Primaria células epiteliales bronquiales Cultivada a partir de explantes

En este artículo describimos un protocolo para el crecimiento y expansión de células epiteliales bronquiales humanas a partir de segmentos bronquiales humanos recién aislados. Este protocolo consta de cinco secciones, codificación y rascado, placas de cultivo de cien milímetros, reparación de tejido bronquial, trasplantes de tejido bronquial explan, paso de células epiteliales bronquiales humanas en crecimiento ciliado, células epiteliales bronquiales humanas en transpocillos. Antes de comenzar, tenga en cuenta que todos los pasos se realizan en el gabinete de seguridad biológica.

A menos que se indique lo contrario, lea la sección de materiales, reactivos y preparación y asegúrese de haberlo preparado de manera adecuada. La siguiente codificación, cultivo de soluciones madre, soluciones de disociación media, recubrimiento y rayado. Las placas de cultivo de cien milímetros deben hacerse en el bst.

Mantén todo estéril. Coloque placas de cultivo estériles de cien milímetros y solución de recubrimiento. En la pipeta BST, dos molinos de solución de recubrimiento y una placa de cien milímetros se arremolinan para recubrir la base de la placa.

Asegúrese de que la solución de recubrimiento cubra la base de la placa de manera uniforme. Pipetea la solución sobrante y utilízala para recubrir una segunda placa de cien milímetros. Repita para tantos platos como sea necesario.

El número de placas necesarias varía con el número de explantes de tejido. Asegúrese de que la solución de recubrimiento cubra la base de las placas de manera uniforme. Como se ha demostrado.

Cubra los platos con sus cubiertas. Deje que las placas se sequen en la incubadora durante una o dos horas y aspire la solución de acceso antes de usarla Para la explicación del tejido bronquial. Las placas de cultivo recubiertas sin usar pueden colocarse en una bolsa estéril y almacenarse a cuatro grados centígrados para más tarde.

Utilice un aerosol de tijeras limpias, pequeñas y afiladas, bisturí y pinzas con etanol al 70% y introduzca en el BSC placas recubiertas de arañazos presionando firmemente con él el bisturí para formar XS pequeñas y profundas, al menos cuatro por placa. Si el rasguño no es lo suficientemente profundo, los trozos de tejido no se asentarán en las jeringas y flotarán fuera del BSC. Enjuague bien el tejido bronquial humano aislado en Bss.

Abre las piezas bronquiales. Lleve el tejido al BS y transfiéralo a una placa estéril de cultivo de tejidos de cien milímetros con el jamón DM EM F 12 más un 1% de antibiótico antimicótico. Use las tijeras pequeñas y afiladas para cortar el tejido en trozos cúbicos de dos a tres milímetros.

Coloque un pedazo de tejido cortado en el centro de cada X con pinzas y presione. Deje que los trozos de tejido o explantes X se adhieran a la placa durante unos segundos. Y luego agregue suavemente 10 milésimas de pulgada de medio completo Si el tejido flota Después de agregar el medio, use pinzas para empujar el tejido hacia las crestas de la X o haga una nueva X.It puede ser necesario hacer nuevas X si las crestas no son lo suficientemente profundas.

Coloque las placas en la incubadora y cambie el medio cada tres o cuatro días, los tejidos están listos para el trasplante. Cuando han crecido suficientes células epiteliales alrededor de los tejidos para cubrir áreas de uno a dos centímetros, esto toma aproximadamente cuatro semanas. Utilice placas recubiertas y rayadas de cien milímetros.

Dado que es posible que la explicación de algunos tejidos no tenga éxito. El número de placas depende de la cantidad de piezas de tejido que se trasplanten. Si está utilizando placas que han sido previamente recubiertas y almacenadas a cuatro grados centígrados, llévelas a temperatura ambiente antes de usarlas Con pinzas, recoja cuidadosamente el pañuelo de la placa original y colóquelo en el centro del eje de la nueva placa y presione suavemente Los tejidos sin crecimiento deben desecharse.

Deje que el pañuelo se adhiera a la placa. Durante unos segundos, agregue el medio e incube. Agregue lo descrito anteriormente para X explicación.

Por lo tanto, dos milésimas de pulgada de viajes y solución madre de EDTA por cada placa de cultivo de tejidos de cien milímetros. Diluya el material con seis milésimas de pulgada de PBS 0,01 molar estéril y dos milésimas de pulgada de solución madre a seis milésimas de pulgada de PBS para una concentración final de tripsina de 50 micrógramos por mil, y para EDTA a cien microgramos por mil. Después de mover los explantes a una nueva placa, aspire los medios de las placas con anillos de celda de uno a dos centímetros.

Agregue ocho milésimas de pulgada de gota diluida tibia y coloque una solución en cada placa de cien milímetros. Y coloque una incubadora a 37 grados centígrados durante tres a 15 minutos. Revíselo con frecuencia.

