Ensayo de la capacidad de difusible moléculas de señalización para reorientar embrionarias axones de la comisura espinal

Los explantes de la médula espinal dorsal se disecan a partir de embriones de rata y se cultivan en un colágeno tridimensional. El gel se opone a las células que expresan una molécula señalizadora candidata. La capacidad de la molécula señalizadora para reorientar los axones que crecen dentro del explante espinal dorsal se evalúa mediante inmunohistoquímica.

Hola, soy Virginia Hazen del laboratorio de Samantha Butler en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad del Sur de California. Soy Keith Fun, también del laboratorio de Butler. Y soy Ken Ya Mai del laboratorio de Butler.

Hoy les mostraremos un procedimiento para cultivar implantes dorsales de la médula espinal y agregados de células cost transfectadas en una matriz de colágeno. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para evaluar la capacidad de moléculas señalizadoras candidatas para orientar neuronas espinales comisurales. En este experimento, examinaremos la capacidad de la proteína morfogenética ósea, o BMP7, para actuar como un quimiorrepelente.

Comencemos. Prepare agregados de células co utilizados para desafiar la trayectoria de los axones comisurales procedentes de células co. Transfectadas con el plásmido de expresión para la molécula de interés aquí, la proteína morfogenética ósea o BMP7.

Aspire el medio del recipiente y lave las células con un mililitro de PBS 1X. Retire el PBS y trate las células con medio medio de disociación celular libre de enzimas durante 15 minutos. Detenga la reacción añadiendo un mililitro de medio con suero bovino fetal.

Utilizando una punta de pipeta de 1000 microlitros, itere las células hasta que no quede ninguna sobre la superficie de la placa de cultivo. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y haga un pellet de las células durante dos minutos. A 2000 RPM, retire el sobrenadante y pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender.

En 100 microlitros de medio, coloque varias gotas de 20 microlitros de la solución celular sobre la parte interna de la tapa de una placa de cultivo de 35 milímetros. Cierre la tapa sobre la placa y colóquela en el incubador durante varias horas para permitir que las células se agreguen. Para preparar implantes de médula espinal dorsal, mantenga recién recolectados.

Embriones de rata E11 sobre hielo. En medio L15 y con una aguja de tungsteno afilada, retire un segmento de cuatro a seis somitas de la región del tronco inmediatamente por debajo del brote del miembro anterior de cada embrión. Utilizando una pipeta de plástico, recoja el tejido en un pocillo de una placa de cuatro pocillos.

Bien no placa sobre hielo. Cuando todos los segmentos hayan sido diseccionados, use la pipeta para transferir los fragmentos a un segundo pocillo de la placa no que contiene medio L-15 más pasta de disco. Incube el tejido a temperatura ambiente durante no más de cinco minutos.

Para evitar la muerte celular, no sobredigiera el tejido. Añada un mililitro de medio L 15 fresco con 5% de suero de cabra inactivado por calor al tercer pocillo de la placa. Y transfiera los fragmentos de tejido a este pocillo.

Al finalizar el período de incubación en el espacio de dis, deje reposar el tejido sobre hielo durante una hora. Para facilitar la disección posterior en un tubo de microcentrífuga, agregue 40 microlitros de medio mínimo esencial 10 x a 360 microlitros de colágeno. Y vortexe brevemente para mezclar y centrifugue en una pico fuga.

La solución será amarilla y debe mantenerse sobre hielo tanto como sea posible para evitar que el colágeno se solidifique. Para cada lote de colágeno, titular con la cantidad de bicarbonato de sodio 0,8 molar que haga que la solución de colágeno se vuelva ligeramente anaranjada. Mezclar la solución después de cada adición. Cuando la solución de colágeno tenga este color, permanecerá líquida si se mantiene sobre hielo, pero estará preparada para solidificarse al alcanzar la temperatura ambiente. Si después de mezclar la solución se vuelve rosada, comenzar de nuevo con un tubo fresco de colágeno. Aplicar 20 microlitros de colágeno en cada pocillo de una placa limpia de cuatro pocillos sin medio.

Con la punta de la pipeta, extienda el colágeno para formar una pequeña almohadilla. Deje que el colágeno se solidifique a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Bajo el microscopio de disección, utilice una aguja de tungsteno recién afilada y un par de pinzas finas para retirar el mesodermo que rodea la médula espinal de un embrión con la aguja de tungsteno; retire la porción ventral de la médula espinal, que puede distinguirse por la presencia de la placa del suelo.

