Name: Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Aprende a preparar secciones plásticas de cinco micras de embriones de Xenopus laevis para inmunofluorescencia de alta resolución. Este método preserva la morfología tisular verdadera y mejora los resultados de inmunohistoquímica.

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Fijación <ol><li> La transferencia de embriones enteros o disecados en explantes MEMFA o 3,7% FA + PBS en un frasco de cristal de centelleo pequeño (gato Fisher # 03-339-25B). Incubar vial en el nutator a temperatura ambiente, sólo durante 2 horas, y no más que eso. No deje que el embrión en el FA por más de 2 horas. Ya de incubación en el FA hará que el tejido embrionario más difícil y el resultado de una pobre penetración de anticuerpos en el proceso de detección. </li><li> Aspirar la mayor parte de FA y añadir el fijador de Dent hasta la parte superior del vial (~ 4.5ml). Invierta suavemente el vial durante un par de veces para lavar los embriones en Dent, el intercambio con otros 4.5ml de la Dent fresca, y se incuba en -20 º C durante al menos 48 horas. Durante la noche no es suficiente. Con este paso, los embriones más permeable para el anticuerpo. Los embriones pueden mantenerse en este estado durante varias semanas. </li></ol> Inmunofluorescencia <ol><li> Rehidratar la muestra. Incubar en una serie gradual de metanol, de la siguiente manera: <table style="width: 171px; height: 119px;" border="0" cellpadding="3"><tbody><tr><td> 75% MeOH / H 2 O </td><td> 10 minutos </td></tr><tr><td> 50% MeOH / PBS </td><td> 10 minutos </td></tr><tr><td> 25% MeOH / PBS </td><td> 10 minutos </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10 minutos </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10 minutos </td></tr></tbody></table> </li><li> Hacer agarosa al 1,5% / PBS con placas de 60 mm platos de plástico. Vierta la PBS en la parte superior de la agarosa después de que se ha convertido en sólidos. </li><li> Hemi-sección de los embriones: Poner a los embriones en un 1,5% de agarosa / PBS plato. Coge un embrión con un par de pinzas y cortar por la mitad a través del centro del embrión utilizando una hoja de afeitar delgada. Elegir los que ya ha reducido a la mitad con un plano de corte recto. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_3/188_figure-01.jpg" alt="Figura 1" width="591" height="193" /> </li><li> La transferencia de los embriones atravesada en un vial de centelleo de vidrio con PBT. Intercambio con 4.5ml del 20% de suero de cabra + PBT. Se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas en un nutator (bloqueo). </li><li> Preparar una dilución apropiada de anticuerpo primario en PBT. 0,5 ml de esta muestra por que se necesita. Por ejemplo, he utilizado una dilución 1 / 200 de conejo anti-C-cadherina pab para estudiar la localización subcelular de la C-cadherina en las secciones de 5 mm de plástico. </li><li> Aspirar la solución de bloqueo y añadir 0,5 ml del anticuerpo primario diluido. Ponga los frascos en posición de stand-up en un soporte de tubo de espuma de poliestireno. Incubar toda la noche a 4 º C en un nutator. </li><li> Eliminar el anticuerpo primario diluido (este anticuerpo primario diluido se pueden guardar y volver a utilizar en los próximos 1-2 semanas). Lavar con 4.5ml de PBT de 4 veces (40-60 minutos) a temperatura ambiente. </li><li> Intercambio con 0,5 ml de la dilución 1 / 100 de biotina-anticuerpo secundario conjugado en PBT. Incubar toda la noche a 4 º C en un nutator. Cubrir los frascos con papel de aluminio para proteger la biotina de la luz. </li><li> Desde este punto, se debe tener cuidado para proteger la muestra de la luz, es decir, mantener los viales bajo alguna cobertura o papel de aluminio. </li><li> Remover los anticuerpos con biotina secundaria (esto también se puede reutilizar en los próximos 1-2 semanas). Lavar con 4.5ml o de PBT de 4 veces (40-60 minutos) a temperatura ambiente. </li><li> Intercambio con 0,5 ml de 1 / 200 de dilución de fluorescencia con etiqueta (FITC, Texas-rojo, etc) estreptavidina en PBT. Incubar toda la noche a 4 º C en un nutator. </li><li> Retire la estreptavidina (este puede ser reutilizado, también). Lavar con 4.5ml de PBT para 3 veces (15 - 30 minutos cada uno) a temperatura ambiente. </li><li> Fijar los embriones en 4.5ml de FA del 3,7% + PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar con 4.5ml de PBS dos veces. </li><li> Deshidratar la muestra. Incubar en una serie gradual de etanol, de la siguiente manera: <table style="width: 172px; height: 80px;" border="0"><tbody><tr><td> 30% de EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 50% de EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 