Name: Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende a realizar imágenes de lapso de tiempo de mitosis en células de mamífero tras transfección de siRNA. Este protocolo permite cuantificar la dinámica del ciclo celular y el progreso mitótico en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Americana del Cáncer (PF-07-103-01-CSM), los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM61275 y CA042014 P30), la Sociedad de Leucemia y Linfoma, y ​​la Fundación de Cáncer Huntsman.

siRNA transfección y la preparación de células <ol><li> Prepare un 4-así Labtek II cubre objetos de cámara mediante la adición de 0,5 ml de fibronectina (10μg/mL) a cada pozo que se utilizará. Incubar durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Prepare siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) de los complejos de transfección invertir de acuerdo a las instrucciones del fabricante s. Use la cantidad recomendada para un bien de un plato de 24 pozos en cada cámara para ser utilizado (100μL total). Un producto análogo / protocolo de transfección de siRNA puede ser sustituido. </li><li> Retire la fibronectina de los pozos de la cámara cubre objetos. Añadir 100μL de siRNA / Lipofectamine complejos RNAiMAX a cada uno, así que se utilizará. </li><li> Alícuota de 20.000 histona H2B-mCherry células que expresan (en 500μL) por pocillo que contiene la mezcla de transfección. </li><li> Permitir que las células se incuba durante ~ 24 horas antes de volver a la mezcla de transfección con 1 ml de medio de cultivo celular normal. </li><li> Incubar las células de un adicional de 24 horas antes de la adquisición de la imagen (48 horas después de la transfección). </li></ol> Microscopio de instalación y adquisición de imágenes <ol start="7"><li> Hay tres partes principales en la configuración de la adquisición de imágenes: 1) una célula de la incubadora que cabe en la platina del microscopio y mantiene un ambiente húmedo constante de 37 º C y 5% de CO 2, 2) un microscopio invertido equipado con una etapa automática, persianas automatizadas de fluorescencia y campo claro, y las ruedas de filtros automáticos, y 3) un paquete de software que integra y controla la etapa, persianas, y las ruedas de filtros. En nuestra configuración de imagen, se utiliza una medida de células incubadora de OKO de laboratorio que se pueden utilizar con la cámara Labtek II cubre objetos. La etapa, persianas, y las ruedas de filtros son controlados por el software Metamorph Sugerencia:. El Laboratorio de OKO etapa superior del sistema incubadora incluye adaptadores para una variedad de diferentes placas, plato, o el tamaño de cubreobjetos. </li><li> La posición de la cámara Labtek II cubre objetos en la incubadora por la apertura de la tapa de la pre-calentado y equilibrado incubadora, colocar el cubre cámara en el adaptador, y manteniendo en su lugar con plastilina. Deje la tapa de la cámara cubre objetos para que el medio de cultivo celular no se seque. Cierre la tapa y la posición de la totalidad de la incubadora en la platina del microscopio, lo que garantiza que la incubadora se mantiene firmemente en su lugar. </li><li> Utilizando Metamorph, configurar la prueba mediante la opción &quot;Aplicaciones / Adquisición multidimensionales&quot; en la barra de menús del software. Con ello se abre una ventana en la que puede seleccionar la frecuencia y duración de la intervalo, el tiempo de exposición para cada color (si se hacen ajustes múltiples), el número y ubicación de las posiciones de la etapa, y el número de z-secciones (si ) deseado. . Seleccionar dónde guardar los archivos de datos Sugerencia: Si se utiliza otro software de Metamorph, las funciones pueden variar ligeramente, pero el concepto general es el mismo. Micromanager, una fuente abierta ImageJ software basado en la adquisición, que es compatible con la mayoría de configuraciones de hardware, es una excelente alternativa. </li><li> . A los efectos de este protocolo, vamos a adquirir imágenes en dos longitudes de onda (claro y mCherry) cada 15 minutos durante 8 horas a 15 posiciones de escena Sugerencia: Si mejor el tiempo de resolución es deseado, entonces se puede acortar el intervalo de tiempo entre la adquisición, sin embargo , menos puestos de fase se puede utilizar, y por lo tanto menor cantidad de células mitóticas estará disponible para su análisis. Es importante cuando se consideran los intervalos de tiempo para tener en cuenta el tiempo necesario para que la rueda de filtros para cambiar entre los conjuntos de filtros. </li><li> Determinar el tiempo de exposición óptimo para cada longitud de onda, en primer lugar se centra en un campo de las células utilizando iluminación campo claro. En el software, ajustar la función de enfoque automático sólo para el canal de campo claro (esto permitirá que el software para el enfoque automático en cada posición antes de cada etapa de la adquisición) Sugerencia:. Utilizamos un 40x seco de contraste de fase objetivo de dar una excelente resolución, sin necesidad de aceite . Otros objetivos pueden ser utilizados en función de la resolución óptica deseada. </li><li> Cambiar a la longitud de onda mCherry y complemento de una imagen mediante una exposición de 50 ms. Ajustar el tiempo de exposición al mínimo necesario para ver una buena imagen. Es esencial para limitar la cantidad de exposición a la luz para asegurar la viabilidad celular sostenido. Como regla general, esto puede lograrse