Name: Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprende a realizar marcaje fluorescente de proteínas de fusión SNAP-tag en células COS-7 vivas mediante microscopía. Este método permite visualizar la localización proteica en tiempo real sin necesidad de clonación repetida.

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<ul><li> Kai Johnsson </li><li> Iván Correa </li><li> Andreas Brecht </li><li> Katrin Müentener </li><li> Chris Noren </li><li> Luo dom </li><li> Xu Ming </li><li> Theodore Davis </li><li> Salvatore Russello </li><li> Aihua Zhang </li><li> Inca Ghosh </li><li> Elissa Maunus </li><li> Nicholas Labarthe </li><li> James MacFarland </li><li> John Buswell </li><li> Brenda Desmond </li><li> James Ellard </li><li> Don Peine </li></ul>

Revestimiento de células CHO-K1: <ol><li> Agregar 50-100μl de células CHO-K1 que han sido trypsinized acuerdo con los protocolos estándar de 6 ml de completar F-12K. </li><li> Mezcle la suspensión de células pipeteando arriba y abajo varias veces, entonces alícuota de 300 l de suspensión celular con tripsina a cada pocillo de una solución estéril de 8 de cámara Lab-Tek II cubreobjetos cámaras con # 1.5 borosilicato cubreobjetos cámaras (Nalgene Nunc Int.;. Product # 155409; Lote: 100808-8-0). </li><li> Incubar las muestras a 37 ° C, 5% de CO 2 durante la noche. </li></ol> La transfección transitoria de células CHO-K1 con pSNAP-ADRB2 y H2B-pSNAP: <ol><li> Compruebe las cámaras de cultivo de células sembradas en el día anterior en busca de la densidad celular y la salud. </li><li> Etiqueta el número apropiado de tubos de microcentrífuga. </li><li> En una campana de flujo laminar, creado mezclas complejas de transfección de acuerdo a la tabla de ejemplo siguiente, utilizando 0,3 g pSNAP-ADBR2 ADN plásmido de control o de 0,3 mg de ADN de control pSNAP-H2B plásmido, 1 l de TransPass D2 y 1 l de TransPass V por reacción. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> plásmido </td><td> número de reacciones </td><td> l de medio libre de suero </td><td> l de D2 TransPass </td><td> l de TransPass V </td><td> l de ADN plásmido </td><td> l de D2/reaction TransPass </td><td> l de TransPass V / reacción </td><td> ng del ADN / reacción </td><td> ADN conc. (Ng / l) </td><td> l de ADN de plásmido / reacción </td></tr><tr><td> SNAP-ADRB2 </td><td> 5 </td><td> 236.5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B-SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Burlarse de </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> Primero, mezclar el suero libre de F-12K con el ADN del plásmido apropiado, a continuación, añadir el reactivo de transfección TransPass D2, a continuación, añadir el reactivo de transfección TransPass V. Mezclar los componentes, así pipeteando arriba y hacia abajo con suavidad varias veces después de la adición de cada reactivo. </li><li> Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Durante la incubación, lavar las células una vez con 600 l de DMEM completo y añadir 450 l de DMEM completo a cada muestra. </li><li> Añadir 50 l de la mezcla de transfección complejos para cada muestra, lentamente y de forma gota a gota. </li><li> Incubar las muestras de la noche a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> SNAP-celular TMR estrella Etiquetado de células CHO-K1 transfectadas transitoriamente con pSNAP-ADRB2 y H2B-pSNAP: <ol><li> Retire con cuidado los medios de comunicación complejos de transfección de cada muestra por medio de succión al vacío. Lavar las células dos veces con 600 l de completar F-12K y reemplazar los medios de comunicación en cada pozo con 600 l de completar F-12K. </li><li> Mix de medios tinte etiquetado mediante la adición de 995 l de completar F-12K y 51 l 0,6 mM SNAP-sustrato celular TMR-Star. La concentración final de SNAP-celular TMR-Star debe ser de 3 mm. Pipeta hacia arriba y abajo varias veces para mezclar después de la adición del substrato. </li><li> Retire con cuidado los medios de cultivo de las muestras y añadir 200 l de los medios de comunicación tinte de etiquetado a cada pocillo. Incubar las muestras a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 minutos. </li><li> Mientras que las muestras se incuba, prepare la solución de Hoechst 33342 para la tinción nuclear de las muestras mediante la mezcla de 1 l de Hoechst 33342, trihidrocloruro, trihidrato (10 mg / ml de solución en agua, 16,2 mM solución; Invitrogen sondas moleculares) en 10 ml de completar F-12K . </li><li> Retire el papel de todas las muestras y añadir 600 l de la solución diluida de Hoechst para cada muestra. Incubar las muestras a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 minutos. </li><li> Lávese las muestras tres veces con 600 l de completar F-12K. </li><li> Incubar las muestras a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 minutos para permitir que fluoróforo no incorporadas a difundir fuera de las células. </li><li> Después de 30 minutos, cambiar los medios de comunicación en las muestras de células SNAP-una vez más y proceder a la imagen. </li><li> Imagen de las células utilizando un microscopio Zeiss Axiovert 200M ApoTome fluorescentes. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A continuación sealgunos resultados representativos de las imágenes fluorescentes por microscopía fluorescente estándar de vida COS-7 en células que expresan etiqueta SNAP-fusiones. Esta primera imagen muestra en vivo COS-7 células que expresan pSNAP-H2B (nuclear histonas) marcado con SNAP-celular TMR-Star. La construcción pSNAP-H2B se ha generado mediante la pSNAP-tag (m) del vector. Las células se marcaron con SNAP-celular TMR-Star durante 30 minutos y contrastados con Hoechst 33342 (azul) de los núcleos. La fluorescencia de color rosa muestra la superposición de fluorescencia de color rojo donde la proteína histona está presente, además de la fluorescencia azul que indica el núcleo. La expresión de la proteína H-2B es clara y fácilmente identificables. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figuras 2 y 3. Estas dos imágenes siguientes show en vivo células COS-7 transfectadas transitoriamente con pSNAP-ADRβ2. Las células fueron marcadas con SNAP-celular TMR-Star (rojo) y de contraste con Hoechst 33342 (azul). La construcción pSNAP-ADRβ2 se ha generado mediante la pSNAP-tag (m) del vector. Las células se marcaron con SNAP-celular TMR-Star durante 30 minutos y contrastados con Hoechst 33342 (azul) de los núcleos. La fluorescencia de color rojo indica la presencia de ADRB2 de la superficie celular receptor de la proteína de fluorescencia azul, mientras que identifica el núcleo.

