La medición del complemento hemolítico 50% (CH ₅₀) La actividad de suero

Medición de la actividad del complemento hemolítico al 50 % (CH50) en suero. Necesitará un pipeta capaz de dispensar 200 microlitros y otra que pueda dispensar 1000 microlitros, suero de prueba que se ha mantenido en hielo, eritrocitos de oveja sensibilizados, solución salina tamponada con veronal y tubos con agua destilada para la prueba, señor, así como tubos para la línea base y la lisis total, un mezclador vortex y una placa de 96 pocillos con fondo plano. Etiquete los tubos individualmente con control y la dilución final. En este caso, comenzamos con una dilución de uno a ocho.

Continúe con diluciones dobles, obteniendo diluciones de uno en 16, uno en 32, uno en 64 y uno en 128, etiquetando los tubos restantes como blanco y lisis total. Una vez que todos los tubos hayan sido etiquetados, ya puede comenzar a diluir su suero de prueba. Comience transfiriendo 300 microlitros de tampón salino R a un tubo nuevo.

Ahora transfiera 100 microlitros de suero al tampón R de 300 microlitros. Esto le dará una dilución inicial de uno a cuatro. Asegúrese de que la muestra de suero se mezcle completamente.

Ahora transfiera 200 microlitros de solución salina tamponada roal a los tubos que han sido etiquetados previamente. Además, agregue 200 microlitros de solución salina tamponada roal a los dos tubos en blanco, hasta completar los tubos de lisis. Agregue 200 microlitros de agua destilada, no solución salina tamponada Verona.

Ahora transfiera 200 microlitros del suero diluido uno en cuatro al tubo etiquetado como uno en ocho. Anteriormente hemos transferido 200 microlitros de tampón salino al tubo uno en ocho hasta la serie de tubos uno en ciento veintiocho. Esto dará lugar ahora a una dilución uno en ocho.

Mezcle bien la muestra y luego transfiera 200 microlitros al tubo etiquetado como uno en 16. Continúe hasta que toda la serie de tubos haya sido diluida. Deseche 200 microlitros de la dilución uno en 128 para que el volumen final sea de 200 microlitros.

Las células sanguíneas rojas de oveja sensibilizadas pueden haberse sedimentado con el tiempo. Estas deberán resuspenderse invirtiendo suavemente el tubo varias veces. Una vez resuspendidas completamente, transfiera 200 microlitros de las células sanguíneas rojas de oveja sensibilizadas a cada uno de los tubos preparados.

Asegúrese de que el suero se mezcle completamente con los glóbulos rojos. Los glóbulos rojos de oveja sensibilizados añadidos al tubo en blanco le permitirán determinar la lisis espontánea, mientras que la sangre añadida al tubo de lisis total le permitirá determinar el valor del 100 %. Utilizando un mezclador de vórtice ajustado en velocidad baja, mezcle suavemente cada uno de los tubos. A continuación, coloque los tubos en un baño de agua a 37 grados Celsius e incube durante 30 minutos.

Después de 15 minutos, agite suavemente los tubos mediante vórtex una vez más e incube durante otros 15 minutos. Tras la incubación, transfiera los tubos a una centrífuga ajustada a cuatro grados Celsius y centrifugue a 1500 ×g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente los tubos y colóquelos en un soporte adecuado. Aquí observará el sedimento de glóbulos rojos, mientras que el SNA aparece rojo.

Debido a la liberación de la transferencia de hemoglobina, añada 100 microlitros de agua destilada al número requerido de pocillos de una placa de fondo plano de nueve a seis pocillos. Teniendo cuidado de evitar la transferencia del precipitado, transfiera 100 microlitros del sobrenadante S a un pocillo adecuado de la placa de seis pocillos. Una vez que todas las muestras hayan sido cargadas en la placa, lea la absorción utilizando un espectrofotómetro de placa ajustado a 540 nanómetros.

Aquí tenemos los datos brutos de absorción para los dos réplicas. A uno y B uno. Refiérase a la dilución uno en ocho.

Luego tenemos los datos para 1 en 16, 1 en 32, 1 en 64 y 1 en 128. A6 y B6 son los blancos. Mientras que A7 y B7 corresponden a la lisis total.

Una vez que se han recopilado los datos, debe calcular la absorción media para cada muestra duplicada. Luego reste la absorbancia del blanco, que corresponde a la lisis espontánea, de todas las muestras. Una vez que se hayan recopilado todos los datos, puede calcular ahora el porcentaje de lisis para cada dilución utilizando la siguiente fórmula.

Una vez que se hayan calculado todos los datos, represente el porcentaje de lisis en el eje vertical frente a la dilución del suero en el eje horizontal. El gráfico resultante puede utilizarse entonces para calcular la dilución del suero necesaria para lisar el 50 % de los eritrocitos sensibilizados. Este gráfico muestra el porcentaje de lisis representado frente al grado de dilución del suero.

Luego se puede trazar una línea desde el 50 % de lisis hasta que intersecte con la curva. En el punto donde la curva es intersectada, se traza una línea vertical hacia abajo hasta el eje horizontal. Este valor representa la dilución por factor que debe aplicarse al suero para garantizar una lisis del 50 %. Al comparar dos muestras de suero para determinar si existe una diferencia en el CH50, la dilución que proporciona una lisis del 50 % puede utilizarse como una med.