Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Aquí se describe un protocolo básico de la imagen y cuantificar el tiempo mitótico de las células de mamíferos viven de cultivo de tejidos después de la transfección de siRNA.

Los cambios en la organización celular y la dinámica cromosómica que ocurren durante la mitosis están estrechamente coordinados para garantizar una herencia precisa del contenido genómico y celular. En este artículo de video, se muestra un método para rastrear eventos distintivos de la mitosis. El movimiento de los cromosomas se monitoriza cada célula utilizando líneas celulares que expresan proteínas marcadas con fluorescencia.

La transfección con irna se dirige contra las proteínas mitóticas, lo que da lugar a cambios en el ciclo celular que pueden visualizarse mediante imágenes de lapso de tiempo y cuantificarse mediante análisis de imágenes. Hola, soy Douglas Mackey, del laboratorio de Katie Oman en el Instituto Oncológico Huntsman de la Universidad de Utah. Hoy le mostraremos un procedimiento para obtener imágenes de células vivas a medida que avanzan a través de la mitosis después de la transfección de SIA.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cualquier efecto que la interrupción de las proteínas de interés pueda tener en el momento de la progresión mitótica. Así que comencemos. Prepare un cubreobjetos de dos cámaras de tecnología de laboratorio de cuatro paredes añadiendo 0,5 mililitros de fibronectina a cada uno.

Incubar bien durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare los complejos de irna y ARN labial max para la transfección inversa. De acuerdo con las instrucciones del fabricante para cada cámara, use la cantidad recomendada para un pocillo de un plato de 24 pocillos.

Después de 15 minutos, retire la fibronectina de los pocillos del cubreobjetos con cámara. Luego agregue 100 microlitros de complejos de irna a cada pocillo, alícuota 20, 000 células en 500 microlitros a cada uno. Bien coloque las células en la incubadora durante 24 horas.

Al día siguiente, reemplace la mezcla de transfección con un mililitro de medio de cultivo celular regular, luego incube las células 24 horas adicionales antes de la adquisición de la imagen. La configuración de adquisición de imágenes consiste en una incubadora de células personalizada que se coloca en la platina de un microscopio invertido, que se controla mediante un software de adquisición de imágenes. Para prepararse para la adquisición de imágenes, asegúrese de que la incubadora esté prevenida y equilibrada.

A continuación, abra la tapa de la incubadora y coloque las celdas con la tapa de la cámara puesta en el adaptador. Use una pequeña cantidad de arcilla para modelar para mantenerlo en su lugar. Cierre la tapa y coloque toda la incubadora en la platina del microscopio asegurándose de que la incubadora esté firmemente en su lugar.

A continuación, usando metamorph, configure el experimento seleccionando adquisición multidimensional de aplicaciones en la barra de menú del software. Esto abrirá una ventana en la que se pueden seleccionar los parámetros de imagen. Especifique dónde guardar los archivos de datos.

A continuación, seleccione las longitudes de onda de campo claro y m cherry utilizando el objetivo de contraste de fase seca de cuatro TX, concéntrese en un campo de células utilizando el software, ajuste la función de enfoque automático solo para el canal de campo claro. Esto permitirá que el software se enfoque automáticamente en cada posición de la etapa antes de cada adquisición. Para la primera longitud de onda, capture una imagen Con una exposición de 50 milisegundos, ajuste el tiempo de exposición al mínimo requerido para ver una buena imagen.

Es esencial limitar la cantidad de exposición a la luz para garantizar la viabilidad sostenida de la célula. Como regla general, esto se puede lograr mejor utilizando un filtro de densidad neutra y un tiempo de exposición de la cámara más largo. En lugar de aumentar la intensidad de la iluminación.

Repita este procedimiento para cualquier longitud de onda adicional. A continuación, ajuste el tiempo de exposición para cada canal. A continuación, designe un intervalo de lapso de tiempo de 15 minutos durante ocho horas en 15 posiciones de etapa.

Si se desea una mejor resolución temporal, acorte el intervalo de tiempo entre adquisiciones. Recuerde que cuanto más posiciones de escenario se utilicen, más tiempo se tardará en adquirir. En cada intervalo de tiempo, seleccione y marque un número apropiado de posiciones de etapa para muestrear adecuadamente la población de células.

Metamor registrará las posiciones y regresará a la ubicación designada para cada adquisición. Después de la exposición de la longitud de onda de lapso de tiempo, se ha designado la información de posición de tiempo y etapa. Seleccione el botón de vista previa en la pantalla para confirmar que el software está controlando el equipo correctamente.

Después de asegurarse de que el sistema está funcionando, seleccione el botón Adquirir en la pantalla para comenzar la adquisición. Observe la automatización a través de al menos una ronda completa de adquisición para asegurarse de que todo funcione correctamente. Luego siéntese y deje que la computadora y el microscopio hagan el trabajo.

Para revisar los datos, seleccione aplicaciones, revise los datos multidimensionales en la barra de menús, seleccione la vista de ubicación del archivo y, a continuación, seleccione una posición de escenario. Haga clic en cargar imágenes para revisar la pila de imágenes desde esa posición. Una vez cargadas las imágenes, utilice el ratón para avanzar por los datos fotograma a fotograma.

Aquí se generan películas de células mitóticas usando metamorfosis. Para hacer una película en Metamorph, seleccione apilar, hacer película. En la barra de menús, seleccione los fotogramas que desea utilizar según la velocidad y el tipo de archivo de la película.

A continuación, seleccione Guardar para realizar un montaje. Primero, guarde los datos como un archivo STK de puntos en metamorph. A continuación, abra la imagen J Abra el archivo stk de punto s en la imagen J y recorte una región de interés marcando la región y seleccionando recorte de imagen en la barra de menú.

A continuación, seleccione pilas de imágenes. Hacer montaje Especificar qué fotogramas incluir el tamaño y la forma del montaje. Y si se desea entre los bordes del marco.

A continuación, pulsa OK. Guarde el montaje como un archivo tiff de puntos. Finalmente, calcule el tiempo en cada etapa de la mitosis, designando el marco en el que el primer signo de condensación del ADN o redondeo celular es evidente, ya que T es igual a cero profase.

La prometafase termina cuando los cromosomas se alinean en el ecuador, la metafase continuará hasta que el ADN comience a segregar la telofase anafásica. Y finalmente, sigue la citocinesis y las células comienzan a aplanarse. Imágenes de lapso de tiempo de células hiliares expresando su piedra.

Se muestra H dos BCFP. Estas células fueron transfectadas con irna de control y progresan normalmente a través del ciclo celular. En comparación, las células que fueron transfectadas con siRNAs dirigidos contra el poring nuclear NUP 1 53 desplazan alteraciones graves en la progresión del MIT.

Acabamos de mostrarle cómo configurar, ejecutar y analizar un experimento de imágenes de lapso de tiempo para determinar el tiempo de la progresión mitótica de las células después de una transfección. Al realizar este procedimiento, es importante ser lo más amable posible con las células, manteniendo la temperatura y las concentraciones de CO2 adecuadas y limitando la cantidad de luz a la que están expuestas las células. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.