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

Los autores son empleados de New England Biolabs que produce los reactivos y los instrumentos utilizados en este artículo.

Hay algunas variables que afectan los resultados observados, tales como la intensidad del láser se centran, las capacidades del equipo, la lente utilizada, etc fotoestabilidad del fluoróforo determina la rapidez con la fluorescencia debe ser capturado antes de desaparecer. Este método de etiquetado de proteínas es muy versátil y útil para muchas aplicaciones. Tecnologías de la etiqueta de SNAP-y CLIP etiquetas para el etiquetado específico de proteínas de fusión con sondas sintéticas permiten diversos aspectos de la función de las proteínas, incluyendo una variedad de procesos dinámicos en células vivas y en lisados ​​celulares. SNAP-, CLIP-, MCP y ACP-tag tecnologías proporcionan una versatilidad sencillez y extraordinaria a la imagen de las proteínas en células vivas y fijos y al estudio de las proteínas in vitro. La creación de una única construcción génica produce una proteína de fusión etiquetados capaz de formar un enlace covalente a una variedad de grupos funcionales, incluyendo fluoróforos, biotina, o de granos. La proteína de interés debe ser clonado y expresado una sola vez y después de la fusión se puede utilizar con una variedad de sustratos fluorescentes para numerosas aplicaciones posteriores, como el etiquetado de proteínas simultáneamente dentro de células vivas, localización de la proteína y el traslado, el pulso-caza experimentos, estudios de internalización del receptor , el etiquetado selectivo de la superficie celular, proteínas desplegable ensayos, la detección de proteínas en SDS-PAGE, citometría de flujo, de alto rendimiento de los ensayos de unión en placas de microtitulación, experimentos biosensor interacción, y FRET basado en ensayos de unión.

