Name: Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-01T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a registrar la actividad eléctrica del epitelio vomeronasal de ratón usando matrices multielectrodo con estimulación robótica precisa. Este método permite estudiar la respuesta sensorial a estímulos líquidos.

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Nos gustaría agradecer a los miembros del Laboratorio de Santo. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Enfermedades Sordera y Comunicación (R01 DC005964 de LA) y NSF IGERT 0548890 (HAA). Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las leyes de los Estados Unidos de Bienestar Animal y de los Institutos Nacionales de Salud directrices y fueron aprobados por el Cuidado de Animales de la Universidad de Washington y el empleo.

Parte 1. Instrumentación de grabación eléctrica <ol><li> Utilizamos una amplia multielectrodo planar (ALA Scientific Instruments) con 10 micras electrodos planos aislados de nitruro de titanio con nitruro de silicio. 60 electrodos están dispuestos en dos campos que consiste en una cuadrícula de 5x6 con el espaciamiento de centro a centro de 30 micras. (Otras configuraciones son posibles, los electrodos con una superficie de grabación de 10 micras de diámetro son mejores que los electrodos más grandes en términos de aislamiento de la actividad de neuronas individuales.) </li><li> Las señales eléctricas son amplificadas (amplificación de 1000x) con un amplificador de MEA 1060 (ALA Scientific Instruments). Las señales se adquieren a 10 kHz con una tarjeta de adquisición de datos (National Instruments) y software a la medida de adquisición de datos (también se puede comprar el software comercial). </li><li> El tejido se mantiene presionado en la MEA por una malla de nylon (53 micras), que se adjunta a una pieza de enganche personalizada que encaja perfectamente en el interior del anillo de tubo de cultivo de la MEA. </li></ol> Parte 2. Instrumentación de entrega líquido <ol><li> El tejido requiere superfusión continua, lo que nos garantiza mediante el suministro de solución de Ringer (115 de cloruro de sodio mM, 5 mM de cloruro de potasio, dos de cloruro de calcio mM, 2 de cloruro de magnesio mM, 25 de bicarbonato de sodio mM, HEPES 10 mM y 10 mM D-(+ )-glucosa) a partir de una bomba de HPLC. Los estímulos se presentan al realizar las inyecciones en una válvula de HPLC y el cambio entre flujo continuo y el lazo. Tanto la bomba de HPLC y la bomba de inyección de robot jeringas se suministran con solución de Ringer. </li><li> Solución de Ringer se mantiene en un baño de agua caliente (ISOTEMP 105) a 42 ° C durante todo el experimento y está continuamente burbujeado con 95% O 2 / 5% CO 2. Un matraz separado de Ringer sin glucosa se prepara para hacer copias de la bomba de jeringa. Solución de Ringer se entrega a los tejidos utilizando una bomba de 307 HPLC (Gilson), a razón de 3 ml / min. En un experimento típico de 5-6 horas, 1 litro de solución de Ringer cada uno es suficiente. </li><li> A lo largo del experimento, el tejido es continua superfused con 37 ° C la solución de Ringer. Una sonda de calor se coloca directamente sobre el tejido. </li><li> Los estímulos se entregan con el líquido de Gilson 215 brazo controlador robótico. Los estímulos se guardan en frascos de vidrio con tapa de goma, y ​​bajo el control del software de Gilson, el brazo robótico de entrega de los estímulos a la línea de perfusión, mientras que el caudal y presión constantes se mantienen. </li><li> El estado de la válvula de HPLC (bucle comprometido / no comprometidos) está representada por una tensión eléctrica, que es registrado por el equipo de adquisición como un canal adicional para asegurar la sincronización con la actividad neuronal. </li></ol> Parte 3. Preparación de los MEA y el dispositivo de entrega de estímulo <ol><li> Antes de realizar la disección, llenar el MEA y con BSA en dH2O durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague el MEA con calentamiento burbujea la solución de Ringer y el lugar de la MEA en el hielo. </li><li> El primer controlador de líquidos HPLC y la bomba de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li></ol> Parte 4. VNO Disección <ol><li> Antes de realizar la disección, llenar 2 60x15 mm placas de Petri con burbujas solución de Ringer y el lugar en el hielo. También llenar dos platos Petri Sylgard recubierto del mismo tamaño con solución de Ringer y el lugar