mejor mediante el uso de un filtro de densidad neutral (para reducir el flujo de luz de excitación) y un tiempo de exposición de la cámara ya no por el aumento de la fuerza de la iluminación. Repita este procedimiento para cualquier longitud de onda adicional que se utilizará Sugerencia:. Para determinar la viabilidad a largo plazo de células en una exposición dada por su experiencia, usted puede ver el número total de imágenes que una célula pueda sobrevivir en el timelapse deseado mediante una adaptación provisional de la separación punto de tiempo de minutos a segundos (es decir, 10 min. se convierte en 10 segundos). Si las células sobrevivir 100-200 exposures (o el número apropiado), entonces la exposición está muy bien. Si no es así, reducir su luz de excitación, el tiempo de exposición, o el número total de imágenes para simular el experimento completo. </li><li> A continuación, seleccionar y marcar un número adecuado de puestos de fase de modo que usted pueda lograr un muestreo adecuado de la población de células. Metamorph registrará las posiciones y volverá allí para cada adquisición Sugerencia:. Yo generalmente tratar de encontrar posiciones en las que hay un montón de células de la imagen, pero no tantos que son demasiado densos. Además, es importante seleccionar posiciones lo suficiente para que usted tendrá una buena oportunidad de observar un gran número de células progresando a través de la mitosis. </li><li> Después de todo intervalo, el tiempo de exposición de longitud de onda, y la posición de la etapa se han registrado, seleccione el botón &quot;Preview&quot; en la pantalla para determinar si el software está controlando el equipo adecuado. </li><li> Una vez que esté satisfecho, seleccione la opción &quot;Adquirir&quot; botón en la pantalla para comenzar la adquisición. A continuación, sentarse y dejar el ordenador y el microscopio para hacer el trabajo Sugerencia:. Observar la automatización a través de al menos una ronda completa de adquisición para asegurarse de que todo funciona correctamente. </li></ol> Procesamiento de imágenes y análisis <ol start="16"><li> Después de la adquisición ha terminado, el siguiente paso es transferir los datos de imagen en una forma que es más fácil de manejar. A los efectos de este protocolo, primero voy a demostrar cómo generar películas con Metamorph, entonces cómo generar montajes de imágenes utilizando el programa ImageJ. Ya sea en formato será útil para propósitos de cuantificación. </li><li> El primer paso es revisar los datos. Para ello, seleccione &quot;Aplicaciones / Revisión de datos multidimensionales&quot; en la barra de menú. Seleccione la ubicación de sus archivos, a continuación, seleccione &quot;Ver&quot;. Esto le permitirá revisar la pila de imágenes de cada posición de la etapa de forma individual. Seleccione la posición de la etapa deseada, y luego &quot;Cargar imágenes&quot;. Usted será capaz de avanzar a través de los datos de cuadro por cuadro. </li><li> Para los puestos de fase en la que las células pasan por mitosis (según lo determinado por el ADN y la morfología celular), puede hacer que las películas y montajes utilizando Metamorph, o con otros programas como ImageJ (disponible de forma gratuita a través de los NIH). </li><li> Para hacer una película en Metamorph, seleccione &quot;Proceso / Guardar película&quot; en la barra de menú. Usted será capaz de seleccionar los cuadros de uso, velocidad y tipo de archivo de la película. A continuación, seleccione &quot;Guardar película&quot;. </li><li> Para hacer un montaje, ahorro de la pila de la imagen como un archivo. STK, que puede ser utilizado en otros programas como ImageJ. </li><li> Abra el archivo en ImageJ y avanzar en los marcos hasta que encuentre una célula pasa por mitosis. . Recortar el área alrededor de la celda y seleccione &quot;Imagen / Duplicar&quot; Sugerencia: Asegúrese de que duplicar todos los fotogramas. </li><li> Para hacer un montaje, seleccione &quot;Imagen / pilas / Hacer montaje&quot; en la barra de menú. Aquí puede especificar los fotogramas que desee incluir, el tamaño y la forma del montaje, y si desea que las fronteras entre los cuadros. Seleccione estas y pulse &quot;Aceptar&quot;. .. Guarde el montaje como un archivo tif y no cualquier otro tratamiento o ImageJ o Adobe Photoshop Consejo: cambia los archivos de montaje desde el formato de 16-bit utilizada por Metamorph en formato de 8-bits de procesamiento de imágenes más fácil. </li><li> Para calcular el tiempo en las diferentes fases de la mitosis, determinar t = 0 (primer signo de la condensación del ADN o el redondeo de células), cuente el número de fotogramas hasta que los cromosomas se alinean en el ecuador (el tiempo en la profase / prometafase), marcos hasta que los cromosomas comienzan a segregar (tiempo en la metafase), y los marcos hasta que las células comienzan a aplanarse (anafase / telofase / citocinesis). El tiempo calculado en cada etapa de mitosis depende del intervalo de tiempo entre cada fotograma. </li></ol> Resultados representante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /></a> La Figura 1 ilustra los resultados de un experimento de transfección de control típico de siRNA utilizando una línea celular HeLa que expresan la histona H2B-mCherry. Este método ha sido utilizado de manera efectiva para cuantificar el tiempo mitótico, revelando un inesperado papel para el nucleoporin Nup153 en el momento de finales de la mitosis 1.