<table><tbody><tr><td>Células CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>F-12K sin suero</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos con cámaras de cubreobjetos de borosilicato #1.5 Lab-Tek II</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>Lote: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342, trihidrocloruro, trihidrato (solución 10 mg/ml en agua, solución 16,2 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente Zeiss Apotome Axiovert 200M</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plásmido control pSNAP-ADBR2</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plásmido control pSNAP-H2B</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

marcaje fluorescente de cos-7 expresando etiqueta snap-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-etiqueta y una etiqueta CLIP-los sistemas de etiquetado de proteínas permiten la conexión específico, covalente de moléculas, incluyendo tintes fluorescentes, con una proteína de interés en las células vivas. Estos sistemas ofrecen una amplia gama de sustratos fluorescentes optimizado para una amplia gama de instrumentos de imagen. Una vez clonado y expresado, la proteína marcada se puede utilizar con una variedad de sustratos para numerosas aplicaciones posteriores sin tener que clonar otra vez. Hay dos pasos para usar este sistema: la clonación y expresión de la proteína de interés como una fusión SNAP-etiqueta, y el etiquetado de la fusión con el sustrato SNAP-etiqueta de la elección. El SNAP-tag es una pequeña proteína humana sobre la base de O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-DNA-alquiltransferasa (hAGT), una proteína de reparación del ADN. Etiqueta de SNAP-etiquetas son tintes conjugados con guanina o cloropirimidina grupos salientes a través de un conector de bencilo. En la reacción de marcaje, el grupo bencilo sustituido del sustrato se une covalentemente a la SNAP-etiqueta. CLIP-etiqueta es una versión modificada de la SNAP-tag, diseñado para reaccionar con benzylcytosine en lugar de derivados bencilguanina. Cuando se utiliza junto con SNAP-tag, CLIP-etiqueta permite el etiquetado ortogonales y complementaria de dos proteínas simultáneamente en las mismas celdas.

SNAP-etiqueta y una etiqueta CLIP-los sistemas de etiquetado de proteínas permiten la conexión específico, covalente de moléculas, incluyendo tintes fluorescentes, con una proteína de interés en las células vivas. Una vez clonado y expresado, la proteína marcada se puede utilizar con una variedad de sustratos para numerosas aplicaciones posteriores sin tener que clonar otra vez.

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

Los sistemas de marcaje de proteínas SNAP-tag y CLIP-tag permiten la unión covalente y específica de moléculas, incluidos colorantes fluorescentes, a una proteína de interés...

