Name: Optimizado de gel de fibrina bolas de ensayo para el Estudio de la angiogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Aprende el ensayo de fibrina para estudiar la angiogénesis in vitro usando células endoteliales y fibroblastos. Este método permite visualizar brotes, formación de luz y anastomosis en tiempo real.

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CÉLULAS PREPARACIÓN <ol><li> Abrir HUVEC y fibroblastos en M199/10% de SFB / Pen-estreptococo (1:100) 1-2 días antes de abalorios. </li><li> Interruptor de medio EGM-2 (Clonetics) el día antes de abalorios para HUVEC y el día antes de la incrustación de los fibroblastos. </li><li> Una concentración de aproximadamente 400 bolas por HUVEC es necesario. </li><li> 20.000 fibroblastos por bien que se necesita. </li></ol> RECUBRIMIENTO las cuentas con HUVEC - día -1 <ol><li> Trypsinize HUVEC. </li><li> Permitir cuentas para resolver (NO CENTRIFUGA!). Aspirar el sobrenadante y lavar las cuentas brevemente en 1 ml de agua tibia EGM-2 medio. </li><li> Mix cuentas 2500 w / 1X10 6 HUVEC en 1,5 ml de agua tibia EGM-2 medio en un tubo de FACS. Lugar de forma vertical en la incubadora. (Esto será suficiente para unos 10 pozos. Escala hasta si es necesario) </li><li> Se incuba durante 4 horas a 37 ° C, agitando el tubo cada 20 minutos. (Buena capa es crucial para la germinación.) </li><li> Después de 4 horas, la transferencia de bolas recubiertas de un frasco T25 en 5 ml de EGM-2 y salir de O / N. </li></ol> INTEGRACIÓN EN bolas recubiertas de gel de fibrina - DÍA 0 <ol><li> Preparar el 2,0 mg / ml solución de fibrinógeno (Ver sección de recetas). </li><li> Añadir 0,15 unidades / ml de aprotinina para la solución de fibrinógeno. </li><li> Transferencia de bolas recubiertas de un tubo cónico de 15 ml y dejar cuentas resolver. Cuentas resuspender en 1 ml de EGM-2 y transferir a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Lavar las perlas de 3X con 1 ml de EGM-2 por pipeta hacia arriba y abajo lentamente. </li><li> Contar con las cuentas de un cubreobjetos y se resuspenden en solución de fibrinógeno en una concentración de ~ 500 cuentas / ml. </li><li> Añadir 0.625 unidades / ml de trombina a cada pocillo. </li><li> Añadir 0,5 ml de la suspensión de fibrinógeno / cordón a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Cambiar la punta de la pipeta para cada bien! </li><li> Mezclar la trombina y fibrinógeno por la que suben y bajan suavemente con la punta de la pipeta ~ 4 a 5 veces. Tenga cuidado de no hacer burbujas grandes. </li><li> Dejar la placa durante 5 minutos en la capilla, luego se coloca en los 37 ° C incubadora durante 10-15 minutos para generar un coágulo. </li><li> A la espera de que el coágulo, trypsinize fibroblastos. </li><li> Añadir 1 ml de EGM-2 por así gota a gota. </li><li> Fibroblastos de semillas en la parte superior del gel de fibrina en una concentración de 20.000 células por pocillo. </li></ol> NOTAS: Por lo general, cuando el gel de fibrina se forma, podrás ver pequeñas burbujas en el gel. No te preocupes, van a desaparecer en 3-4 días. Cambiar los medios de comunicación cada dos días, es decir, el día 2, 4, 6, etc .. El día 3 ó 4 que debe comenzar a ver brotar.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

Existe un consenso creciente de que en tres dimensiones (3D) en los ensayos de la angiogénesis in vitro ofrecen un modelo que está mucho más cerca el entorno real en vivo que se puede lograr a partir de cultivos en 2D. Es evidente que los sistemas superiores de 3D debe ser reproducible, y ser capaz de imitar a varios de los pasos más importantes de la angiogénesis. Mientras que varios ensayos previa en 3D han sido desarrollados, muchos de estos o bien utilizar difíciles de obtener células microvasculares, o sólo recapitular algunas de las e...

