Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte II: Los hidratos de carbono

La determinación de la composición de polisacáridos de la matriz y el contenido de celulosa cristalina de las paredes celulares de las plantas comienza con material vegetal seco, que se somete a varias extracciones. El material resultante consta solo de paredes celulares y luego se divide para determinar la composición del polisacárido de la matriz. El material de la pared se trata con un ácido débil para hidrolizar, polisacáridos no cristalinos, que son principalmente las hemocelulosas en sus monosacáridos.

A continuación, los monosacáridos se derivan en sus correspondientes acetatos aldólicos volátiles, que luego se analizan y cuantifican mediante cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas para la determinación de la celulosa cristalina. Las paredes de contenido se tratan con el reactivo grafo, una mezcla de ácidos que eliminan los componentes no cristalinos de la pared. La celulosa cristalina restante se degrada en su monómero glucosa, que se puede ensayar métricamente.

La determinación del contenido y la composición de la lignina se demuestra en otra publicación de video J titulada Análisis integral de la composición de las paredes celulares de las plantas, parte uno de la lignina. Hola, soy Marcus Pauley, jefe de la instalación analítica Wall en el Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos aquí en la Universidad Estatal de Michigan. Soy Cliff Foster, director del centro de análisis de la pared celular.

Hoy te mostraremos cómo determinar la composición de los polisacáridos presentes en el material de la pared celular de la planta que es celulosa en varias celulosas de Homo. Aquí, en el Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos, desarrollamos tecnología para convertir estos azúcares en biocombustibles. Con el fin de identificar una materia prima vegetal óptima, primero debemos evaluar el tipo y la abundancia de azúcares que están presentes en esta biomasa.

En otro vídeo titulado Análisis exhaustivo de la composición de las paredes celulares de las plantas, primera parte lignina, nos centraremos en el análisis de los polifenoles. Así que comencemos. Comience este procedimiento aislando las paredes celulares.

Muela aproximadamente de 60 a 70 miligramos de material vegetal seco con bolas de acero inoxidable de 5,5 milímetros en un tubo de rosca SAR TED de dos milésimas de pulgada. Utilizando un molino REM como alternativa de alto rendimiento, utilice un robot de molienda y dispensación denominado eyewall como se describe en la primera parte. Cuando se complete la molienda, retire las bolas de acero.

Continúe aislando las paredes celulares y eliminando el almidón residual como se muestra en la primera parte y se describe en el protocolo escrito adjunto. Pese dos miligramos de material de pared celular de almidón DS en un tubo sared de dos molinos. Una forma de alto rendimiento de realizar esta tarea es el robot de pared ocular.

El robot toma un tubo que contiene material vegetal molido y hace un agujero en la parte inferior del tubo. A continuación, el tubo perforado se coloca en un alimentador VI. Un tubo vacío se coloca en una balanza y se desplaza debajo del alimentador VI a través de la vibración, el material se filtra a través del orificio en el tubo superior cargado hacia el tubo inferior vacío hasta que se acumula la cantidad deseada de material.

Agregue 100 microgramos de acetol como estándar interno. Enjuague las paredes del tubo con acetona para recoger el material de la pared celular en la parte inferior del tubo y evapore la acetona muy suavemente bajo el flujo de aire. A continuación, realice la hidrólisis ácida débil.

Agregue con cuidado 250 microlitros de ácido tricloroacético o TFA de dos molares a cada muestra, asegurándose de que no salpique material en las paredes del tubo. Tape bien los tubos e incube a 121 grados centígrados en un bloque calefactor durante 90 minutos. A continuación, enfríe los bloques calefactores y las muestras en hielo y centrifugue los tubos a 10.000 rpm durante 10 minutos.

Transfiera 100 microlitros del sobrenadante ácido que contiene los azúcares solubilizados del polisacárido de la matriz a viales con tapón de rosca, asegurándose de no alterar el material de los gránulos. El pellet se puede utilizar para el ensayo de celulosa cristalina. Evapore el TFA en un tubo de vidrio bajo una suave corriente de aire en un dispositivo de evaporación.

Añadir 300 microlitros de dos propanol para eliminar el exceso de vórtice ácido y evaporar a 25 grados centígrados. Repita un total de tres veces. Para permitir la identificación de los monosacáridos por cromatografía de gases, realice una derivación de acetato aldólico.

En primer lugar, se reducen los monosacáridos a sus correspondientes aldólicos de anillo abierto, que luego se acetilan. Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener instrucciones detalladas. Cada paso del procedimiento sigue el protocolo mostrado anteriormente, adición de evaporación de incubación de reactivo bajo una corriente de aire, seguida de la eliminación del exceso de reactivo mediante varios pasos de lavado.

