Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo
14 de julio de 2010
Una de las características de la enfermedad de Alzheimer es la elevación de Aß 1-42 Péptido. Aquí les ofrecemos un protocolo para la preparación de Aß sintético 1-42 Oligómeros, lo cual afecta el hipocampo potenciación a largo plazo, un celular correlato de la memoria. Este procedimiento es útil para la investigación de los mecanismos de Aß inducida por detección de patología y de drogas.
El beta amiloide sintético 1-42 se resuspende en HFIP para primero modernizar el péptido y luego concentrarlo hasta formar una película para su ligamentización. La película se RESUSPENDE en DMSO, se diluye en tampón fosfato y se incuba durante la noche. Finalmente, el péptido oligomérico se diluye con tampón de registro y se perfunde sobre cortes hipocampales agudos, donde se evalúa la exposición efectiva del beta amiloide sobre la plasticidad sináptica.
Bienvenido al laboratorio de Avio Orio en la Universidad de Columbia en la ciudad de Nueva York. Hola, hoy les mostraremos un procedimiento que hemos optimizado para la preparación de todo el beta amiloide Li Rise, el cual se basa en un protocolo propuesto originalmente por Stein y colegas en 2003. En este laboratorio, utilizamos este procedimiento para estudiar la disfunción sináptica inducida por el beta amiloide.
Así que comencemos. Deje que el vial de polvo liofilizado de beta amiloide alcance la temperatura ambiente durante 30 minutos para evitar la condensación cuando se abra bajo la campana extractora. Abra el vial y agregue HFIP frío con hielo para obtener una concentración final de beta amiloide de un milimolar.
Cierre el vial y mezcle mediante vortex; utilice rápidamente una jeringa Hamilton para dividir la solución equitativamente entre tres tubos de microcentrífuga de polipropileno de baja unión. Cierre los tubos e incube durante dos horas a temperatura ambiente para permitir que el péptido se mezcle. Abra los tubos y colóquelos en un evaporador de vacío (speed vac) para concentrar la solución. Gire a 800 G bajo vacío durante aproximadamente 15 minutos.
Asegúrese de que la temperatura no supere los 25 grados Celsius para evitar la degradación de proteínas. La centrifugación se considera finalizada cuando se observa una película clara y seca de péptido en el fondo del tubo. Puede ser difícil ver la película; selle los tubos y almacene las alícuotas no utilizadas a menos 80 grados Celsius durante hasta seis meses en la campana; use DMSO para resuspender la película de péptido hasta una concentración final de cinco milimolar; sonicar en baño de agua durante 10 minutos.
Para garantizar la suspensión completa del péptido, almacene alícuotas de 1,6 microlitros de la solución de beta amiloide cinco milimolar a menos 20 grados Celsius. Cada alícuota debe descongelarse solo una vez, el día anterior al experimento: descongele una alícuota de la solución de beta amiloide cinco milimolar y añada 98,4 microlitros de tampón fosfato estéril para obtener un volumen final de 100 microlitros, vortexee durante 30 segundos e incube a cuatro grados Celsius durante 12 horas. Para permitir que comience la ligamentización, incube lisado hipocampal fresco durante 90 minutos.
En el tampón de registro estándar, el electrodo estimulante se coloca sobre los colaterales de Shafer y el electrodo de registro se coloca sobre la capa radiada. Una vez que se ha encontrado una respuesta y la línea base es estable durante 10 minutos, diluya toda la ligadura beta amiloide hasta 200 nanomolares. Dado que la beta amiloide se une de forma no específica al vidrio en el tampón de registro, utilice plástico tanto como sea posible.
Perfusione la solución de beta amiloide sobre las secciones durante 20 minutos. Aplique su estimulación preferida de tipo X. Por ejemplo, una ráfaga theta inmediatamente después del tetanización, luego regrese al perfusión con tampón de registro normal.
Monitoree la grabación durante al menos dos horas posteriores al tetano para confirmar la inducción de la potenciación a largo plazo y observar los efectos del tratamiento con beta amiloide. Acabamos de mostrarle cómo preparar el beta amiloide oligomérico uno a 42 para inducir alteraciones en la plasticidad sináptica en cortes de hipocampo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que el exceso de secado de la película peptídica puede provocar una ligandización incompleta.
También es fundamental utilizar plásticos para las soluciones de beta amiloide para prevenir la unión peptídica no específica. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para preparar oligómeros sintéticos de Aβ 1-42, que se sabe que alteran la Potenciación a Largo Plazo del hipocampo, un mecanismo clave relacionado con la memoria. El procedimiento es esencial para estudiar la patología inducida por Aβ y para fines de cribado de fármacos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Investigación sobre la Enfermedad de Alzheimer
Antecedentes
- La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por niveles elevados del péptido Aβ 1-42.