Etiqueta SNAP y etiqueta clip. Los sistemas de marcado de proteínas permiten la unión covalente específica de prácticamente cualquier molécula a una proteína de interés. El gen de interés puede clonarse en el vector en cualquiera de los dos extremos de la etiqueta; la expresión del gen clonado da lugar a una proteína de fusión con la etiqueta SNAP.El sustrato de la etiqueta SNAP consta de dos partes: el benzo guin, que es reconocido por la etiqueta SNAP, y el grupo funcional. El grupo funcional puede ser biotina, una perla o un grupo fluorescente, disponibles en una variedad de colores. Durante la reacción de marcado, el grupo benzo sustituido se une covalentemente a la etiqueta SNAP, liberando guanina. Si un Fluora cuatro está acoplado a la proteína deseada, la etiqueta fluoresce, permitiendo la visualización de la proteína en células vivas o fijadas.Hola, soy Chris Provost de New England Bile Labs. Hoy les mostraremos un procedimiento para la imagen fluorescente de células COS siete vivas que expresan proteínas de fusión con etiqueta Snap. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la localización de proteínas en las células.Así que comencemos. Para preparar las células COS-7 para la transfección, retiren las células con tripsina según los protocolos estándar y añadan de 50 a 100 microlitros de células a seis mililitros de medio DMEM completo. Mezclen la suspensión celular pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Luego, distribuyan alícuotas de 300 microlitros de la suspensión celular tratada con tripsina en cada pocillo de una placa estéril de ocho cámaras (Lab-Tek de dos cámaras con cubreobjetos). Incuben las muestras a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente,Verifique la densidad y salud celular en las cámaras de cultivo celular. Etiquete el número apropiado de tubos microfuga para las mezclas de complejos de transfección. En un flujo laminar.Prepare las mezclas de complejos de transfección para cada reacción. Utilice 0,3 microgramos de ADN plasmídico de fusión snap diluidos en medio sin suero y un microlitro. Los plásmidos de control de los reactivos de transfección TPAs D dos y TPAs v están disponibles para evaluar la eficacia de los reactivos de transfección.También recomendamos incluir una muestra transfectada simulada y/o una muestra no resecada como controles negativos para cada mezcla compleja. Primero, mezcle el DMEM libre de suero con el ADN plasmático adecuado. Luego agregue el reactivo de transfección TPAs D dos, seguido del reactivo de transfección TPAs v.Mezcle bien los componentes pipeteando suavemente varias veces hacia arriba y hacia abajo después de la adición de cada reactivo e incube las reacciones a temperatura ambiente durante 30 minutos. Durante la incubación, lave las células una vez con 600 microlitros de DMEM completo y agregue 450 microlitros de DMEM completo a cada muestra. Cuando finalice la incubación, agregue lentamente, gota a gota, 50 microlitros de la mezcla del complejo de transfección a cada muestra. Incube las muestras durante la noche a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono.Al día siguiente, las células coste transfectadas se pueden marcar con el sustrato Snap Cell TMR Star para comenzar este procedimiento: añada 50 microlitros de DMSO al sustrato Snap Cell TMR Star y mezcle pipeteando arriba y abajo o mediante vortex durante un minuto. A continuación, retire cuidadosamente el medio de los complejos de transfección de cada muestra mediante succión al vacío y lave las células dos veces con 600 microlitros de DMEM completo.Luego, reemplace el medio en cada pocillo con 600 microlitros de DMEM completo. Devuelva las muestras al incubador. Mezcle el medio de etiquetado D añadiendo 995 microlitros de DMEM completo y cinco microlitros de 0,6 milimolar.Pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces el sustrato Snap Cell TMR STAR para mezclarlo después de añadir el sustrato. La concentración final de Snap Cell TMR STAR debe ser de tres micromoles. Retire cuidadosamente el medio de crecimiento de las muestras y añada 200 microlitros de medio de etiquetado DIA a cada pocillo. Incube las muestras a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono durante 30 minutos. En este paso, el grupo bencilo del sustrato TMR se unirá covalentemente a la etiqueta Snap y liberará cuen mientras las muestras están en incubación.Prepare una solución de HX para la tinción nuclear de muestras. Mezcle un microlitro de Trihidrocloruro de HSED 3 33 42 TRI en 10 mililitros de DMEM completo cuando finalice la incubación. Retire el medio de marcado de todas las muestras y añada 600 microlitros de la solución diluida de HX a cada muestra.Incube las muestras a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono durante cinco minutos. Después de cinco minutos, retire la solución diluida con gancho de cada muestra y lave las muestras tres veces con 600 microlitros de DMEM completo. Después del lavado final, agregue 600 microlitros de DMEM completo a cada muestra.Incube las muestras a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono durante 30 minutos adicionales para permitir que el Fluor no incorporado difunda fuera de las células, lo cual es necesario para la marcación intracelular. Después de 30 minutos, reemplace el medio en las muestras de células snap por última vez con 600 microlitros de DMEM completo. Las células ya están listas para su observación mediante un microscopio fluorescente Zeis AOME vert 200 M.A continuación se muestran algunos resultados representativos de imágenes fluorescentes obtenidas mediante microscopía fluorescente convencional de células CO siete vivas que expresan fusiones con etiquetas. Esta primera imagen muestra células COS siete vivas que expresan PNAP H dos B marcado con SNAP-Cell TMR Star. La construcción de PNAP H dos B se generó utilizando el vector PNAP TAG M.Las células fueron marcadas con Snap Cell TMR Star durante 30 minutos y contramarcadas con Hoechst 33342 para los núcleos. La fluorescencia rosa demuestra la superposición de la fluorescencia roja donde está presente la proteína histona. Además de la fluorescencia azul que indica el núcleo, la expresión de la proteína H2B se identifica de forma clara y sencilla.Estas dos imágenes siguientes muestran células coste siete vivas transfectadas transitoriamente con pnap. Unas células ADR beta dos fueron marcadas con snap cell, tmr, star, y contrasteadas con HUX 3 33 42. El constructo pnap ADR beta dos fue generado utilizando el vector PNAP TAG M.Las células fueron marcadas con Snap Cell TMR Star durante 30 minutos y contramanchadas con Hoechst 33342 para los núcleos. La fluorescencia roja indica la presencia del receptor de superficie celular proteína A DR beta dos, mientras que la fluorescencia azul identifica el núcleo. Acabamos de mostrarle cómo realizar imágenes fluorescentes de células vivas de cough seven que expresan proteínas de fusión con etiqueta Snap.Al realizar este procedimiento, es importante recordar agregar el complejo de transfección lentamente y gota a gota, y almacenar el sustrato de la etiqueta rápida a menos 20 grados Celsius en la oscuridad cuando no esté en uso. Eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.

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