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li>
<li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li>
<li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li>
<li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC%2FC%28Cdc20%29+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li>
<li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li>
<li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li>
<li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li>
<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

Con los últimos avances en imagen y tecnología de la proteína fluorescente, imágenes en vivo se ha convertido en un aspecto rutinario de análisis celular 2. Una variedad de buenas prácticas agrarias (y otras variantes de color 3)-etiquetados proteínas están ampliamente disponibles y relativamente fácil de construir y se puede utilizar para rastrear una serie de características, incluyendo la dinámica de división celular del ADN / cromosoma 4, 5, 6 centrosoma la duplicación, la dinámica de la ciclina B 7, desglose envoltura nuclear y 8 de montaje, 9, 10 la formación del huso mitótico, y las distintas etapas de la citocinesis 11. Proteínas etiquetadas se pueden utilizar solos o en combinación, cuando los espectros de excitación / emisión de etiquetas fluorescentes son compatibles, lo que permite la coordinación entre los eventos específicos que deben evaluarse. Si mayor resolución espacial y / o temporal es / son deseados, la microscopía confocal de barrido láser de exploración si, disco giratorio, o la resonancia se puede utilizar, y la lista de opciones sofisticadas de microscopía cada vez con mayor resolución sigue creciendo. Imágenes en vivo de la mitosis en células de mamíferos también ha sido adaptado para su uso en alto rendimiento y pantallas de RNAi pequeña molécula 12-14. Así, mientras que los experimentos iniciales s un uso de esta técnica puede ser relativamente simple, las posibilidades de construir en esta estrategia son extensos.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Cubrebocados con cámaras Lab Tek II (4 pocillos)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>Hay disponibles tamaños adicionales de cámaras</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora para microscopio</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>Se puede usar cualquier cámara adecuada</td></tr><tr><td>Microscopio invertido de fluorescencia automatizado</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Se puede usar cualquier microscopio adecuado</td></tr><tr><td>Paquete de software</td><td>Metamorph</td><td></td><td>Se puede usar cualquier software adecuado</td></tr></tbody></table>

