La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Este video demuestra un método para diseccionar y cultivar neuronas motoras comisurales de la médula espinal embrionaria. El procedimiento comienza con la obtención de embriones de rata E13 y luego la disección de las médulas espinales. Durante la disección, las médulas espinales se abren a lo largo de la placa del techo y se preparan en la configuración de libro abierto.

Se disecan tiras de tejido dorsal y se recogen en un tubo. El tejido dorsal se disocia en una suspensión de células individuales mediante tripsina y disruptión mecánica. Luego, se cultivan neuronas comisurales sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con polilisina o en placas de cultivo de tejidos.

Luego pueden utilizarse para estudiar los mecanismos celulares y moleculares del crecimiento y la orientación de los axones. Hola, soy Sebastian del Laboratorio de Biología Molecular del Desarrollo Neural del Instituto de Investigación Clínica de Montreal. Hola, soy Steve Moen, también del Laboratorio de Biología Molecular del Desarrollo Neural.

Hoy les mostraremos un procedimiento para diseccionar y cultivar neuronas comisurales del cordón espinal embrionario. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la guía axonal. Así que comencemos.

Hoy, se disecarán médulas espinales de embriones de rata E 13 recién obtenidos, colocados en un recipiente con medio L 15 durante toda la disección. Es importante mantener los embriones y las soluciones sobre hielo. Recuerde que, en todos los pasos de la disección, es fundamental no estirar la médula espinal con pinzas de níquel, ya que esto podría impedir el aislamiento de una médula espinal completamente intacta.

Bajo un microscopio estereoscópico, separe el embrión de todos los tejidos extraembrionarios y membranas embrionarias. Luego coloque un embrión en el recipiente para disección. Utilice tijeras microquirúrgicas para cortar la cabeza y las partes posteriores de los ángulos mostrados aquí.

Esto creará una superficie plana que facilitará la colocación del embrión para un acceso sencillo a la médula espinal. Coloque el embrión con el lado ventral hacia abajo y la parte anterior orientada hacia afuera. Utilice pinzas para fijar firmemente el embrión por un lado.

No pellizque ni suelte la pinza ni el tejido, o se romperá con el segundo par de pinzas. Sujete la piel al lado de la médula espinal. Ajuste las puntas de la pinza de sujeción.

Retire la piel que cubre la parte posterior del embrión para exponer la médula espinal envuelta en sus meninges y así separar parcialmente el tejido situado a la derecha de la médula espinal. Utilice pinzas cerradas para perforar el tejido comenzando desde el nivel de las pinzas de sujeción. Acérquese lo más posible a la médula espinal sin tocarla.

Repita varias veces a lo largo de la médula espinal. Esto adherirá algunos ganglios de la raíz dorsal y alterará los órganos ventrales. Deje algo de tejido adherido en los extremos anterior y posterior, comenzando desde el extremo anterior.

Utilice una aguja de tungsteno con forma de gancho para cortar las meninges y abrir la médula espinal a lo largo de la placa del techo. Gire el embrión 180 grados e interrumpa el tejido desde el lado restante. Utilizando el mismo método.

Luego, desprenda completamente el tejido en el lado izquierdo de la médula espinal, el lado que originalmente se interrumpió primero a la derecha; coloque la médula espinal de lado y use pinzas para eliminar la mayor parte del tejido mesenquimatoso restante y los ganglios de las raíces dorsales. Utilice pinzas para levantar una pequeña solapa de las meninges. En este momento, las meninges y la médula espinal forman dos capas de tejido como una sándwich.

Utilice la pinza para fijar la porción más grande de la médula espinal en el extremo anterior. Sujete los dos segmentos separados con la pinza y desprenda las meninges. Con un movimiento suave y constante, el desprendimiento irregular puede romper la capa de las meninges y/o la médula espinal.

Si la capa de meninges se rompe durante la tracción, la porción de la médula espinal que permanece adherida a las meninges generalmente no es recuperable. Aunque a veces es posible. Utilice una pipeta de plástico para transferir suavemente la médula espinal aislada a un recipiente con medio L 15 que contenga 10% de suero de caballo inactivado por calor, sobre hielo, antes de procesar más embriones.

Recuerde cambiar el medio en el recipiente de disección por L-15 frío para mantener al embrión fresco y ayudar a preservar la integridad del tejido. Recolecte las médulas espinales de todos los embriones antes de proceder a las disecciones de la médula espinal dorsal. Para comenzar la disección de la médula dorsal, coloque una médula espinal recién aislada en una placa de Petri que contenga L-15 con suero de caballo al 10 %, calentado y activado.

