Plástico inclusión y corte de Xenopus laevis embriones

Perfiles de plástico para mantener la morfología real del tejido en secciones finas de tejido que puede ser immunostained con anticuerpos fluorescentes secundaria, lo que hace este método más útil que las secciones incluidas en parafina o congelado para muchos tipos de tejido. El método de tinción, la incorporación de plástico, y la sección se demuestra en este vídeo.

Hola, mi nombre es Sochi ota. Soy científico postdoctoral en el laboratorio del Dr. Ken Cho en el Departamento de Biología Celular y del Desarrollo de la Universidad de California. Irv I Hoy, les mostraré la preparación de la sección simple del embrión de xenopus.

Este procedimiento incluye la bisección del embrión de rana en etapa gaseosa tardía teñido con anticuerpos contra la molécula de interés, infiltrarse en el plástico y hacer una sección de plástico de cinco micras iguales. Este procedimiento se puede utilizar para estudiar la inmunofluorescencia, la inmunohistoquímica o la hibridación in situ con imágenes de muy alta resolución. Bien, esas son las pequeñas herramientas útiles que utilizo para la sección plástica de embriones de más de 10 embriones.

Se trata de una pinza metálica con punta delta y esta, la número uno, se puede utilizar para orientar el embrión en plástico. Y número dos, esto se puede usar junto con este pincel para transferir el embrión del micrótomo a la superficie de montaje. Se trata de un aislante de caucho de silicona, que pongo en la superficie del portaobjetos y que hace un tirón de agua donde puedo montar las rodajas de embriones seccionados en plástico.

Ahora estoy mostrando cómo dividir el embrión, el embrión fijo para el ensayo como la hibridación de sustitutos o la detección de inmunofluorescencia. Y para cortar la mitad del embrión, utilizo esta rejilla desértica muy ultrafina, que puedes comprar en el supermercado. Creo que sí, hay embriones fijos que fijan la célula 3.7%formal alto de la noche a la mañana.

Y esa es la forma en que lo arreglas depende del propósito. Esto se arregla de la noche a la mañana. Con el propósito de la hibridación por incisión, se puede optar por la fijación nocturna, pero para la detección de inmunofluorescencia, que detecta la proteína dentro del embrión, no recomiendo una fijación demasiado larga.

Y prefiero hacer la fijación de la altura de la forma al 3,7% durante solo dos horas para minimizar la influencia en la localización subcelular de la proteína y también evitar la sobrefijación para permitir la buena penetración del anticuerpo durante el paso de detección. Bien, ahora estoy diseccionando este embrión a través de la pared de la explosión, cortando el lado izquierdo y el lado derecho. Así que ahora veo que este tiene un embrión en etapa 11 donde el PO está todo el camino desde el lado dorsal hasta el lado ventral, pero bi un embrión.

Y echemos un vistazo a esta pieza de la mano derecha. Se ve el blast po tanto en el lado dorsal como en el lado ventral, pero el lado dorsal es obvio porque esta invaginación está llegando claramente a lo más profundo del embrión en comparación con el lado ventral. Así que esta es una buena pieza, una buena pieza dividida para estudiar tanto el lado dorsal como el ventral.

Dentro del embrión, este embrión disecado, voy a utilizar la inmunofluorescencia para la detección de proteínas expresadas en el interior del embrión. Y para la inmunofluorescencia o la inmunohistoquímica, se utiliza un anticuerpo específico para la detección. Pero el problema es que los anticuerpos no penetran muy bien en el interior del embrión.

Por lo tanto, si usas un embrión de montura entera, no puedes saberlo. No se puede estudiar el patrón de expresión de las proteínas en el embrión. Pero usando este embrión pre bisectado, se puede estudiar cuál es el patrón de expresión en la célula en el interior profundo del embrión.

Ah, el embrión manchado ya se ha fijado en formaldehído al 3,7% deshidratado en etanol e infiltrado en el plástico, que se llama techno 7, 100. Y este kit contiene tres partes, que es esta parte principal líquida y este polvo, que se llama endurecedor uno. Y este líquido llamado endurecedor dos.

Primero mezclo esta parte principal y endurezco uno con 100 a uno reio, que te va a dar esta mezcla de infiltración. Y eso es lo que es, que es un líquido, al que se me ha infiltrado este embrión. Y esto todavía es líquido, por lo que aún no se va a endurecer.

Y esto es que las muestras de embriones se dejan en esta mezcla de infiltración durante las noches para asegurarse de que la muestra de embriones se resuma completamente en este plástico. Ahora tomo este embrión de muestra con pipeta de transferencia y lo transfiero a un tubo de pared delgada de 0,5 MPCL, que utilizo como molde de inclusión. Luego, de este embrión elimino el exceso de líquido.