time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de sirna

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Cambios en la organización celular y la dinámica de los cromosomas que ocurren durante la mitosis están estrechamente coordinadas para garantizar la herencia exacta del contenido genómico y celular. Hallmark eventos de la mitosis, como el movimiento de los cromosomas, pueden ser fácilmente seguidos en forma de células individuales con time-lapse microscopía de fluorescencia de las líneas de células de mamíferos que expresen proteínas GFP-etiquetados. En combinación con RNAi basado en el agotamiento, esto puede ser un poderoso método para localizar la etapa (s) de la mitosis, donde los defectos se producen después de los niveles de una proteína en particular se han reducido. En este protocolo, se presenta un método básico para evaluar el efecto del agotamiento de una proteína de regulación potencial mitótico en el momento de la mitosis. Las células son transfectadas con siRNA, colocado en una cámara de incubación etapa superior, y la imagen usando un microscopio de fluorescencia automatizado. Se describe cómo utilizar el software para crear una experiencia de lapso de tiempo, la forma de procesar las secuencias de imágenes para que sea imagen fija o montajes de películas, y la forma de cuantificar y analizar el calendario de las etapas de mitosis con una línea celular que expresa mCherry- etiquetados histona H2B. Finalmente, se discuten aspectos importantes para el diseño de un experimento de time-lapse. Esta estrategia se complementa con otros enfoques y ofrece las ventajas de 1) la sensibilidad a los cambios en la cinética de que no pueda ser observado cuando se mira en las células como la población y el análisis de 2) de la mitosis sin la necesidad de sincronizar el ciclo celular utilizando tratamientos farmacológicos. La información visual de los experimentos de imagen, no sólo se permite la sub-etapas de la mitosis a ser evaluados, pero también puede dar una idea inesperada que no se desprende del análisis del ciclo celular por FACS.

Aquí se describe un protocolo básico de la imagen y cuantificar el tiempo mitótico de las células de mamíferos viven de cultivo de tejidos después de la transfección de siRNA.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Los cambios en la organización celular y en la dinámica cromosómica que ocurren durante la mitosis están estrechamente coordinados para garantizar la herencia precisa del genoma y...

