Primaria células epiteliales bronquiales Cultivada a partir de explantes

En este artículo describimos un protocolo para el crecimiento y expansión de células epiteliales bronquiales humanas a partir de segmentos bronquiales humanos recién aislados. Este protocolo consta de cinco secciones: codificación y rayado, placas de cultivo de cien milímetros, reparación del tejido bronquial, trasplantes de tejido bronquial en explante y paso de células epiteliales bronquiales humanas ciliadas en crecimiento, células epiteliales bronquiales humanas en transbien. Antes de comenzar, tenga en cuenta que todos los pasos se realizan en la cabina de seguridad biológica.

A menos que se indique lo contrario, lea la sección de materiales, reactivos y preparación y asegúrese de que ha preparado básicamente todo. Las siguientes actividades: codificación, cultivo de soluciones stock, medio, soluciones de disociación, recubrimiento y rayado. Las placas de cultivo de cien milímetros deben realizarse en el bst.

Mantenga todo estéril. Coloque placas de cultivo estériles de cien milímetros y solución de recubrimiento. En la pipeta BST, agregue dos mililitros de solución de recubrimiento y gire la placa de cien milímetros para cubrir la base de la placa.

Asegúrese de que la solución de recubrimiento cubra uniformemente la base de la placa. Aspire con pipeta la solución sobrante y utilícela para recubrir una segunda placa de cien milímetros. Repita este procedimiento para tantas placas como sean necesarias.

La cantidad de placas necesarias varía según el número de explantes de tejido. Asegúrese de que la solución de recubrimiento cubra uniformemente la base de las placas. Como se demostró.

Cubra las placas con sus tapas. Deje secar las placas en el incubador durante una a dos horas y aspire la solución en exceso antes de usarlas para el cultivo de explantes de tejido bronquial. Las placas de cultivo recubiertas no utilizadas pueden colocarse en una bolsa estéril y almacenarse a cuatro grados Celsius para su uso posterior.

Use spray limpio, tijeras pequeñas y afiladas, bisturí y pinzas con etanol al 70 % y lleve al CAB placas recubiertas rayadas presionando firmemente con el bisturí para formar pequeñas X profundas, al menos cuatro por placa. Si el rayado no es lo suficientemente profundo, los fragmentos de tejido no se asentarán en las jeringas y flotarán fuera. Fuera del CAB, coloque el tejido en una placa P tres. Enjuague el tejido bronquial humano aislado abundantemente en BSS.

Abrir los fragmentos bronquiales. Colocar el tejido en BS y transferirlo a una placa de cultivo tisular estéril de cien milímetros con DMEM Ham F12 más 1 % de antibiótico antimicótico. Utilizar tijeras pequeñas y afiladas para cortar el tejido en fragmentos cúbicos de dos a tres milímetros.

Coloque un trozo de tejido cortado en el centro de cada X con pinzas y presione. Deje que los trozos de tejido o los explantes en forma de X se adhieran suavemente a la placa durante unos segundos. Luego, agregue suavemente 10 mL de medio completo. Si el tejido flota después de agregar el medio, utilice pinzas para empujar el tejido hacia los surcos de la X o cree una nueva X. Puede ser necesario crear nuevas X si los surcos no son lo suficientemente profundos.

Coloque las placas en el incubador y cambie el medio cada tres o cuatro días; los tejidos estarán listos para trasplantar cuando hayan crecido suficientes células epiteliales alrededor de los tejidos para cubrir áreas de uno a dos centímetros, lo que tarda aproximadamente cuatro semanas. Utilice placas recubiertas y rayadas de cien milímetros.

Dado que algunos explantes de tejido podrían no tener éxito, el número de placas depende de cuántos fragmentos de tejido esté transplantando. Si está utilizando placas que han sido previamente recubiertas y almacenadas a cuatro grados Celsius, déjelas alcanzar la temperatura ambiente antes de usarlas. Con pinzas, tome cuidadosamente el tejido de la placa original y colóquelo en el centro del eje de la nueva placa, presionando suavemente. Los tejidos sin crecimiento externo deben descartarse.

Deje que el tejido se adhiera a la placa. Durante unos segundos, agregue medio y realice una incubación. Agregue lo descrito anteriormente para X explicación.

Así, dos mililitros de tripsina y solución stock de EDTA por cada placa de cultivo de tejidos de cien mililitros. Diluir el stock con seis mililitros de PBS estéril 0,01 molar y dos mililitros de solución stock en seis mililitros de PBS para obtener una concentración final de tripsina de 250 microgramos por mililitro y de EDTA de cien microgramos por mililitro. Después de transferir los explantes a una nueva placa, aspirar el medio de las placas con anillos de células de uno a dos centímetros.

Añada ocho mililitros de gotas tibias diluidas y edta a una solución en cada placa de cien milímetros. Coloque en un incubador a 37 grados Celsius durante tres a quince minutos. Revise frecuentemente.