en el hielo. Chill adicionales 50 ml de agua tibia-burbujas de timbre para su uso durante la disección. </li><li> El ratón se sacrifica por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical. </li><li> Hacer incisiones bilaterales desde el lado de la boca, que corre paralela a la línea de la mandíbula, en la parte posterior de la cabeza. Únete a los dos cortes a lo largo de la parte posterior del cuello y quitar la parte dorsal de la cabeza, dejando la mandíbula inferior, conectado al ratón. </li><li> Usando tijeras finas, cortadas entre el tejido y cada lado del hueso de la mandíbula superior para separar el tejido del hueso. </li><li> # 3 usando pinzas, retire el tejido del paladar para exponer la cavidad nasal. </li><li> Utilizando unas tijeras pequeñas o un bisturí, corte entre uno y otro lado de los dientes frontales superiores 2 para liberar la cápsula vomeronasal de los huesos. </li><li> # 3 usando pinzas, recoger la cápsula vomeronasal por el hueso plano y colocar en la placa de Petri en el hielo. Los pasos a través de la inmersión se debe realizar en menos de 3 minutos. </li><li> Coloque el plato en un estereomicroscopio, iluminado con la luz reflejada. Retire la cápsula ósea de un VNO a la vez usando # 3 pinzas. Utilice una mano para estabilizar la cápsula ósea sujetando el extremo caudal y la otra mano para pelar los huesos fuera de la VNO, teniendo cuidado de no dañar el VNO. </li><li> Cuando se retira el hueso, la transferencia del VNO a un plato de Petri recubiertas Sylgard. Utilice el plato que queda para el VNO otros. Interruptor de la iluminación de luz transmitida. </li><li> Utilizando micro-tijeras o pinzas de # 5, separar el VNO de los vasos sanguíneos reduciendo a lo largo del borde del VNO. En este punto, setiene la hoja neural completamente separados de los vasos sanguíneos. </li><li> Coloque el VNO con el lado interno (dendríticas). # 3 usando pinzas, anclar el VNO a la Sylgard en una esquina del tejido. Pelar el epitelio neural de la lámina basal con un pequeño fragmento de una hoja de afeitar con revestimiento de teflón celebró con una pinza. De la cuchilla en un ángulo pequeño (&lt;30 ° de la superficie de la antena) es el mejor. </li><li> Con una pipeta de vidrio, la transferencia de la pieza del epitelio neural de la antena en el AMUMA. La posición del VNO en la parte superior del campo de electrodos con el lado dendríticas arriba. Retire el exceso de solución de Ringer con una pipeta. Coloque el soporte de tejido de malla en el pozo de la matriz para mantener el VNO en su lugar, y llenar con solución de Ringer frío es. </li></ol> Parte 5. Grabación <ol><li> Coloque el MEA en un MEA 1060 amplificador y la posición de la sonda de calor directamente sobre el tejido. </li><li> Para confirmar la correcta colocación de la sonda de calefacción, estimular con solución de Ringer conteniendo 50 mM de potasio (sustituido por sodio equimolar) durante 2 segundos. Ajuste la posición de reducir al mínimo la latencia de la respuesta neuronal a la solución de potasio. </li><li> Superfuse el tejido con una solución de Ringer se calienta durante 45 minutos a 1 hora antes de la grabación para que el tejido se adapte. </li><li> Las señales eléctricas se guardan en el disco utilizando el software de grabación personalizada. </li></ol> Parte 6. Análisis de Datos <ol><li> El análisis de datos en línea se puede hacer con las grabaciones de electrodos en bruto. Por ejemplo, podemos medir los cambios en la tasa de disparo de las células registradas en respuesta a ligandos particular. Los conjuntos de datos resultantes son grandes y se puede utilizar para hacer frente a muchas preguntas diferentes, la familiaridad con un lenguaje de programación o análisis (C, Matlab, R, Python, o similar) es necesaria. </li></ol> Parte 7. Resultados representante Esta preparación suele ser lo suficientemente estable para grabar durante 6 horas, produciendo una gran cantidad de datos (6 horas de grabación de 60 electrodos). <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Una instantánea de la actividad simultánea a través de la mitad de la matriz se muestra. La ventana de tiempo se extiende por 400 ms. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. En un experimento típico, nos estimulan con compuestos de interés en particular por 10 segundos. Este trazado, que es un ejemplo de una respuesta a 100 veces la orina diluida ratón hembra. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2.