Los cambios en la organización celular y la dinámica cromosómica que ocurren durante la mitosis están estrechamente coordinados para garantizar la herencia precisa del contenido genómico y celular. En este artículo en video, se muestra un método para rastrear los eventos característicos de la mitosis. El movimiento cromosómico se monitorea a nivel individual de célula utilizando líneas celulares que expresan proteínas marcadas con fluorescencia.La transfección con irna dirigida contra proteínas mitóticas provoca cambios en el ciclo celular que pueden visualizarse mediante imágenes de lapso de tiempo y cuantificarse mediante análisis de imágenes. Hola, soy Douglas Mackey del laboratorio de Katie Oman en el Instituto de Cáncer Huntsman de la Universidad de Utah. Hoy les mostraremos un procedimiento para obtener imágenes de células vivas mientras avanzan a través de la mitosis tras la transfección con SIA.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cualquier efecto que la alteración de las proteínas de interés pueda tener sobre el momento de la progresión mitótica. Comencemos. Prepare una cubreobjetos de laboratorio con cuatro paredes y dos cámaras agregando 0,5 mililitros de fibronectina a cada una.Incubar bien durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, preparar complejos de irna y lip RNAI max para transfección inversa. Según las instrucciones del fabricante para cada cámara, usar la cantidad recomendada para un pocillo de una placa de 24 pocillos.Después de 15 minutos, retire la fibronectina de los pocillos del portaobjeto con cámaras. A continuación, añada 100 microlitros de complejos de irna a cada pocillo y alícuota 20.000 células en 500 microlitros en cada uno. Coloque las células en el incubador durante 24 horas.Al día siguiente, sustituya la mezcla de transfección por un mililitro de medio de cultivo celular regular, luego incube las células durante 24 horas adicionales antes de la adquisición de imágenes. El sistema de adquisición de imágenes consta de un incubador celular personalizado que se coloca sobre la platina de un microscopio invertido, el cual está controlado por un software de adquisición de imágenes. Para prepararse para la adquisición de imágenes, asegúrese de que el incubador esté precalentado y equilibrado.A continuación, abra la tapa del incubador y coloque las células con la tapa de la cámara dentro del adaptador. Utilice una pequeña cantidad de arcilla de modelar para mantenerla en su lugar. Cierre la tapa y coloque todo el incubador sobre la platina del microscopio, asegurándose de que el incubador quede firmemente colocado.A continuación, utilizando Metamorph, configure el experimento seleccionando la adquisición multidimensional de aplicaciones en la barra de menú del software. Esto abrirá una ventana en la que se pueden seleccionar los parámetros de adquisición de imágenes. Especifique dónde guardar los archivos de datos.Luego, seleccione las longitudes de onda de campo claro y mCherry utilizando el objetivo seco de contraste de fases TX 40x, enfoque un campo de células usando el software y ajuste la función de autoenfoque solo para el canal de campo claro. Esto permitirá que el software realice el autoenfoque en cada posición del escenario antes de cada adquisición. Para la primera longitud de onda, capture una imagen usando un tiempo de exposición de 50 milisegundos y ajuste el tiempo de exposición al mínimo necesario para obtener una buena imagen.Es esencial limitar la cantidad de exposición a la luz para garantizar la viabilidad celular sostenida. Como regla general, esto se puede lograr mejor utilizando un filtro de densidad neutra y un tiempo de exposición de la cámara más largo, en lugar de aumentar la intensidad de la iluminación.Repita este procedimiento para cualquier longitud de onda adicional. Luego, establezca el tiempo de exposición para cada canal. A continuación, designe un intervalo de lapso de tiempo de 15 minutos durante ocho horas en 15 posiciones del portaobjetos.Si se desea una mejor resolución temporal, acorte el intervalo de tiempo entre adquisiciones. Recuerde que cuantas más posiciones del escenario se utilicen, más tiempo tomará la adquisición. En cada intervalo de tiempo, seleccione y marque un número adecuado de posiciones del escenario para muestrear adecuadamente la población celular.Metamor registrará las posiciones y regresará al lugar designado para cada adquisición. Después de establecer la exposición por lapsos de tiempo y la longitud de onda, así como el tiempo y la información de la posición del escenario. Seleccione el botón de vista previa en la pantalla para confirmar que el software está controlando adecuadamente el equipo.Después de asegurarse de que el sistema está funcionando, seleccione el botón de adquisición en la pantalla para comenzar la adquisición. Observe la automatización durante al menos una ronda completa de adquisición para garantizar que todo esté funcionando correctamente. Luego, relájese y permita que la computadora y el microscopio realicen el trabajo.Para revisar los datos, seleccione aplicaciones, revise los datos multidimensionales en la barra de menú, seleccione la vista de ubicación del estadio y luego elija una posición del estadio. Haga clic en cargar imágenes para revisar la pila de imágenes provenientes de esa posición. Una vez que las imágenes se hayan cargado, utilice el ratón para avanzar a través de los datos cuadro por cuadro.Aquí se generan películas de células mitóticas utilizando Metamorph. Para crear una película en Metamorph, seleccione la opción de pila para hacer una película. En la barra de menú, seleccione qué cuadros utilizar, la velocidad y el tipo de archivo de la película.Luego, seleccione guardar para crear un montaje. Primero, guarde los datos como un archivo STK de puntos en Metamorph. A continuación, abra ImageJ, abra el archivo STK de puntos en ImageJ y recorte una región de interés marcando la región y seleccionando imagen recortar en la barra de menú.Luego seleccione pilas de imágenes. Cree un mosaico especificando qué fotogramas incluir, el tamaño y la forma del mosaico, y si se desean bordes entre los fotogramas.Luego, haga clic en aceptar. Guarde el montaje como un archivo TIFF. Finalmente, calcule el tiempo en cada fase de la mitosis, designando el cuadro en el que sea evidente el primer signo de condensación del ADN o redondeo celular como T igual a cero en profase.La prometafase termina cuando los cromosomas se alinean en el ecuador; luego prosigue la metafase hasta que el ADN comienza a segregarse en la anafase y telofase. Finalmente, sigue la citocinesis y las células comienzan a aplanarse. Imágenes de lapso de tiempo de células hilar que expresan his stone.Se muestra H2BCFP. Estas células fueron transfectadas con ARNi de control y progresan normalmente a través del ciclo celular. En comparación, las células que fueron transfectadas con siARN dirigidos contra la nucleoporina NUP153 presentan alteraciones severas en la progresión de la MIT.Acabamos de mostrarle cómo configurar, realizar y analizar un experimento de imágenes de lapso de tiempo para determinar el momento de la progresión mitótica de células tras una transfección con ARNi. Al realizar este procedimiento, es importante tratar a las células con la mayor suavidad posible, manteniendo la temperatura adecuada y las concentraciones de CO₂, así como limitando la cantidad de luz a la que se exponen las células. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

