De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

El objetivo general del siguiente experimento consiste en activar mediante luz un agente sensible a la luz determinado, como un colorante fluorescente químicamente encapuchado, en un embrión vivo de pez cebra con resolución a nivel de una sola célula. Esto se logra inyectando un agente sensible a la luz en embriones de un solo estadio celular que expresan un marcador genético vital para localizar y dirigirse con precisión a cualquier célula de interés. Como segundo paso, los embriones se cultivan y montan en agarosa de punto de fusión bajo, lo que inmoviliza al embrión vivo.

A continuación, se utiliza la microscopía de dos fotones para localizar un marcador transgénico de fluorescencia visible. Luego, el agente sensible a la luz se activa en un plano focal deseado y se monitorea el grado de fotoactivación. Posteriormente, se puede rastrear el destino de las células marcadas resultantes en etapas embrionarias posteriores.

Este procedimiento puede utilizarse para la activación de una variedad de compuestos con resolución a nivel de una sola célula en especímenes vivos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la microscopía confocal o la lámpara de destello, es que permite la fotoactivación de tejidos relativamente profundos a un nivel axial de algunas micras con una fototoxicidad relativamente baja. Sin embargo, el método presentado aquí se utiliza para el trazado de bordes mediante selenio y puede aplicarse para la fotoactivación de una variedad de componentes, lo que permite un control dirigido sobre procesos de desarrollo y fisiológicos. La tarde anterior a la inyección, prepare tanques de apareamiento separando machos y hembras de un linaje transgénico que exprese un marcador fluorescente visible.

En este experimento, la línea transgénica expresa GFP bajo el control del promotor neurogénico N one. Derrita un alícuota de dextrano al 5 % conjugado con fluoresceína encageada en cloruro de potasio 0,2 molar sobre hielo. Diluya la fluoresceína encageada en cloruro de potasio 0,2 molar hasta una concentración final del 1 %. Mantenga la fluoresceína sobre hielo y protéjala de la luz. Permita que los cruces de pez cebra se reproduzcan, recoja los huevos fertilizados tan pronto como sean depositados y lávenlos según se describe en el texto. Utilice una pipeta de plástico para transferir embriones en estadio de una célula a una placa de inyección de agar al 1 % que haya sido cubierta con medio E tres fresco bajo un microscopio estereoscópico.

Utilice la pipeta para orientar los embriones en las ranuras de inyección. Rompa la punta de una aguja de inyección capilar que haya sido estirada hasta formar una punta larga y fina. Utilice una punta de microcargador para llenar la aguja por detrás con aproximadamente un microlitro de fluoresceína encageada al 1%.

Coloque la aguja cargada en un micromanipulador unido a un microinyector neumático. Inyecte a cada embrión de dos a tres nanolitros de fluoresceína enjaulada directamente en el citoplasma celular. Inyecte al menos 50 embriones por experimento.

Transferir los embriones inyectados a una placa de Petri que contenga medio E3 fresco e incubar en la oscuridad a 28,5 grados Celsius hasta la etapa de desarrollo deseada. Añadir feniltiourea al 0,1 % a los embriones a las 24 horas para inhibir la pigmentación y prepararlos para su montaje. Recubrir placas de Petri de 15 a 20 mm con una capa delgada de agar al 1 % disuelto en medio E2 fresco; cuando el agar se haya solidificado, llenar la placa con medio E2 bajo un microscopio estereoscópico.

Utilice pinzas finas para colocar los embriones inyectados en placas recubiertas. Evite exponer los embriones al aire. Mantenga una alícuota de agarosa al 2 % de punto de fusión baja en agua.

En un bloque térmico a 72 grados Celsius. Utilice una pipeta de vidrio pulida con fuego para transferir un embrión recubierto en aproximadamente 150 microlitros de medio a una placa de Petri de 60 milímetros. Coloque un volumen similar de Aros al 2% al lado del embrión y mezcle rápidamente las dos gotas para obtener una gota homogénea de Agros al 1%.

Oriente el embrión con su lado dorsal enfrentando el objetivo del microscopio. Permita que el aros se solidifique e introduzca el embrión embebido en medio E2. Coloque el embrión recién montado sobre un portaobjetos bajo un microscopio de dos fotones equipado con un láser de disco giratorio de banda ancha.

Antes de comenzar el proceso de activación fotónica, adquiera una serie de imágenes desde el borde más ventral hasta el dorsal del tejido que expresa, a 860 nanómetros y espacio. Las imágenes están separadas por seis micrómetros en el plano Z. Seleccione el plano Z objetivo para la activación fotónica y enfoque utilizando GFP como punto de referencia.