En el borde más ventral, la placa del suelo es ligeramente más gruesa que la placa del techo en el borde dorsal. En este ejemplo, la médula espinal está colocada con el lado ventral hacia abajo. Corte cuidadosamente el tejido trabajando paralelo a la placa del suelo y deseche la quinta parte ventral de la médula espinal.

Utilice la aguja para seccionar verticalmente el explante de la médula espinal dorsal. Asegúrese de que los bordes queden lo más limpios posible y vuélvalos a recortar si es necesario. Utilice una pipeta de boca equipada con un tubo capilar de vidrio de 0,5 milímetros de diámetro para transferir cada explante a una almohadilla de colágeno separada.

Con la aguja de tungsteno, corte el agregado de células co transfectadas en cuadrados de aproximadamente el mismo ancho que el borde lateral de la médula espinal dorsal. Explic. Utilice una pipeta de boca para transferir uno de los cuadrados sobre la almohadilla de colágeno con la x explic. Use la pipeta de boca para aspirar cualquier líquido en exceso.

No aspire en exceso, ya que una pequeña cantidad de líquido ayudará en la aplicación posterior de colágeno; aplique cuatro microlitros de colágeno cebado sobre la almohadilla. Utilice la aguja de tungsteno para mover el colágeno sobre los implantes sin tocar directamente el tejido. Al mover la aguja en el colágeno, oriente cada x explante de manera que el agregado de células co esté adyacente a su borde lateral.

Deje que el colágeno se solidifique durante 15 a 20 minutos. Repita el proceso de aplicación con otros cuatro microlitros de colágeno para asegurarse de que el explante x quede completamente rodeado por colágeno antes de pasar al siguiente embrión en una campana de cultivo de tejidos con 0,5 mililitros de medio y cultive durante 30 a 40 horas. En una incubadora dentro de una campana extractora, fije los explantes con 0,5 mililitros de solución al 4 % de paraformaldehído en PBS durante 45 minutos. Manteniendo el tejido sobre hielo, lave dos veces con 0,5 mililitros de la solución de bloqueo y permeabilización PBTN.

Incube los explantes x en solución bloqueante a cuatro grados Celsius, preferiblemente durante la noche. Utilice pinzas para retirar el explante X del pocillo y coloque cada uno en un pocillo de una placa de 48 pocillos.

Añada 200 microlitros de anticuerpo primario a cada pocillo. Para visualizar los axones comm choral, utilice el anticuerpo monoclonal de ratón anti-ttag y, para determinar si la transfección cruzada entre células fue exitosa, incluya un anticuerpo contra la molécula que se está analizando. Incube durante la noche a cuatro grados Celsius.

Lave cada muestra en la solución bloqueante PBTN cinco veces, una hora por lavado, a cuatro grados Celsius. Retire el PBTN y agregue 200 microlitros de anticuerpo secundario a cada una. Tape bien con papel de aluminio para evitar el blanqueo e incube durante la noche a cuatro grados Celsius.

Lave las muestras cinco veces en PBTN como antes. Transfiera cada explante a una placa portaobjetos con tres pocillos. Retire el exceso de líquido, monte en medio invecta shield y cubra con un cubreobjetos.

Almacene los portaobjetos en una carpeta o caja protegida de la luz, a cuatro o menos veinte grados Celsius, hasta que estén listos para visualizarse en el microscopio. A continuación, mostraremos algunas imágenes representativas de explantes de X después de haber sido cultivados, fijados, teñidos e imagenados mediante microscopía confocal. El panel A muestra que un explante de placa del techo, delineado en blanco, puede reorientar los axones corales positivos para la etiqueta uno lejos de él, demostrando que la placa del techo es la fuente de un quimiorrepelente axonal. El panel B muestra que las células que secretan la molécula señalizadora M tact, la proteína morfogenética ósea o BMP siete, pueden repeler axones carcelares de manera similar a la placa del techo.

Los axones de células que secretan únicamente el plásmido de expresión no tienen ningún efecto sobre la orientación de los axones. Acabamos de mostrarle cómo diseccionar, orientar y cultivar un explante de médula espinal y provocar agregados celulares para que pueda determinar si una molécula señalizadora candidata posee actividad de reorientación de axones. Al realizar este procedimiento, es importante mantener el colágeno sobre hielo tanto como sea posible y encapsular completamente el explante en colágeno para que no entre en contacto directo con el medio de cultivo.

Y finalmente, incubar solo durante el tiempo que tarde en extenderse los axones hasta el borde ventral del explante x. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.I.