FRET basada en los periodistas están cada vez más utilizado para monitorear las actividades de quinasa y fosfatasa en las células vivas. Aquí se describe un método sobre el uso de FRET basada en la prensa para evaluar el ciclo celular dependiente de los cambios en la fosforilación de destino.

Seguimiento de las actividades de quinasa y fosfatasa través del ciclo celular por Proporcional FRET

Fuente: Daniele, F., et. al TIRFM y sondas GFP sensibles al pH para evaluar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma SH-SY5Y: imágenes celulares y análisis de datos. J. vis. exp. (2015). Este video muestra la obtención de imágenes de células de neuroblastoma humano utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas con fluoróforos. Las células se enfocan primero en modo de...

Obtención de imágenes celulares mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total

La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Aquí, presentamos el seguimiento en tiempo real de la migración de la célula en un ensayo de cicatrización utilizando células epiteliales de mama MCF10A TIP60-agotado. La aplicación de técnicas de imagen de células vivas en nuestro protocolo nos permite analizar y visualizar sola célula movimiento en tiempo real y a través del tiempo.

Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

El protocolo describe el etiquetado específico de nucleoides mitocondriales con una mancha de gel de ADN disponible comercialmente, la adquisición de la serie time lapse de células etiquetadas en vivo mediante microscopía de iluminación estructurada de superresor resolución (SR-SIM) y el seguimiento automático del movimiento nucleoide.

Etiquetado específico de nucleoides mitocondriales para microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

Este protocolo ilustra un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en la cromatina.  Se demuestra la formación del cuerpo nuclear de la leucemia promielocítica (LMP) en telómeros con dimerizadores químicos. El crecimiento, la disolución, la localización y la composición de las gotas se controlan con imágenes de células vivas, inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH).

Condensados de proteínas inducidas por dimerización química en telómeros

Este protocolo presenta un nuevo sistema de genes reporteros y la configuración experimental para detectar la transcripción en roturas de doble cadena de ADN con sensibilidad de molécula única.

Imágenes de células vivas de la actividad transcripcional en roturas de doble cadena de ADN

La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.

Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende a realizar imágenes de lapso de tiempo de mitosis en células de mamífero tras transfección de siRNA. Este protocolo permite cuantificar la dinámica del ciclo celular y el progreso mitótico en tiempo real.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

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