Dejar la tripsina demasiado tiempo dañará las células. Revise las placas bajo un microscopio para asegurarse de que la mayoría de las células se hayan levantado, las células se redondearán y se desprenderán como se muestra a ocho milésimas de pulgada de calor. 10%FBS en medios por placa para inactivar elen EDT una solución.

Combine los volúmenes de todas las placas en un solo tubo o en tubos separados de diferentes tejidos. Cuente las células con una centrífuga Hema Cytometer a cien g durante cinco minutos. Se formará un gránulo de célula en la base del tubo, resuspenda el gránulo de célula en medios completos hasta la concentración de célula deseada.

Coloque cada dos a 3 millones de celdas por matraz T 75 y agregue medios completos según sea necesario. Incubar y cambiar los medios. Cada tres o cuatro semanas, las células crecen hasta subconfluir en matraces D 75.

En aproximadamente cuatro semanas, las células deben levantarse y expandirse o usarse en subconfluencia para prevenir el senio. Comience con la preparación de las membranas permeables de los transpozos. Utilice los insertos de 6,5 milímetros que encajan en las placas de pocillos múltiples de 24 pocillos.

Agregue medio a ambos lados de la membrana. Coloque seis milésimas de pulgada en la parte inferior y 0,1 milésimas de pulgada en la parte superior. Incubar una hora en una incubadora de cultivos celulares.

Retire con cuidado el medio de ambos lados de la membrana. Comenzar primero con el volumen basal, con cuidado, significa que la membrana puede dañarse fácilmente. Por lo tanto, pipetee el medio por el costado del inserto de cultivo, use el volumen recomendado.

Si no lo hace, se producirá una fuga de medios a otros pocillos y a las células semilla. Después de la preincubación del soporte permeable, pipetee cuidadosamente su suspensión celular en el lado épico de la membrana para pocillos de 6,5 milímetros a 0,1 milésimas de pulgada de suspensión celular hasta el lado épico de la membrana. Pipeta de 0,6 M, media en la cara basal de la membrana.

Alimente las células desde los lados épico y basal durante 10 días. Para establecer un intercambio cultural bien diferenciado, se debe hacer un medio dos veces por semana. Usando el método demostrado, elimine el volumen basal.

Primero, reemplace el volumen épico, agregue 0.6 milésimas de pulgada de medio al lado basal de la membrana. Este método promueve la unión de las células a la membrana y evita que las células estén expuestas al aire durante largos períodos de tiempo. Cambie los medios rápidamente y vuelva a colocar una incubadora.

Cree una interfaz aire-líquido en el día 10 eliminando el medio AAL y reemplazando los 0.6 mil de medio en el lado basal de la membrana. Mantenga las celdas en la interfaz aire-líquido durante seis semanas, cambie los medios dos veces por semana. Las células ciliadas comenzarán a aparecer cuatro semanas después de la creación de la oreja.

Interfaz líquida. Las células lograrán una diferenciación uniforme en células ciliadas. Seis semanas después de la creación de la interfaz de líquido para el oído.

Segmentos bronquiales humanos con células epiteliales sanas procedentes de explans y trasplantes. En nuestro estudio, los cultivos exitosos del tejido bronquial ocurrieron en ocho de los nueve tejidos. A medida que uno de los cultivos explan se infectaba, los anillos de células epiteliales alcanzaban un radio de uno a dos centímetros en tres o cuatro semanas.

Los X explan exitosos se cultivaron de nuevo hasta seis veces. Todos los cultivos exitosos muestran evidencia de migración celular dentro de las 48 horas posteriores al inicio de los trasplantes, o X explan, como se muestra en las células B, tienen una apariencia de adoquín que es distinta para estas células epiteliales, como se muestra en B. Y en figuras posteriores, la tinción inmunológica de las preparaciones de citosina de las células de explan y las células sembradas en cubreobjetos reveló que todas las células eran positivas para la citoqueratina específica del epitelio, Aquí se muestran células bronquiales de subcultivo humano cultivadas hasta subconfluencia y matraces T 75. Nótese el aspecto de adoquín.

Las células bronquiales de los subcultivos humanos mostraron una inmunotinción positiva uniforme para la querina y la inmunotinción de E. Can him con anticuerpos específicos contra otros tipos de células no mostró ninguna indicación de contaminación de los cultivos por fibroblastos, células mesenquimales o endoteliales. Para más detalles, consulte la figura cinco y su leyenda en el texto: células cultivadas en membranas de poliéster permeable o transpocillos con o interfaz líquida diferenciada en epitelio ciliado como se muestra aquí, desechar las células y las suyas o trasplantes si comienzan a aparecer células con una morfología diferente como se muestra aquí. En este protocolo, presentamos métodos detallados para el cultivo y la expansión de células epiteliales bronquiales humanas primarias.

Los estudios basados en células humanas son necesarios para determinar vías importantes de los mecanismos de la enfermedad pulmonar humana y para la toxicidad y el cribado farmacológico de nuevos fármacos. Esperamos que los métodos descritos aquí le animen a cultivar células epiteliales bronquiales humanas a partir de explantes y a utilizar estas células en sus sistemas de estudio. Gracias y buena suerte.