<ol><li>Dulac, C., Torelo, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals%3A+from+genes+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li>
<li>Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+Vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of Vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Nodari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+steroids+as+natural+ligands+of+mouse+pheromone-sensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons.</a> J Neurosci. 28, 6407-6418 (2008).</li>
</ol>

Grabaciones multielectrodo conjunto nos permiten la posibilidad de monitorear la actividad simultánea de una gran población de neuronas. Esta es una herramienta útil para probar las propiedades de un sistema sensorial, en concreto el VNO. A diferencia del sistema olfatorio principal, el OVN detecta estímulos en fase líquida. Además, el VNO es un tejido heterogéneo. Hay aproximadamente 300 tipos diferentes de receptores en el ratón 1, presumiblemente con perfiles de respuesta diferente. MEA grabaciones en comb...

grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Entender los circuitos neuronales requiere de métodos de registro de las neuronas de manera simultánea. Para<em&gt; In vitro</em&gt; Estudios, una tecnología actualmente disponible es amplia plana multielectrodo (MEA) de grabación. Aquí se documenta el uso de los acuerdos ambientales multilaterales para estudiar el ratón órgano vomeronasal (OVN), que desempeña un papel esencial en la detección de las feromonas y señales sociales a través de una diversa población de neuronas sensoriales que expresan cientos de tipos de receptores. La combinación de grabación de MEA con un controlador robótico líquido para suministrar estímulos químicos, las respuestas sensoriales de una gran y diversa población de neuronas se pueden grabar. La preparación que nos permite eliminar el neuroepitelio intacta del VNO en el ratón y estimular con una batería de productos químicos o ligandos potenciales, mientras que el control de la actividad eléctrica de las neuronas durante varias horas. Por lo tanto, esta técnica sirve como un método útil para evaluar la actividad del ligando, así como explorar las propiedades de las neuronas receptoras. Se presentan las técnicas necesarias para preparar el epitelio vomeronasal, grabación de MEA, y la estimulación química.

Multielectrodo array (MEA) grabaciones de proporcionar un método para estudiar la actividad eléctrica de las grandes poblaciones de neuronas. Aquí se presentan los detalles de una preparación de MEA para grabar desde el epitelio vomeronasal del ratón al mismo tiempo estimular el tejido.

Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

La comprensión de los circuitos neuronales requiere métodos para registrar la actividad de muchas neuronas simultáneamente. Para los estudios in vitro, una tecnología disponible actualmente es...