75% de EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> EtOH al 100% </td><td> 10 min </td></tr></tbody></table> </li><li> La muestra se puede almacenar en EtOH 100% a 4 º C con una cubierta para protegerlo de la luz. </li></ol> Infiltración <ol><li> Hacer Technovit 7100 mezcla de infiltración. Yo normalmente me echo 15 ml de líquido de base en un tubo de 50 ml Erlenmeyer y añadir 150 mg de catalizador que se mezcla y, colocándola en un nutator durante 15 minutos. Esta mezcla de infiltración pueden mantenerse a 4 ° C durante un máximo de un mes. </li><li> Se infiltran en la muestra con la mezcla de infiltración a través del intercambio con una serie gradual de la infiltración Technovit mezcla / EtOH combo, de la siguiente manera: <ol><li> 50% Technovit / EtOH - 1 hora </li><li> 100% Technovit - 1 hora </li><li> 100% Technovit - durante la noche </li></ol></li><li> El specimen se pueden almacenar en la mezcla de infiltración al 100% para un máximo de un mes a 4 º C. Colocar una tapa sobre las muestras para protegerlo de la luz. </li></ol> Incrustación <ol><li> Hacer Technovit 7100 mezcla incrustación: Tome 0.75ml de la mezcla de infiltración en un tubo de 1.5 ml y añadir 50 ml de endurecedor II. Se mezcla por momentos invirtiendo el tubo varias. </li><li> Con una pipeta de transferencia de plástico, tomar una muestra infiltrado durante la noche en 0,5 ml delgada pared del tubo de PCR. Eliminar la mayor parte del sobrenadante. </li><li> Añadir 0,25 ml de la mezcla de la incrustación en el paso # 1 de esta sección, &quot;Incorporación&quot;, a la muestra. Orientar el embrión dividido en dos para hacer el plano de disección se enfrenta a la parte inferior del tubo, empujando suavemente con una aguja de punta redondeada, la disección (de madera de mango aguja de disección). </li><li> Cierre la tapa e incubar el tubo en un lugar oscuro durante aproximadamente cuatro horas para permitir que el plástico se polimerizan. </li><li> Hacer Technovit 3040 mezcla. Tomar 1 gramo de polvo en un plato de pesaje, y añadir 0,5 ml del líquido. Inmediatamente, mezcla de polvo y líquido con un bluetip. Vierta en la parte superior de la spacimen endurecido. Este amarillo Technovit 3040 impedirá que el bloque de plástico, desde la que sale del tubo. </li></ol> Seccionamiento <ol><li> Limpie Histoknife H con xileno (EtOH a menudo no es lo suficientemente bueno) y lo puso en el microtomo. Ángulo de la hoja a unos 45 °. Limpie el área del escenario en frente de la cuchilla con xileno, también, porque la limpieza de esta área es fundamental para la calidad de los cortes seccionados. </li><li> Corte el extremo del tubo y la cáscara de la punta fuera con un cuchillo de cartón. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_5/188_figure-02.jpg" alt="Figura 2" width="818" height="243" /> </li><li> Establecer la muestra en el soporte de sujeción del microtomo. </li><li> Adjuntar un &quot;press-a-seal&quot; aislante de silicio en un portaobjetos de vidrio para hacer una cámara de montaje de cortes de sección. Presione firmemente el aislante de la diapositiva en la mesa de trabajo limpia y mira desde el otro lado para asegurarse de que el aislante está bien conectado, sin burbujas de aire. Vierta limpio y cálido dH 2 O (~ 40 ° C) a la piscina en la diapositiva con una pipeta Pasteur, hasta el nivel donde se puede observar que la superficie del agua se vuelve plano, cóncavo o convexo, no en forma. </li><li> Empezar a hacer cortes de sección. Para los estudios de inmunofluorescencia, hago 5 rebanadas mm de sección. En las muestras de hibridación in situ, el grosor de las rodajas puede ser ajustado en el rango de ~ 3-8 mm, dependiendo del propósito y la intensidad de las señales. </li><li> Llevar a las rodajas de sección de la etapa por delante de la hoja a la cámara de montaje con agua, usando una brocha pequeña. Sujete la brocha con una rodaja en la parte superior de la piscina de agua y colocar el trozo hasta el agua golpeando con una aguja de punta redondeada, la disección. El corte se extenderá en forma circular tan pronto como se llega a la superficie del agua. </li><li> Cuando la mayoría de la superficie del agua de la cámara de montaje está lleno de rebanadas de sección, absorben casi la mitad del agua con una pipeta Pasteur. Incubar el portaobjetos en una noche caliente de diapositivas para que la muestra esté completamente seco. </li><li> Tinción de contraste con 1 ml de DAPI (0.1mg/ml en TE) durante cinco minutos. Aspirar DAPI y seco de la muestra. </li><li> Quitar el aislante de goma de silicona de la diapositiva. Ahora se pueden tomar fotografías de la muestra. Conservar la muestra a 4 ° C, protegido de la luz. </li></ol>