<table><tbody><tr><td>Perlas Cytodex-3</td><td>Reactivo</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/frasco. 1.0,5 g de perlas secas se hidratan y hinchan en 50 mL de PBS (pH = 7,4) durante al menos 3 h a temperatura ambiente. Utilice un tubo de 50 mL y colóquelo en el agitador orbital. 2. Deje asentar las perlas (~15 min). Descarte el sobrenadante y lave las perlas durante unos minutos con PBS fresco (50 mL). 3. Descarte el PBS y reemplace con PBS fresco: 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60000 perlas/mL o 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30.000 perlas/mL. 4. Coloque la suspensión de perlas en un frasco de vidrio silanizado (Windshield Wiper o Sigmacote). 5. Esterilice las perlas mediante autoclave durante 15 min a 115&amp;#x00B0;C. 6. Almacénelas a 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/frasco. Reconstituya la aprotinina liofilizada a 4 U/mL en agua desionizada. Filtre estérilmente. Prepare alícuotas de 1 mL cada una. Almacene a -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinógeno Tipo I</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. Disuelva el fibrinógeno a 2 mg/mL en DPBS. Tenga en cuenta el porcentaje de proteína coagulable y ajuste en consecuencia. Caliente en un baño de agua a 37 &amp;#x00B0;C para disolver el fibrinógeno. Mezcle invirtiendo el tubo. No vortex. Filtre estérilmente a través de 0,22 µm</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1.000 unidades. Reconstituya en agua estéril a 50 U/mL. Prepare alícuotas de 0,5 mL cada una. Almacene a -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

optimizado de gel de fibrina bolas de ensayo para el estudio de la angiogénesis

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

La angiogénesis es un complejo proceso de múltiples pasos, donde, en respuesta a estímulos angiogénicos, nuevos vasos son creados a partir de los vasos existentes. Estas medidas incluyen: la degradación de la membrana basal, proliferación y migración (brotes) de las células endoteliales (CE) en la matriz extracelular, la alineación de la CE en los cables, ramas, la formación del lumen, anastomosis y la formación de una nueva membrana basal. Muchos de los ensayos in vitro se han desarrollado para estudiar este proceso, pero la mayoría sólo imitar ciertas etapas de la angiogénesis, y morfológicamente los vasos en los ensayos a menudo no se parecen a los barcos en vivo. Basado en un trabajo anterior de Niels y Drenckhahn, hemos optimizado un ensayo de angiogénesis in vitro, que utiliza la vena umbilical humana CE y los fibroblastos. Este modelo recapitula todas las etapas clave al comienzo de la angiogénesis y, sobre todo, los vasos pantalla patente lúmenes intercelular rodeado de polarización CE. CE se aplica sobre microportadores cytodex y embebido en un gel de fibrina. Los fibroblastos son en capas en la parte superior del gel donde se presten los necesarios factores solubles que promueven la CE que brotan de la superficie de los granos. Después de varios días, numerosos vasos que están presentes se puede observar fácilmente en contraste de fases y microscopía lapso de tiempo. Este video muestra los pasos clave en la creación de estas culturas.

Este video muestra el protocolo de un ensayo de angiogénesis in vitro que recapitula varias etapas de la angiogénesis. Time-lapse imágenes de germinación, la formación del lumen, ramas y anastomosis - las características clave de la angiogénesis - se muestran.

Optimizado de gel de fibrina bolas de ensayo para el Estudio de la angiogénesis

La angiogénesis es un proceso complejo de múltiples etapas en el cual, como respuesta a estímulos angiogénicos, se crean nuevos vasos a partir de la vasculatura existente. Estos...

Hola, mi nombre es Mar Katsu. Soy del Laboratorio Hughes en el Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la uc Irvine. Realizaré el ensayo de perlas de fibrina.Todo el proceso tarda dos días en completarse. El primer día consiste en recubrir perlas con células endoteliales del plexo corioideo o de la vena umbilical humana. El segundo día consiste en incrustar estas perlas recubiertas en geles de fibrina y luego superponer fibroblastos encima de estos geles.Utilizamos este ensayo para estudiar los múltiples pasos de la angiogénesis en un entorno in vitro. El primer día, en la parte uno, utilizamos las microesferas CY X three. Luego, el segundo día, empleamos estos tres reactivos: fibrinógeno, trombina y aprotinina cytx.Las perlas tres provienen de Amazon Biosciences y están especialmente codificadas con colágeno para que las células endoteliales se adhieran a las perlas. Así, el siguiente reactivo es el fibrinógeno, que obtenemos de sigma. Este forma el gel o coágulo real en el ensayo de perlas.La trombina es un factor de coagulación. Esta proteína convierte el fibrinógeno en fibrina, por eso la añadimos al ensayo. La aprotinina es un inhibidor sérico de proteasas.Usamos es

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La cascada de adhesión de las plaquetas se lleva a cabo en presencia de flujo de tensiones, no es un factor en cuenta en convencional (estática) y placa-ensayos. Este artículo informa sobre un ensayo de agregación plaquetaria utilizando una placa de microfluidos bien en formato de imitar las condiciones fisiológicas de flujo de corte.

Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

Este video muestra un ensayo modificado basado en perlas de microportadores que incorpora pericitos para estudiar la germinación endotelial durante las primeras etapas de la angiogénesis. El ensayo proporciona un modelo experimental in vitro para comprender los mecanismos moleculares de la angiogénesis y el efecto de las terapias antiangiogenéticas.

Ensayo de germinación de perlas para la evaluación de la angiogénesis en etapa temprana: un modelo in vitro basado en perlas para estudiar la germinación endotelial en presencia de pericitos

La microscopia del lapso de tiempo y las técnicas de proceso de imagen fueron utilizadas para observar y para analizar la compactación fibroblasto-mediada del gel y el realineamiento de la fibra de la fibrina en un biorreactor ambientalmente controlado durante un período de 48 horas.

Observación Y Cuantificación De Fibroblastos Mediada Por Fibrina Gel Compactamiento

La recapitulación del microambiente específico del órgano, que estimula la angiogénesis local, es indispensable para la regeneración exitosa de los tejidos dañados. Este informe demuestra un método novedoso para implantar geles de fibrina en la superficie pulmonar de ratones vivos con el fin de explorar cómo el microambiente específico del pulmón modula la angiogénesis y la regeneración alveolar en ratones adultos.

El implante de gel de fibrina en pulmón de ratón para el Estudio de la angiogénesis pulmón específico

Las células cancerosas se incrustan en un gel de colágeno y luego se intercalan en un gel de fibrina acelular para generar un sistema de cultivo 3D en el que se puede monitorear la invasividad y la formación de tumores satélite.

Tridimensional Ensayo de Cultivo para explorar invasividad de las células del cáncer y la formación de tumores satélite

Presenta protocolo una novela en vitro la tira de ensayo más modelos adecuadamente el proceso de en vivo brotación angiogénesis mediante la incorporación de pericitos. Esta modificación permite el ensayo de grano más fielmente recapitular las interacciones celulares heterotípicos entre las células endoteliales y las células murales que son críticas para la angiogénesis.

Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo

Aquí, presentamos un protocolo de estudio de la fisiopatología de la retinopatía diabética proliferativa mediante el uso de los tejidos derivados del paciente quirúrgico suprimido, fibrovasculares de tejido nativo tridimensional caracterización y ex vivo la cultura. Esta ex modelo de cultura vivo también es favorable para probar o desarrollar nuevos tratamientos.

Un modelo de cultivo de tejidos Ex Vivo para las complicaciones Fibrovascular en la retinopatía diabética proliferativa

Este método describe el cultivo de células endoteliales derivadas de iPSC como 40 microvas 3D perfundidas en una plataforma microfluídica estandarizada. Esta plataforma permite el estudio de la brotación angiogénica impulsada por gradientes en 3D, incluyendo anastomosis y estabilización de los brotes angiogénicos de una manera escalable y de alto rendimiento.

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro

El método aquí presentado puede evaluar el efecto de los reactivos sobre la angiogénesis o la permeabilidad vascular in vivo sin tinción. El método utiliza la inyección de dextrano-FITC a través de la vena de la cola para visualizar los neovasos o la fuga vascular.

Ensayo de tapón de gel de matriz in vivo modificado para estudios de angiogénesis

La fracción vascular estromal (FSV) aislada mecánicamente en combinación con un hidrogel de fibrina ofrece un portador fácil y eficiente de células estromales viables derivadas del tejido adiposo para diversas indicaciones, incluida la ingeniería de tejidos o la cicatrización de heridas. Aquí, presentamos la preparación de una construcción mecánica de hidrogel de fibrina SVF (mSVF) para investigación traslacional y aplicación clínica.

La combinación de fracción vascular estromal aislada mecánicamente e hidrogel de fibrina: un protocolo de procesamiento

Aquí, presentamos un protocolo de electroforesis en gel de fibrinógeno-poliacrilamida (PAGE) para separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.

Separación rápida y visualización de agentes fibrinogenolíticos activos en Sipunculus nudus mediante electroforesis en gel de fibrinógeno-poliacrilamida

Aprende el ensayo de fibrina para estudiar la angiogénesis in vitro usando células endoteliales y fibroblastos. Este método permite visualizar brotes, formación de luz y anastomosis en tiempo real.

Optimizado de gel de fibrina bolas de ensayo para el Estudio de la angiogénesis

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