Y ahora este embrión, este embrión ya está listo para ser incrustado en el plástico endurecido. Para hacer el plástico endurecedor, mezcla esta mezcla de infiltración con este tubo endurecido a 15 a uno. Entonces, por ejemplo, si tomo 750 microlitros de esta mezcla de infiltración para apuntalar el tubo, entonces se supone que también debo agregar 50 microlitros de este endurecedor para iniciar la polimerización del plástico después de agregarlo, ups, cierre la tapa y luego mezcle suavemente así.

Y no se debe hacer vórtice porque el oxígeno es el inhibidor de la reacción de polimerización. Añade aproximadamente 250 microlitros de esta mezcla al embrión. Y este paso de polimerización dura casi cuatro horas que deberías, no tienes que darte prisa en absoluto.

Después de agregar primero este plástico polimerizante, puede canalizarlo hacia arriba y hacia abajo para hacer que el embrión flote en el plástico. Y ahora tomo esta pinza de metal para empujar alrededor del embrión para orientarlo de modo que la superficie de corte del embrión llegue al fondo de este molde de inclusión. Luego cierre la tapa porque el oxígeno es un inhibidor de la reacción de curado y déjelo durante cuatro horas para permitir la reacción.

Después de eso, este es un HUD que ya está en la muestra. Pones una especie de pegamento a esta muestra para asegurarte de que esta parte dura de plástico no se salga de este molde. Este es otro plástico que funciona como pegamento para este propósito llamado techno 30 40.

Y estoy mezclando este polvo y líquido con 2, 2, 1 aquí hay 0,6 gramos de este polvo. Así que voy a agregar 300 microlitros de este líquido, luego lo mezclaré rápidamente y este plástico se endurece bastante rápido. Así que esta es una parte, tienes que ser un poco duro y luego verter esto en esta muestra ya escuchada.

Esto es suficiente. Cierre la tapa. Me veo así.

Y esto tardará aproximadamente de 30 a 60 minutos en endurecerse. Y este es el que está listo para la acción. Primero, corto la punta del molde con un cuchillo de cartón, despego esta parte de la punta de este molde.

Así que ahora este embrión incrustado está expuesto. Y también corté esta tapa porque no la necesito. Ahora tomo esta aguja de Tain Roy, quiero decir que no es la aguja de la cuchilla de Roy, que es más dura que la cuchilla de tinte normal que se usa para el corte de parin.

Sumerjo brevemente esto en Xin para limpiarlo. Ajústelo al soporte de la cuchilla y limpie el exceso de zaine. Y a veces limpio esta área con zaine también porque la limpieza de esta área es absolutamente importante.

Ahora está listo para el seccionamiento. Antes de comenzar a seccionar, configuré la cámara de montaje. Así que esto es vidrio deslizante.

Y encima de esto, estoy colocando este caucho de silicona y empujando el empuje del agricultor todo el camino para que no haya, no haya ninguna fuga. Y pon esto en el calentador de toboganes y vierte esta agua limpia para hacer nuestra piscina. Y poner tanto agua como sea para que llegue hasta que llegue a la superficie de agua superficial de la inundación.

Y esto es importante porque esta superficie de agua de inundación proporciona una distribución igual de la tensión superficial del agua, lo cual es importante para que la sección se extienda por igual. Ahora estoy seccionando, pero antes de hacer eso me pongo esta mascarilla porque cada pieza de sección es tan ligera, tan ligera y mi, mi pecho puede volar fuera del escenario. Así que me pongo esta mascarilla.

Y ahora empieza a seccionar. Después de que consigas un número de piezas de sección en el escenario, tomas esto con un pincel y te mueves lentamente en la cima de esta cámara de montaña y golpeas este pincel para que esas piezas entren en el agua por gravedad. Y tan pronto como aterrizan en el agua, se extienden para formar una pieza circular en la superficie del agua.

¿Cómo es esa luz después de toda la noche seca? Ahora es mirar esto y esto. Ahora la muestra está lista para entrar en contacto con DPI para el ADN nuclear.

Y luego se puede estudiar bajo el microscopio. Hoy os he mostrado la preparación de la sección de plástico utilizando embrión de rana en fase gaseosa tardía. Este procedimiento es muy útil para estudiar la localización de subcélulas o proteínas, que no se pueden estudiar mediante la técnica de inclusión de paren y también esto en general para incluso para la hibridación residual.

Esta sección de plástico también le da incluso para la hibridación residual, este procedimiento puede brindarle un nivel mucho más alto que la muestra de paren o sección congelada.