Dejar la tripsina por demasiado tiempo dañará las células. Revise las placas bajo un microscopio para asegurarse de que la mayoría de las células se hayan desprendido; las células se volverán redondas y se despegarán como se muestra a los ocho Mils de calor. Añada 10 % de FBS en el medio por placa para inactivar la solución de EDTA.

Combine los volúmenes de todas las placas en un tubo o en tubos separados de diferentes tejidos. Cuente las células utilizando una centrífuga Hema Cytometer a cien G durante cinco minutos. Se formará un precipitado celular en la base del tubo; re suspenda el precipitado celular en medio completo hasta la concentración celular deseada.

Coloque de dos a tres millones de células por matraz T 75 y agregue el medio completo según sea necesario. Incube y cambie el medio. Cada tres o cuatro semanas, las células crecen hasta alcanzar subconfluencia en matraces D 75.

En aproximadamente cuatro semanas, las células deben separarse y expandirse o utilizarse en subconfluencia para evitar la senescencia. Comience preparando las membranas permeables de los transbien. Utilice inserts de 6,5 milímetros que encajen en placas de múltiples pozos de 24 pozos.

Añada medio a ambos lados de la membrana. Seis décimas de mil en la parte inferior y 0,1 mil en la superior. Incube durante una hora en el incubador de cultivo celular.

Retire cuidadosamente el medio de ambos lados de la membrana. Comenzar primero con el volumen basal puede dañar fácilmente la membrana. Por lo tanto, aspire el medio por el costado del inserto de cultivo y use el volumen recomendado.

No hacerlo provocará fugas de medio a otros pocillos para sembrar células. Después de la preincubación del soporte permeable, pipetee cuidadosamente la suspensión celular al lado apical de la membrana para pocillos de 6,5 mm con 0,1 mL de suspensión celular al lado apical de la membrana. Pipetee 0,6 mL de medio al lado basal de la membrana.

Alimente las células desde los lados epical y basal durante 10 días. Para establecer un intercambio de cultivo bien diferenciado, cambie el medio dos veces por semana. Utilizando el método demostrado, retire el volumen basal.

Primero, reemplace el volumen epical y agregue 0,6 mils de medio al lado basal de la membrana. Este método favorece la adhesión celular a la membrana y evita que las células estén expuestas al aire durante largos períodos de tiempo. Cambie el medio rápidamente y regrese la muestra al incubador.

Cree una interfaz aire-líquido el día 10 retirando el medio AAL y reemplazando 0,6 ml del medio en el lado basal de la membrana. Mantenga las células en interfaz aire-líquido durante seis semanas, cambiando el medio dos veces por semana. Las células ciliadas comenzarán a aparecer cuatro semanas después de la creación del oído.

Interfaz líquida. Las células lograrán una diferenciación uniforme en células ciliadas. Seis semanas después de la creación de la interfaz líquida del oído.

Segmentos bronquiales humanos con células epiteliales sanas procedentes de explantes y trasplantes. En nuestro estudio, los cultivos exitosos a partir de explantes del tejido bronquial se obtuvieron en ocho de los nueve tejidos. Como uno de los cultivos de explantes se infectó, los anillos de células epiteliales alcanzaron un radio de uno a dos centímetros en tres a cuatro semanas.

Los explantes X exitosos se cultivaron nuevamente hasta seis veces. Todos los cultivos exitosos muestran evidencia de migración celular dentro de las 48 horas posteriores al inicio del trasplante, o explantes X, como se muestra en B; las células presentan un aspecto empedrado que es característico de estas células epiteliales, tal como se observa en B. En figuras posteriores, la tinción inmunohistoquímica de preparaciones de citosina de células de explantes y de células sembradas sobre cubreobjetos reveló que todas las células fueron positivas para la citoqueratina específica del epitelio. Aquí se muestran células bronquiales humanas de subcultivo crecidas hasta alcanzar subconfluencia en matraces T-75. Obsérvese el aspecto empedrado.

Las células bronquiales de subcultivo humano mostraron una inmunotinción uniformemente positiva para queratina y E-Cad. La inmunotinción con anticuerpos específicos contra otros tipos celulares no mostró ninguna indicación de contaminación de los cultivos por fibroblastos, células mesenquimales o células endoteliales. Para más detalles, consulte la figura cinco y su leyenda en el texto. Las células cultivadas sobre membranas de poliéster permeables o en transbien con o sin interfase líquida se diferenciaron en epitelio ciliado como se demuestra aquí; deseche las células y sus trasplantes si aparecen células con una morfología diferente a la descrita. En este protocolo, presentamos métodos detallados para el cultivo y la expansión de células epiteliales bronquiales humanas primarias.

Se necesitan estudios basados en células humanas para determinar las vías importantes de los mecanismos de enfermedades pulmonares humanas y para la evaluación de toxicidad y propiedades farmacológicas de fármacos novedosos. Esperamos que los métodos descritos aquí lo animen a cultivar células epiteliales bronquiales humanas a partir de explantes y a utilizar estas células en sus sistemas de estudio. Gracias y buena suerte.