Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Este protocolo utiliza un promotor regulable que permite la expresión controlada de proteínas. En este experimento, utilizamos un plásmido de dos micras de alta copia que expresa el dominio N dos de un promotor represible de metionina. Las células de levadura de tipo salvaje se transforman con esto.

Los plásmidos y transformantes se seleccionan en placas que carecen de uol. Después del crecimiento durante la noche. En los medios selectivos, las células no están sincronizadas por un crecimiento mediado por cortisol. Arresto.

Por último, la expresión se induce mediante la transferencia de células a medios que carecen de metionina durante el experimento de curso de tiempo. La concentración de proteínas se controla mediante Western blot y el desarrollo del fenotipo morfológico mediante microscopía. Hola, soy Claudia y trabajo en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Purdue.

Soy de Bari Muji en el alar y en el laboratorio de la AL. Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para el análisis del desarrollo de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la inducción corporal. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los aspectos morfológicos y moleculares de un fenotipo de división celular observado tras la sobreexpresión del dominio N dos de la proteína adaptativa endocítica ausente dos.

Así que comencemos. Este protocolo comienza con la construcción de una cepa de levadura que expresará la proteína de interés. En nuestro caso, transformamos la cepa de levadura de tipo salvaje W 3 0 3 con ADN plasmático de alta copia que contiene n-ésimo dos bajo el control del promotor represible de metionina dos milimolares que suprime la actividad del promotor 25.

Mientras que los medios que carecen de metionina permiten la máxima expresión, se deben seleccionar seis colonias de una placa que contenga células recientemente transformadas e inocular en 50 mililitros de medios selectivos con 0,2 milimolares de metionina en un matraz cónico, incubar durante la noche a 30 grados Celsius con agitación a 200 RPM a la mañana siguiente. Estime la densidad celular midiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros. Transfiera el equivalente a 20 OD 600 nanómetros por mililitro de células a un tubo de centrífuga estéril y recoja por centrifugación.

Vuelva a suspender las células en medio YPD mediante vórtice para sincronizar el ciclo celular aole a una concentración final de 15 microgramos por mililitro de un stock de un miligramo por mililitro en DMSO. Incubar durante cuatro horas a 30 grados centígrados con agitación a 200 RPM. Después de cuatro horas, verifique el porcentaje de células detenidas en la mitosis.

Al observar bajo el microscopio y contar el número de células con cogollos de igual tamaño, continúe con el siguiente paso. Solo si la detención es superior al 90%Recoja las células por centrifugación a 2200 RPM durante cinco minutos. Después de tres lavados con agua helada, resus, suspenda el pellet en un medio selectivo que carezca de metionina a una densidad celular de aproximadamente 0,5 OD 600 nanómetros por mililitro.

Transfiera la mitad del volumen de células a un nuevo tubo estéril y agregue metionina hasta una concentración final de 0,2 milimolares. Esto servirá como control de los efectos debidos a los niveles basales de expresión de proteínas. Regrese ambos cultivos a la incubadora a 30 grados centígrados.

Las células se analizan para el desarrollo del fenotipo cada hora durante seis horas cada vez. Transfiera puntualmente un mililitro de suspensión celular de cada cultivo a un tubo de microfuga estéril y recoja las células por centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 70 microlitros de medio. A continuación, añada 30 microlitros de azul de metileno de una caldo de un miligramo por mililitro en agua estéril.

A continuación, pipetee unos seis microlitros de esta suspensión en un portaobjetos de vidrio limpio y coloque un cubreobjetos sobre la gota. Presione suavemente el cubreobjetos para formar una capa delgada y uniforme de celdas entre las interfaces de vidrio. Divida el cubreobjetos en nueve cuadrantes y tome tres imágenes por cuadrante.

El número de celdas por campo no debe ser superior a 30 celdas para permitir una cuantificación precisa. Cuente el número de células que muestran el fenotipo en estudio, que en este ejemplo son células de levadura en ciernes con yemas alargadas y/o concatenadas que no se separan entre sí. También contamos el número de células muertas identificadas por su color azul desde el defecto de división celular inducido en la n-ésima.

Dos sobreexpresiones conducen a la muerte celular para visualizar defectos específicos del fenotipo en todo momento. Apuntar alícuotas un mililitro de cultivo en un tubo de micro fuga estéril y recolectar células por centrifugación reus. Suspender el pellet celular en 100 microlitros de un miligramo por mililitro, solución blanca de calor en agua estéril e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

La tinción con blanco calcior permite la visualización de la pared de las células e. Lave el pellet tres veces con un XPBS. Suspendemos el pellet final en 100 microlitros de PBS.

Observe las células bajo el microscopio y adquiera imágenes con un aumento de 100x utilizando óptica UV para visualizar la pared celular. Para visualizar las imágenes de adquisición de septina marcadas con GFP utilizando un filtro FS E, cuantifique el porcentaje de células con defectos en la pared celular y la localización incorrecta de septina utilizando el método mostrado anteriormente dividiendo el deslizamiento de cobertura en nueve cuadrantes y tomando tres imágenes por cuadrante para contar el video TimeLapse. La microscopía de células individuales de levadura requiere lechos de agros incrustados en medios para hacer un lecho de agros.