Se utilizan matrices planas de múltiples electrodos para registrar del órgano nasal UL. El órgano vomeronasal se extrae del ratón de manera que el epitelio neural permanezca intacto. Primero, se extrae la cápsula del órgano vomeronasal del ratón.Luego, se aísla el epitelio neural de la cápsula ósea, los vasos sanguíneos y la lámina basal. El tejido se coloca en la matriz de electrodos multicanal con el lado del botón dendrítico hacia arriba. Una vez completado este montaje, utilizamos un brazo robótico para administrar estímulos líquidos al tejido.Hola, soy Hannah Arnon del laboratorio de Tim Wholly en el Departamento de Anatomía y Neurobiología de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington. Soy Cheyenne Fu, también del laboratorio Holy. Hoy les mostraremos un procedimiento para la grabación con matriz de electrodos del órgano vomeronasal.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las propiedades sensoriales o las neuronas receptoras en el sistema atorio accesorio. Comencemos. Las grabaciones eléctricas se obtienen con una matriz plana de múltiples electrodos o MEA con electrodos planos de nitruro de titanio de 10 micrómetros, aislados con nitruro de silicio.60 electrodos están dispuestos en dos campos que consisten en una cuadrícula de cinco por seis con una separación centro a centro de 30 micrómetros. Mediante un amplificador MEA 10 60, las señales eléctricas se amplifican. Se requieren señales amplificadas mil veces a 10 kilohercios.Utilizando una tarjeta de adquisición de datos y un software personalizado de adquisición de datos, el tejido se mantiene fijo sobre la MEA mediante una malla de nailon, que está unida a un inserto personalizado, el cual encaja firmemente dentro del cultivo. Para preparar la MEA, ahora que hemos visto las MEA, veamos cómo realizar la disección del órgano vomeronasal (VNO). Antes de realizar la disección, llene el pozo de la MEA con albúmina sérica bovina o BSA; a continuación, enjuague la MEA usando una solución de Ringer tibia y burbujeada y colóquela sobre hielo.Para prepararse para la disección, llene dos placas de Petri de 60 por 15 milímetros con solución de Ringer burbujeada y colóquelas en hielo. Además, llene dos placas de Petri recubiertas con protector de sílice del mismo tamaño con solución de Ringer y colóquelas en hielo. Enfríe adicionalmente 50 mililitros de Ringer burbujeado para usar durante la disección.Comience con un ratón sacrificado realizando incisiones bilaterales desde el costado de la boca, paralelas a la línea de la mandíbula, hasta la parte posterior de la cabeza. Una los dos cortes a lo largo de la nuca y retire la parte dorsal de la cabeza, dejando la mandíbula inferior unida al ratón mediante tijeras finas. Corte entre el tejido y cada lado del hueso maxilar superior para separar el tejido del hueso.A continuación, utilice pinzas número tres para desprender el tejido del paladar, exponiendo la cavidad nasal mediante un corte con tijeras pequeñas o un escalpelo entre y a ambos lados de los dos dientes frontales superiores, con el fin de liberar la cápsula nasal vulnerable del hueso usando pinzas número tres. Tome la cápsula nasal vulnerable por el hueso plano y colóquela en la placa de Petri sobre hielo. Los pasos anteriores, hasta la inmersión del órgano vomeronasal en solución de Ringer fría, deben realizarse en menos de tres minutos.Para evitar la muerte del tejido, coloque el platillo bajo un microscopio estereoscópico iluminado con luz reflejada. Utilice pinzas número tres para retirar la cápsula ósea de un órgano vomeronasal (VNO) a la vez. Use una mano para estabilizar la cápsula ósea sujetándola desde el extremo del codo y la otra mano para desprender el hueso del VNO, teniendo cuidado de no dañar el VNO.Una vez que se ha eliminado el hueso, transfiera el v y el o a una placa de Petri recubierta con papel de cigarrillo. Utilice la placa restante para el otro VNO. Cambie la iluminación para usar luz transmitida con tijeras microquirúrgicas.O pinzas número cinco. Separe el órgano vomeronasal del vaso sanguíneo cortando a lo largo del borde del órgano vomeronasal. En este punto, tendrá la lámina neural completamente separada del vaso sanguíneo.Coloque el órgano vomeronasal con el lado interno hacia arriba utilizando pinzas número tres. Ancle el órgano vomeronasal al protector S en una esquina del tejido usando un pequeño fragmento de una