación a 18 grados Celsius producirá cromosomas más gruesos que pueden ser más adecuados para algunos experimentos, como cuando se necesiten visualizar regiones interbanda prohibidas con alta resolución.Seleccione los individuos más gordos del primer cultivo de larvas de tercer estadio trepadoras en estrella. Mientras aún están en movimiento, pero justo antes de la pupación, las larvas son fácilmente visibles en la pared del frasco, por encima del alimento. Utilice pinzas para colocar las larvas en una placa de cultivo de tejidos.Para cada ronda de aplastamiento, enjuague dos o tres larvas juntas con agua antes de transferirlas a un recipiente limpio con PBS para la disección. El PBS debe cubrir las larvas, pero el tiempo no es crucial. Dado que las larvas pueden sobrevivir bajo estas condiciones durante horas, coloque el recipiente con las larvas en PBS sobre la platina de un microscopio estereoscópico con un par de pinzas.Sujete la punta de los ganchos bucales mientras sostiene el cuerpo. Aproximadamente a dos tercios del camino hacia abajo, use un segundo par para tirar de los ganchos bucales con la pinza y exponer las glándulas salivales. Separe las glándulas salivales del cerebro, los ojos, los discos tenales y seccione el cuerpo graso y cualquier otro tejido asociado.Añada 200 microlitros del fijador uno al primer pocillo de un portaobjetos con dos pocillos y de 200 a 300 microlitros del fijador. Dos al pocillo dos. Transfiera un par de glándulas salivales a la vez al fijador uno en el pocillo uno e incube durante el tiempo necesario para el epítopo diana, normalmente de uno a dos minutos, utilizando pinzas.Transfiera las glándulas salivales para fijarlas, dos en dos, y dos e incube durante dos minutos. Usando pinzas, transfiera las glándulas a un cubreobjetos limpio recubierto con sigma y con 10 a 30 microlitros de solución recién preparada de ácido láctico acético. Baje suavemente un microscopio recubierto con polilisina. Deslice sobre el cubreobjetos.Levante cuidadosamente la lámina utilizando la adhesión del líquido al vidrio para recoger la cubreobjetos sin aplicar presión vertical. Para preparar la muestra y extender inmediatamente los cromosomas, agarre con cuidado el borde de la cubreobjetos con pinzas y muévala suavemente ligeramente de un lado a otro. Nuevamente, minimizando la presión vertical sobre el tejido, el movimiento oscilante de la cubreobjetos es importante para separar adecuadamente las células individuales de la glándula salival.Golpear suavemente la lámina de cubierta en ángulo con el extremo de goma de un lápiz también puede ayudar a extender la solución; la aparición de turbidez suele ser una buena indicación de la separación celular. Examine inmediatamente el tejido bajo un microscopio de contraste de fases para verificar que los cromosomas estén bien extendidos, lo que se evidencia por brazos cromosómicos claramente separados y alargados. Si los cromosomas no aparecen bien extendidos la primera vez.Es posible repetir el golpeteo suave de la cubreobjetos hasta obtener una extensión adecuada. Coloque el portaobjetos con la cubreobjetos hacia abajo sobre un montón de toallas limpias de Kim. Coloque una toalla limpia encima de la preparación.Coloque el pulgar sobre la posición del cubreobjetos y presione firmemente hacia abajo en línea recta. Evite cualquier movimiento horizontal, ya que esto podría cortar los cromosomas. Vuelva a examinar la preparación bajo el microscopio para determinar su idoneidad para el experimento actual.Repita la disección y la preparación del aplastamiento cromosómico para obtener un número suficiente de portaobjetos. Coloque un peso de 175 gramos sobre el cubreobjetos de los portaobjetos utilizando pinzas largas. Sumerja un portaobjetos preparado en un pequeño recipiente con nitrógeno líquido y manténgalo allí hasta que cese la ebullición.Retire el portaobjetos e inmediatamente use el borde de una cuchilla de afeitar limpia bajo la esquina del cubreobjetos para levantarlo. Recoja el portaobjetos en un frasco coplano lleno de PBS frío para su uso inmediato, o lleno con etanol al 95 % para almacenamiento prolongado. Una vez que la escarcha haya sublimado por completo, examine el cubreobjetos para confirmar que el tejido permaneció adherido al portaobjetos.El primer paso fundamental para obtener una preparación de aplastamiento de INE de alta calidad consiste en cultivar larvas gordas con núcleos grandes en las glándulas salivales. El segundo paso es dominar bien la técnica del procedimiento de extensión, lo cual puede requerir algo de práctica. Un consejo para mejorar el éxito en la extensión es determinar el volumen mínimo de solución de ácido láctico acético durante el paso de aplastamiento.Esto promoverá una extensión suficiente de los cromosomas sin generar fuerzas de flujo excesivas que puedan arrastrar los brazos cromosómicos. También es importante tener en cuenta que cualquier demora al mover la cubreobjetos hacia adelante y hacia atrás reducirá la extensión de los brazos cromosómicos, ya que estos se vuelven más rígidos al estar expuestos a la solución de ácido láctico acético. Si todo transcurre correctamente en cada portaobjetos, deberían observarse numerosos cromosomas politénicos bien extendidos.Aquí mostramos un ejemplo de una preparación de este tipo marcada doblemente con un marcador para las regiones interbanda en rojo y con un colorante que tiñe las regiones en banda en azul. Si se obtiene una dispersión insuficiente, los cromosomas tendrán el aspecto de pequeñas esferas como se muestra aquí. Por otro lado, si ha ocurrido una dispersión excesiva, los cromosomas serán demasiado delgados y alargados o, en algunos casos, se fragmentarán en pequeños trozos como se muestra aquí.Así que acaban de mostrarle cómo hacer preparaciones en squash de cromosomas politénicos de drosófila. Al realizar este procedimiento, es importante recordar comenzar con larva. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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