En los pasos finales, se extraen los acetatos aldólicos. Primero, agregue 500 microlitros de acetato de etilo y revuelva ligeramente. Luego agregue dos milésimas de pulgada de agua, tape los tubos y el vórtice, centrifugue los tubos a 2000 RPM durante cinco minutos para obtener capas separadas claras con acetato de etilo en la parte superior que contiene los acetatos de Al Dettol y agua en la pipeta inferior, 50 microlitros de capa de acetato de etilo en viales de GCMS con insertos diluidos agregando 100 microlitros de acetona al vial de GC y el vial de GC se puede almacenar a cuatro grados centígrados.

Si el análisis GCMS no procede inmediatamente, inyecte las muestras en un fotógrafo de croma de gas que esté equipado con un espectrómetro de masas cuádruple. Para conocer la columna y los detalles de la ejecución, consulte el protocolo escrito adjunto. El material de partida para determinar el contenido de celulosa cristalina puede ser material de pared celular aislado o material de pared ya tratado con el TFA ácido débil, ya sea inmediatamente después del tratamiento con ácido o en forma seca almacenable.

Después de eliminar el exceso de TFA con iso propanol como se muestra anteriormente, agregue al pellet de TFA en los dos M sars al tubo un M de reactivo up degra compuesto por ácido acético, ácido nítrico y agua, agregue una proporción de volumen a volumen de ocho a uno a dos. Tape el tubo herméticamente y caliéntelo en un bloque calefactor a 100 grados centígrados durante 30 minutos. Como resultado de este tratamiento, solo queda celulosa cristalina en el pellet.

Todos los demás polisacáridos son muestras frías hidrolizadas en el bloque sobre hielo a temperatura ambiente o más frías. Luego centrifugue las muestras a 10,000 RPM durante 15 minutos después de la centrifugación, deseche el sobrenadante asegurándose de que el pellet no se altere y no se elimine material del pellet. Para ello, deje aproximadamente 150 microlitros del sobrenadante en el tubo, lave el pellet varias veces con agua.

A continuación, realice una hidrólisis con el ácido sulfúrico concentrado para hidrolizar completamente el cristal y la pelliza de celulosa en glucosa. Comience agregando 175 microlitros de ácido sulfúrico al 72% al tubo de sarta e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación inicial, agite la muestra e incube durante otros 15 minutos.

Luego agregue 825 microlitros de agua y vórtice y centrifugue las muestras a 10, 000 RPM durante cinco minutos. Puede haber algo de material marrón y soluble, principalmente lignina, que permanece en el tubo mientras la glucosa está en el sobrenadante. El contenido de glucosa del sobrenadante se analiza mediante el ensayo de antonas colormétrico.

Este ensayo se realiza en una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos. Repare una curva estándar de glucosa por duplicado siguiendo las instrucciones del protocolo escrito adjunto. Prepare las muestras combinando 10 microlitros de cada muestra, supernat y 90 microlitros de agua en pocillos separados de la misma placa de microtitulación que el acabado estándar agregando 200 microlitros de reactivo recién preparado y arrojado.

A continuación, calienta la placa durante 30 minutos a 80 grados centígrados en un horno con difusor de calor de aluminio. Observe que las muestras que contienen glucosa cambian de amarillo a verde azulado cuando se completa el calentamiento. Deje que el plato se enfríe a temperatura ambiente y agite bien.

Lea la absorción a 625 nanómetros utilizando un lector de placas de microtitulación. El contenido de glucosa, el componente básico de la celulosa, se calcula en función de la absorbancia en comparación con la curva estándar establecida en la misma placa. A continuación, se presentan algunos resultados representativos del análisis de polisacáridos de una pieza de madera de álamo.

Los picos del cromatograma de gases se identifican mediante perfiles de masa y/o tiempos de retención de patrones. Los monosacáridos se cuantifican en base a curvas estándar. El análisis de azúcares de los polisacáridos de la matriz muestra una alta abundancia de xilosa que representa hemicelulosa xam, pero también están presentes otros azúcares.

Según el análisis, el 40% del material de álamo consiste en cristal y celulosa. Tenga en cuenta que estos contenidos y composiciones pueden variar de una planta a otra o entre diferentes anatomías vegetales. Acabamos de mostrarle cómo determinar el contenido de polisacáridos y el análisis composicional de la biomasa lignanocelulósica para el análisis de la lignina polifenólica.

Sintoniza la primera parte. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.