hoja de afeitar recubierta de teflón sujeta con una pinza. Separe el epitelio neural de la lámina basal manteniendo la hoja en un ángulo poco profundo inferior a 30 grados respecto a la superficie del recipiente.Funciona mejor. Utilizando una pipeta de vidrio, transfiera el fragmento de epitelio neural desde el recipiente hasta la MEA y coloque el órgano vomeronasal encima del campo de electrodos con el lado dendrítico hacia arriba.Retire el exceso de solución de Ringer con una pipeta y luego coloque el soporte de tejido con malla en el pocillo de la matriz para mantener el órgano vomeronasal en su lugar. Llene el pocillo con solución de Ringer fría una vez completada la disección. Veamos cómo registrar. Para iniciar una sesión de grabación, coloque la matriz de electrodos multicanales (MEA) en un amplificador MEA 10 60 y coloque la sonda del calentador directamente encima del tejido para confirmar el funcionamiento adecuado del calentador.Coloque la sonda y estimule con solución de Ringer que contiene 50 milimolares de potasio durante dos segundos. Ajuste la posición para minimizar la latencia de la respuesta neural a la solución de potasio. El tejido requiere una superperfusión continua, que se logra suministrando solución de Ringer desde una bomba HPLC.Súperfuse el tejido con solución de Ringer caliente durante 45 minutos a una hora antes de la grabación para permitir que el tejido se aclimate. Los estímulos se administran mediante el brazo robótico Gilson dos 15 manejador de líquidos. Se presentan realizando inyecciones en una válvula HPLC y alternando entre flujo directo y el bucle bajo el control del software Gilson, el brazo robótico entrega los estímulos a la línea de perfusión mientras se mantiene un flujo constante y presión.El estado de la válvula de HPLC está representado por un voltaje eléctrico, que es registrado por la computadora de adquisición como un canal adicional. Para garantizar la sincronización con la actividad neuronal, las señales eléctricas se guardan en el disco mediante un software personalizado de grabación. Ahora le mostraremos algunos resultados representativos de la grabación con matriz de electrodos múltiples del órgano vomeronasal.Este procedimiento produce grandes cantidades de datos debido al elevado número de electrodos, y la preparación generalmente permanece estable durante aproximadamente seis horas. A continuación se muestra un ejemplo de 400 milisegundos de datos provenientes de una mitad de la MEA. Este procedimiento es útil para medir la respuesta de las neuronas sensoriales a ligandos; aquí se muestra la respuesta a orina de ratón hembra diluida 100 veces, registrada a partir de un solo electrodo.La orina se entregó durante 10 segundos, como indica la barra negra. Observe el aumento en la actividad de disparo tras la presentación del estímulo. Acabamos de mostrarle cómo realizar grabaciones con matriz electrofisiológica múltiple en el órgano vomeronasal de ratón al llevar a cabo este procedimiento.Es importante recordar tener paciencia. Eso es todo. Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Neurociencia

El electroolfactogram (EOG) de grabación es una manera informativa, fácil de realizar, y fiable para evaluar la función olfatoria a nivel del epitelio olfativo. Este protocolo describe un sistema de grabación, preparación de los tejidos del ratón, la recopilación de datos y análisis de datos básicos.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Una forma sólida para estudiar las avalanchas neuronales, es decir, invariante en escala espacio-temporal de ráfagas de actividad, lo que indica la dinámica de estado crítico en la corteza. Avalanchas surgen espontáneamente en el desarrollo de las capas superficiales de la corteza cultivo que permite mediciones a largo plazo de la actividad con planos las redes distribuidas multi-electrodo (MEA) en condiciones controladas con precisión.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

El órgano vomeronasal (VNO) detecta señales químicas intraspecíficas que transmiten información social y reproductiva. Hemos realizado experimentos de imagen de Ca2+ utilizando ratones transgénicos que expresan G-CaMP2 en el tejido del VNO. Este enfoque nos permite analizar los complejos patrones de respuesta de las neuronas vomeronasales frente a un gran número de estímulos de feromonas.

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