Primaria de anticuerpos contra el antígeno o epítopo etiquetas: Hacer una dilución adecuada en PBT. Conjugado con biotina anticuerpo secundario: varios fabricantes venden conjugado con biotina anticuerpos.

plástico inclusión y corte de xenopus laevis embriones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Perfiles de plástico para mantener la morfología real del tejido en secciones finas de tejido que puede ser immunostained con anticuerpos fluorescentes secundaria, lo que hace este método más útil que las secciones incluidas en parafina o congelado para muchos tipos de tejido. El método de tinción, la incorporación de plástico, y la sección se demuestra en este vídeo.

Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones

Hola, mi nombre es Sochi Ota. Soy científica posdoctoral en el laboratorio del Dr. Ken Cho, del Departamento de Biología del Desarrollo y Celular de la Universidad de California, Irvine. Hoy les mostraré la preparación de secciones simples de embrión de Xenopus.Este procedimiento incluye la bisectación de embriones de rana en etapa de gas tardía, la tinción con un anticuerpo contra la molécula de interés, la infiltración en plástico y la obtención de un corte plástico de cinco micrones de grosor. Este procedimiento puede utilizarse para estudiar inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o hibridación in situ con imágenes de resolución muy alta. Bien, esas son las pequeñas herramientas prácticas que utilizo para la sección plástica de embriones, para más de 10 embriones.Esta es una pinza metálica con punta en forma de delta y esta, número uno, puede utilizarse para orientar el embrión en el plástico. Y número dos, puede usarse junto con este pincel para transferir el embrión del micrótomo a la superficie de montaje. Este es un aislante de caucho de silicona, que coloco sobre la superficie del portaobjetos y que forma un menisco de agua donde puedo montar los cortes de embriones seccionados en plástico.Ahora estoy mostrando cómo bisecar el embrión, un embrión fijado para ensayos como hibridación in situ o detección por inmunofluorescencia. Para cortar el embrión por la mitad, utilizo esta parrilla de horno extremadamente delgada, que se puede comprar en la tienda de abarrotes. Creo que sí, hay embriones fijados con fijador celular al 3,7 % de formaldehído durante toda la noche.Y eso depende del propósito. Esto se fija durante la noche. Con fines de hibridación por incisión, puede realizarse una fijación durante la noche, pero para la detección mediante inmunofluorescencia, en la que se detectan proteínas dentro del embrión, no recomiendo una fijación demasiado prolongada.Y prefiero realizar la fijación con paraformaldehído al 3,7 % durante solo dos horas para minimizar la influencia sobre la localización subcelular de la proteína y también evitar una fijación excesiva, lo que permitirá una buena penetración del anticuerpo durante la etapa de detección. Bien, ahora estoy diseccionando este embrión mediante cortes en la pared blastodérmica del lado izquierdo y derecho. Ahora veo que se trata de un embrión en estadio 11, en el que el primordio ovárico (PO) se extiende desde el lado dorsal hasta el lado ventral, pero en un embrión bi a.Y examinemos esta pieza del lado derecho. Se observa la explosión po tanto en el lado dorsal como en el lado ventral, pero en el lado dorsal es más evidente porque esta invaginación penetra claramente hasta lo más profundo del embrión, en comparación con el lado ventral. Por lo tanto, esta es una buena pieza, bien seccionada, para estudiar ambos lados, dorsal y ventral.En el interior del embrión, en este embrión diseccionado, voy a utilizar la detección por inmunofluorescencia de proteínas expresadas dentro del embrión. Y para la inmunofluorescencia o inmunohistoquímica, se emplea un anticuerpo específico para la detección. Pero el problema es que el anticuerpo no penetra muy bien en el interior del embrión.Por lo tanto, si utiliza embriones enteros montados, no puede saberlo. No puede estudiar el patrón de expresión de sus proteínas en el embrión. Pero utilizando este embrión previamente bisecado, puede estudiar cuál es el patrón de expresión en la célula profundamente dentro del embrión.Ah, el embrión teñido ya ha sido fijado en formaldehído al 3,7 %, deshidratado en etanol e infiltrado en el plástico, denominado techno 7, 100. Este kit contiene tres componentes: esta parte líquida principal y este polvo, llamado endurecedor uno. Y este líquido llamado endurecedor dos.Primero mezclo esta parte principal y el endurecedor en una proporción de 100 a 1, lo que dará como resultado esta mezcla de infiltración. Y eso es un líquido, al cual voy a infiltrar este embrión. Y esto aún está líquido, por lo que aún no se endurecerá.Y así es como estas muestras de embrión se dejan en esta mezcla de infiltración durante la noche para asegurar que las muestras de embrión queden completamente incluidas en este plástico. Ahora tomo una de las