Corte la porción anterior más ancha, que incluye parte del cerebro posterior. Luego, coloque la médula espinal plana y extiéndala como un libro abierto. El tejido dorsal se encuentra en las partes más laterales de la médula espinal abierta; sujétela con una aguja de tungsteno recta utilizando una aguja de tungsteno en forma de L para cortar una tira de aproximadamente un quinto del ancho de una mitad de la médula espinal. Cortar tiras más anchas aumentará el rendimiento, pero reducirá la pureza del cultivo.

Transfiera varias tiras dorsales a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga medio L 15 con 10% de suero de caballo y coloque el tubo en hielo. El resto del procedimiento se llevará a cabo cerca o dentro de la cabina de cultivo de tejidos. Para estos cultivos, es importante preparar las soluciones y el equipo con anticipación, generalmente antes de la disección.

El paso de tación utiliza pipetas de pasta pulidas con llama de dos tamaños, una con un diámetro que es la mitad del tamaño original y la otra ligeramente más pequeña. Antes de comenzar, recubra las dos pipetas pulidas con llama con medio que contenga suero aspirando el medio hacia las pipetas y dejándolo reposar durante 30 segundos. Esto reducirá el número de células que se adhieren al vidrio durante la tación.

Comience verificando que las tiras dorsales se hayan asentado en el fondo del tubo. Bajo campana de flujo laminar, retire la mayor parte del sobrenadante SUP con una pipeta Pasteur. Lave rápidamente con tres mililitros de HBSS frío sin magnesio ni calcio.

Deje reposar la tira de tubo neural dorsal durante dos minutos. Luego retire el HBSS con la espátula. Ajuste el volumen hasta 4,7 mililitros.

Con HBSS tibio, añada 0,3 mililitros de tripsina al 2,5 % para obtener una concentración final de 0,15 % de Tryin y mezcle suavemente. Incube en un baño de agua a 37 °C durante siete minutos, agitando suavemente una vez a la mitad del tiempo de incubación. Una vez finalizada la incubación, añada DNasa para obtener una concentración final de 150 unidades por mililitro y sulfato de magnesio para una concentración final de 0,15 %, y mezcle brevemente.

Las secciones del tubo neural dorsal ahora deben estar fragmentadas. Centrifugar los fragmentos de tejido a 200 G durante cuatro minutos. Retirar el sobrenadante SUP con una pipeta Pasteur, dejando aproximadamente entre 50 y 100 microlitros de líquido en el fondo del tubo.

Agite suavemente el tubo para despegar el precipitado. Luego lave las células añadiendo cinco mililitros de HBSS tibio. Deje que las células sedimenten a temperatura ambiente durante dos minutos.

Centrifugar y lavar las células nuevamente. Esta vez, resuspender en dos mililitros de HBSS tibio. Utilice una pipeta de vidrio pulida con llama de medio diámetro para triturar las células, pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo de cuatro a seis veces, dirigiendo el líquido contra la pared del tubo para deshacer los grumos más grandes y reducir la muerte celular.

Evite formar burbujas y no sobrepase. Utilice la pipeta de vidrio con punta de fuego más pequeña disponible para disociar aún más las células, pipeteando lentamente de arriba abajo tres o cuatro veces de la misma manera. No es necesario disociar todos los agregados celulares, ya que tienden a formarse agregados de células muertas en los restos celulares.

Deje que cualquier fragmento de tejido se sedimente durante un minuto. Luego, retire 20 microlitros del sobrenadante, que debería contener células en suspensión para el recuento en un hemocitómetro; las neuronas deben tener una viabilidad de al menos el 95% mediante tinción con azul de tripano. Incube las neuronas en medio de siembra neurobasal a una concentración adecuada para su aplicación.

16 a 18 horas después, cambie el medio a medio de crecimiento neural basal para evitar desprendimientos. Los neuronas retiran suavemente el medio con una pipeta en lugar de aspirar con una bomba de vacío. A continuación se muestran algunos resultados representativos de neuronas comisurales aisladas sembradas sobre cubreobjetos recubiertos con PLL; cuatro horas después del siembra, las neuronas se han adherido a la superficie, 30 horas tras el siembra.

La mayoría de las neuronas tienen axones alargados con un cono de crecimiento visible. Estas neuronas pueden usarse fácilmente en experimentos de inmunofluorescencia. En este ejemplo, los microtúbulos se etiquetan en verde, la f-actina en rojo y el NA en azul.

Acabamos de mostrarle cómo diseccionar y cultivar neuronas comisurales a partir de médulas espinales embrionarias. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la pureza de las neuronas comisurales depende del grosor de la franja dorsal que se disecciona. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.