Primero limpie un portaobjetos de vidrio con una depresión cóncava con 70% de alcohol y déjelo secar al aire mientras el portaobjetos se seca al aire. Hervir 0,06 gramos de agros en cinco mililitros de medio selectivo que carezca de metionina en un microondas hasta que el agros se disuelva completamente rápido. Pipetear 200 microlitros de los agros que contienen medios en el portaobjetos.

Presione e invierta otro vidrio limpio que se deslice sobre él, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo. Cuando el gel se solidifique, mueva suavemente el portaobjetos en la parte superior lejos del portaobjetos de depresión, manteniendo sus superficies paralelas en todo momento. Esto asegura que la superficie del lecho de agros esté al ras con la superficie del deslizamiento de depresión.

Limpie la región del portaobjetos que rodea el lecho de agros con un pañuelo delicado. La diapositiva ya está lista para su uso en un tiempo equivalente a cuatro horas. Transfiera un mililitro de células del cultivo a un tubo de microfuga estéril y recoja por centrifugación.

Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 microlitros de medios selectivos frescos que carezcan de metionina. Aplique vaselina en los bordes del cubreobjetos. A continuación, coloque una gota de suspensión celular en el centro del lecho de agros y extiéndalo uniformemente presionando suavemente un cubreobjetos sobre él.

Sella los bordes del cubreobjetos y fija su posición forrándolos con esmalte de uñas. Una vez que el esmalte de uñas esté seco, coloque el portaobjetos en una platina calentada de un microscopio. Utilizamos un microscopio Zeiss Axio 200 M equipado con una cámara digital monocromática Zeiss Axio camm, MRM para elegir un campo que no contenga más de 10 células espaciadas adecuadamente porque el campo se abarrotará con el tiempo.

A medida que las células se dividen, tome una imagen del campo cada cinco minutos durante unas cinco horas. Para evitar reajustar el enfoque repetidamente. Programamos el software de adquisición de imágenes para que adquiera automáticamente algunas imágenes de Zack en cada punto de tiempo.

La imagen con el mejor enfoque se seleccionará más tarde para ensamblar la película con el fin de garantizar el calor adecuado para las células, una fuente externa de calor además de las etapas calentadas proporcionadas al dejar la luz blanca transmitida por el microscopio encendida durante toda la duración de la imagen. La regresión del fenotipo se puede estudiar ensamblando las imágenes en una película utilizando el software Image J. Aquí mostramos resultados representativos de la sobreexpresión de nuestra proteína de interés. Enésima dos.

En primer lugar, la expresión proteica de la n-ésima dos. Durante el transcurso del tiempo se determinó que los lisados de las células que expresan HA n-ésimo dos se analizaron mediante western blot utilizando un anticuerpo monoclonal anti HA, como lo demuestra el inmuno blot: las células cultivadas en presencia de metionina de 0,2 milimolares tienen una expresión mínima de proteínas. Sin embargo, las células cultivadas en medios que carecen de metionina muestran un aumento constante en la concentración de S dos a lo largo del experimento.

A continuación, se analizaron las células cultivadas en presencia o ausencia de metionina durante seis horas, ya que una concentración baja de n-ésima dos es incapaz de inducir un fenotipo de división celular o muerte celular solamente. Un bajo porcentaje de células están muertas, como lo indica su color azul después de teñirse con azul de metileno. Asimismo, el número de núcleos por célula, la pared celular y la organización de las septinas son normales como se esperaba.

Por el contrario, la sobreexpresión de M dos conduce a un defecto masivo de división celular y muerte celular, como lo demuestran las largas cadenas de yemas alargadas conectadas que conservan el color azul cuando se tiñen con azul de metileno. La mayoría de las células fenotípicas son multinucleadas, como lo indica la tinción de DPI. La tinción blanca de calcior muestra acumulaciones de parches anormales en la pared celular.

Además, la septina está muy mal localizada y desorganizada. La cuantificación del fenotipo en función del tiempo se muestra en este gráfico donde los círculos abiertos representan cero milimolares de metionina y los círculos cerrados representan 0,2 milimolares de metionina. Vemos aquí que a medida que la enésima concentración de dos se acumula en las células con el tiempo, el porcentaje de células que muestran el fenotipo de división celular también aumenta.

Células de control cultivadas a 0,2. La milimetionina muestra que el desarrollo del fenotipo es una función de la concentración elevada de proteínas y no debido a las condiciones de cultivo celular. Finalmente, el desarrollo del fenotipo tras la sobreexpresión de n-ésimo dos se captura mediante microscopía de video de lapso de tiempo.

Después de cuatro horas de n-ésima, dos células de sobreexpresión muestran un fenotipo de división celular morfológico leve. A medida que avanza la película, vemos períodos anormales y prolongados de crecimiento de yemas apicales, dando lugar a cogollos muy alargados. También vemos eventos de aparición de nuevas yemas antes de que haya tenido lugar un evento de separación celular.

Además, se observa que los brotes emergen de varias regiones de la célula madre dando lugar a la aparición de una rama. Acabamos de mostrarte cómo caracterizar y analizar el desarrollo de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la lista de brotación de proteínas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar acariciar las células a las velocidades de centrifugación recomendadas, ya que las velocidades más rápidas podrían dañar las células.

También es importante recordar agregar azul de metileno y cloruro justo antes de la toma de imágenes, ya que son tóxicos para las células orientales claras. Así que gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.