muestras de embrión con una pipeta de transferencia y la transfiero a un tubo delgado de 0,5 MPCL, que utilizo como molde de inclusión. Luego, elimino el líquido sobrante de este embrión.Y ahora este embrión, este embrión ya está listo para ser incluido en el plástico de endurecimiento. Para preparar el plástico de endurecimiento, se mezcla esta mezcla de infiltración con este tubo de endurecedor en una proporción de 15 a 1. Por ejemplo, si tomo 750 microlitros de esta mezcla de infiltración en un tubo, entonces debo agregar también 50 microlitros de este endurecedor para iniciar la polimerización del plástico; después de agregarlo, ups, cierro la tapa y luego mezclo suavemente así.Y no debe hacer vórtice porque el oxígeno es el inhibidor de la reacción de polimerización. Añada aproximadamente 250 microlitros de esta mezcla al embrión. Y este paso de polimerización tarda casi cuatro horas, por lo que no debe apresurarse en absoluto.Después de agregar primero este plástico polimerizante, puede manipularlo hacia arriba y hacia abajo para hacer que el embrión flote en el plástico. Ahora tomo esta pinza de metal para mover el embrión y orientarlo de modo que la superficie de corte del embrión quede en la parte inferior de este molde de inclusión. Luego cierre la tapa porque el oxígeno es un inhibidor de la reacción de curado y déjelo durante cuatro horas para permitir la reacción de polimerización.Después de eso, esto es una unidad de visualización (HUD) ya moldeada en la muestra. Se aplica un tipo de pegamento sobre esta muestra para asegurarse de que la parte dura de plástico no se salga de este molde. Esto es, esto es otro plástico que funciona como pegamento para este propósito, llamado techno 30 40.Y estoy mezclando este polvo y este líquido con 2, 2, 1; aquí hay 0,6 gramos de este polvo. Así que voy a añadir 300 microlitros de este líquido, luego mezclarlo rápidamente, ya que este plástico se endurece bastante rápido. Por lo tanto, en esta parte, debes presionar un poco antes de verterlo sobre esta muestra ya endurecida.Esto es suficientemente bueno. Cierre la tapa. Yo tengo este aspecto.Y esto tardará aproximadamente de 30 a 60 minutos en endurecerse. Y esta es la que está lista para usarse. Primero, corto la punta del molde con un cúter, y retiro esta parte de la punta del molde.Así que ahora este embrión embebido queda expuesto. También corto esta tapa porque no la necesito. Ahora tomo esta hoja de tain Roy, es decir, no la aguja sino la hoja de tain Roy, que es más dura que la hoja de acero habitual utilizada para el corte de secciones de parafina.Sumerjo brevemente esto en Xin para limpiarlo. Colóquelo en el portacuchillas y elimine el exceso de zaine. A veces también limpio esta zona con zaine, ya que la limpieza de esta área es absolutamente importante.Ahora está listo para el corte en secciones. Antes de comenzar el corte, preparo la cámara de montaje. Esto es un portaobjetos.Y encima de esto, coloco esta goma de silicona e introduzco y presiono cuidadosamente por todos lados para que no haya ninguna fuga. Coloque esto en el calentador de portaobjetos y vierta agua destilada limpia para formar nuestra piscina. Añada tanta agua como sea necesario hasta alcanzar la superficie de agua inundada.Y esto es importante porque esta superficie de agua de inundación proporciona una distribución uniforme de la tensión superficial del agua, lo cual es fundamental para que la sección se extienda de manera homogénea. Ahora voy a realizar el corte, pero antes de hacerlo uso esta mascarilla porque cada trozo de la sección es tan ligero, tan liviano, que mi aliento podría desplazarla del platino. Por eso uso esta mascarilla.Y ahora comience con la sección. Después de obtener cierta cantidad de trozos de sección sobre la platina, tómela con un pincel y muévala lentamente hacia la parte superior de esta cámara de montaña; luego golpee ligeramente el pincel para que los trozos caigan al agua por gravedad. Tan pronto como toquen el agua, se extenderán formando un trozo circular sobre la superficie del agua.¿Cómo está esa luz después del secado nocturno? Ahora luce así y así. Ahora la muestra está lista para entrar en contacto con DPI para el ADN nuclear.Luego puede estudiar la muestra bajo el microscopio. Hoy les he mostrado la preparación de secciones plásticas utilizando embriones de rana en etapa de gas tardía. Este procedimiento es muy útil para estudiar subcélulas o la localización de proteínas, aspectos que no pueden analizarse mediante la técnica de inclusión en parafina, y también es útil en general para hibridaciones in situ.Esta sección plástica también le proporciona incluso hibridación residual; este procedimiento puede ofrecerle un nivel mucho más alto de esa imagen que la muestra de sección parenquimatosa o congelada.

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Investigación

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Biología

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