Localice la región de interés. Tome una sola imagen a 860 nanómetros y manténgala abierta en una ventana separada para una correcta alineación. Es fundamental que el láser a 720 nanómetros esté en un estado bloqueado por modo antes de abrir el menú de edición de blanqueo.

Utilice la imagen tomada a 860 nanómetros para definir la región de interés o ROI para la fotoactivación. En la ventana de edición de blanqueo, ajuste el número de iteraciones, la potencia relativa del láser y la velocidad de escaneo. Para la fotoactivación, presione blanqueo cuando el láser se haya detenido, cambie nuevamente a 860 nanómetros y adquiera una imagen de un solo plano para evaluar la intensidad del material fotoactivado resultante.

Recolecte un conjunto de imágenes para evaluar el zsan o espesor del dominio activado. De este modo, es posible determinar empíricamente la intensidad del láser y la duración de la exposición. Para una fotoactivación óptima de cada clon o cruce foto, active todos los embriones restantes para el experimento.

Utilizando estas condiciones, eleve los embriones fotoactivados montados en la oscuridad a 28.5 grados Celsius en medio E2 que contenga 0,1 % de fenil tiourea hasta que alcancen la etapa de desarrollo deseada. Bajo un microscopio estereoscópico, use un escalpelo puntiagudo para hacer una muesca en forma de V en la arós cerca del embrión montado, con la punta de la muesca orientada hacia la cabeza del embrión. Coloque un par de pinzas cerradas en el vértice de la muesca.

Abrir suavemente la pinza separando los aros a lo largo del embrión y liberar el embrión en el medio. Después de liberar cada embrión, utilizar una pipeta Pasteur pulida al fuego para recogerlo en un tubo microcentrífugo. En una campana extractora de gases, fijar los embriones con formaldehído al 4% durante tres horas.

A temperatura ambiente, continúe con la deshidratación, la rehidratación y la tinción con fosfatasa alcalina conjugada antifluoresceína, y todos los lavados asociados según se describe en el texto adjunto. Añada 500 microlitros de solución filtrada de rojo rápido a los embriones. Incube a oscuras a temperatura ambiente, reponiendo con nueva solución de tinción de rojo rápido cada hora hasta alcanzar la relación señal/fondo deseada.

Detenga la reacción de tinción con tres lavados en PBST de cinco minutos cada uno. En la campana extractora, fije la tinción en formaldehído al 4% durante 20 minutos. Lave dos veces en PBST durante cinco minutos cada vez.

Lave los embriones transparentes mediante una serie de gradientes de glicerol al 25%, 50% y 75% en PBS hasta que cada embrión se asiente en el fondo del tubo. Almacene los embriones a cuatro grados Celsius hasta que estén listos para su visualización en el microscopio. Para montar los embriones para su visualización, utilice una jeringa de un mililitro para aplicar cuatro gotas de 20 microlitros de grasa de silicona transparente sobre una placa de microscopio, colocadas en las esquinas de un cuadrado de 15 milímetros de lado.

Coloque un embrión en aproximadamente 200 microlitros de glicerol al 75% entre las gotas de grasa. Coloque un cubreobjetos sobre el embrión. Presione suavemente el cubreobjetos directamente hacia abajo hasta que la solución de glicerol lo llene.

El espacio entre las gotas de grasa donde se colocan los embriones puede almacenarse durante unos días a cuatro grados Celsius antes de visualizarlos mediante microscopía confocal. Esta imagen muestra un embrión de pez cebra vivo que expresa GFP bajo el control del promotor neurogen. Un embrión en el estadio de una sola célula fue inyectado con un trazador de fluoresceína enjaulada, y se observó en el estadio de tres a cinco somitas.

Se activó mediante láser de dos fotones una zona específica de los cuatro primordios cerebrales, y se pudo detectar el trazador fluorescente de fluoresceína liberado. Posteriormente al procedimiento de activación fotoquímica, el embrión se incubó a 28,5 grados Celsius, y las células cerebrales que contenían la fluoresceína liberada se rastrearon mediante inmunotinción anti-fluoresceína en color rojo a las 24 horas post-fecundación. Obsérvese el reducido número de células marcadas. Una vez dominado el procedimiento de activación fotoquímica, este puede realizarse en solo unas pocas horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar los parámetros óptimos, lo que permite una activación fotoquímica precisa a resolución de una sola célula.