- Los oligómeros de Aβ 1-42 están implicados en la disfunción sináptica.
- La potenciación a largo plazo (LTP) es un correlato celular de la memoria.
- Comprender los efectos de Aβ puede ayudar en el desarrollo de fármacos.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la síntesis de oligómeros de Aβ 1-42.
- Investigar los mecanismos del deterioro sináptico inducido por Aβ.
- Facilitar la selección de fármacos para posibles tratamientos del Alzheimer.
Métodos Utilizados
- Resuspensión de beta amiloide sintético en HFIP.
- Concentración del péptido en forma de película para ligamentización.
- Resuspensión en DMSO e incubación en tampón fosfato.
- Evaluación del efecto de la exposición a beta amiloide en cortes hipocampales agudos.
Resultados principales
- Los oligómeros de Aβ 1-42 preparados afectan eficazmente la plasticidad sináptica.
- El protocolo permite obtener resultados reproducibles en el estudio de la disfunción sináptica.
- Los hallazgos contribuyen a comprender el papel de Aβ en la patología del Alzheimer.
- Aplicaciones potenciales en cribado de fármacos para tratamientos del Alzheimer.
Conclusiones
- El protocolo para sintetizar oligómeros de Aβ 1-42 es eficaz y confiable.
- Este estudio mejora la comprensión del impacto de Aβ en procesos relacionados con la memoria.
- Las investigaciones futuras pueden basarse en estos hallazgos para explorar opciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El deterioro inducido por el β-amiloide oligomérico1-42 en la plasticidad sináptica del hipocampo proporciona un modelo sólido y relevante para la enfermedad en la investigación del Alzheimer en etapas iniciales. Este paradigma permite reducir el riesgo mecanicista y ofrece una mayor confianza predictiva en la validación de dianas y en la selección de compuestos frente a la disfunción sináptica. El enfoque apoya la clasificación de carteras al aclarar la relevancia traslacional de las intervenciones candidatas dirigidas a la patología inducida por amiloide.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la disfunción sináptica inducida por amiloide en un sistema controlado ex vivo.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la cuantificación del deterioro de la potenciación a largo plazo tras la exposición a β-amiloide oligomérico.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos en hipótesis sobre la enfermedad de Alzheimer a nivel sináptico.
- Proporciona una plataforma para obtener confianza predictiva en la evaluación de compuestos en fases iniciales.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Establece un ensayo reproducible para cuantificar el deterioro de la plasticidad sináptica en cortes de hipocampo.
- Normaliza la preparación y aplicación de β-amiloide oligomérico para obtener resultados de ensayo consistentes.
- Permite la evaluación confiable de compuestos candidatos según su capacidad para mitigar la alteración de la PTL.
- Facilita la escalabilidad y el reuso de la plataforma para iniciativas de cribado de alto rendimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con mecanismos relevantes para la enfermedad implicados en la patología temprana de Alzheimer.
- Proporciona continuidad desde el compromiso del blanco molecular hasta los resultados sinápticos funcionales.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de los efectos del compuesto con biomarcadores traslacionales de la salud sináptica.
- Apoya la selección y validación de modelos preclínicos para estudios posteriores in vivo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método conecta el descubrimiento inicial con la validación preclínica al permitir la comprobación de hipótesis, la reducción del riesgo asociado al blanco terapéutico y la evaluación cuantitativa de la función sináptica en respuesta a la exposición a amiloide.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la prueba de hipótesis nula sobre el deterioro sináptico inducido por amiloide y aclara las vías implicadas.
- Selección: Proporciona un ensayo estandarizado y reproducible para evaluar compuestos frente a la alteración de la potenciación a largo plazo (LTP).
- Analítica: Ofrece lecturas cuantitativas de la plasticidad sináptica para comparaciones estadísticas sólidas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos ex vivo con biomarcadores relevantes para la enfermedad y puntos finales preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo reutilizable para campañas continuas de validación de dianas y selección en carteras de neurodegeneración.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos terapéuticos para el Alzheimer.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad de los ensayos de deterioro sináptico.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción del desarrollo y la eficiencia del capital al centrarse en resultados funcionales relevantes para la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos contra la neurodegeneración.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de péptidos, preparación de cortes hipocampales y registro electrofisiológico.
- Exige acceso a instrumentación especializada para la medición de la potenciación a largo plazo (LTP) y sistemas de perfusión controlados.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos en la preparación de péptidos y en los protocolos de ensayo.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes sistemas modelo o clases de compuestos según sus propiedades de solubilidad y unión.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad en la agregación de péptidos y la sensibilidad a las condiciones experimentales.
