La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana

Para examinar las respuestas de las fitocromos en tipos celulares vegetales específicos. El atrapador del potenciador GAL4GFP y las líneas transgénicas U-A-S-B-V-R se cruzan para producir deficiencia de fitocromo. Se aíslan protoplastos foliares de la descendencia U-A-S-B-V-R cruzada con GAL4GFP a partir de plantas.

A continuación, los protoplastos se separan mediante FACs para aislar protoplastos GFP negativos y protoplastos GFP positivos en muestras separadas; los protoplastos aislados se analizan mediante microscopía confocal de barrido láser. Para confirmar la recolección de protoplastos GFP positivos, se extrae ARN de los protoplastos y se analiza espectralmente. Hola, soy Sanka Pivar del laboratorio de BARDA Montgomery en el Laboratorio de Investigación de Plantas del Departamento de Energía de la Universidad Estatal de Michigan.

Hoy les mostraremos un procedimiento para aislar protoplastos foliares de una planta ANA para el análisis de expresión génica específica por tipo celular mediante clasificación celular asistida por fluorescencia. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar respuestas dependientes de fitocromos específicas de tejidos y órganos.

La línea ANA de Arabidopsis utilizada en este procedimiento fue generada mediante un enfoque de atrapamiento de potenciadores bipartito. Uno proviene de una biblioteca de líneas de atrapamiento de potenciadores con diferentes patrones de expresión de gal o. El progenitor uno también expresa GFP bajo el control de una secuencia de activación ascendente o UAS.

En resumen, el factor de transcripción GA cuatro activa cualquier gen colocado bajo el control de UAS. En la línea parental uno, GA cuatro activa GFP; el parental uno se cruzó con el parental dos, en el que el gen BVR está bajo el control de GAL cuatro mediante UAS.

La línea resultante del cruce es U-A-S-B-V-R cruzado con G 4G FP. En las líneas parentales, la biosíntesis del cromóforo de fitocromo cuatro procede desde un LA a través del hemo hasta biliverdina, abreviada como bv. Pero en la descendencia, el producto del gen BVR bloquea la biogénesis del cromóforo de fitocromo al reducir el precursor BV. Esta línea de descendencia con trampa de potenciador BVR fue confirmada y puede utilizarse para examinar cómo una reducción en los niveles de fitocromo activo afecta a diferentes tejidos vegetales.

Comience este procedimiento preparando suelo y macetas para cultivar plantas con el fin de generar protoplastos foliares. Siembre alrededor de 2000 semillas esterilizadas por muestra por experimento en macetas con suelo. Se añade agua en la base de la bandeja que contiene las macetas y toda la bandeja se cubre con papel plástico.

Cultive las plantas durante cinco semanas bajo iluminación blanca a 22 grados Celsius y 70% de humedad. Después de los primeros cinco a seis días, se confirma la germinación de las semillas y se retira el envoltorio de plástico de la bandeja. Para aislar los protoplastos, primero prepare el tampón TEX; para un litro de tampón, pese las sales B de GA, MES, cloruro de calcio, nitrato de amonio y sacarosa.

Disuelva completamente los componentes en aproximadamente 900 mililitros de agua destilada desionizada. Abreviada como DD H2O, y ajuste el pH a 5,7 con KOH 1 M. Luego, complete el volumen final hasta un litro y esterilice por filtración.

A continuación, recolecte hojas verdes y sanas de las plantas. Recolecte aproximadamente 250 mililitros de hojas ligeramente compactadas en un vaso de precipitados. Enjuague las hojas con 40 mililitros.

DD H2O cuatro veces seguido de un lavado dos veces con DD H2O estéril utilizando un escalpelo número 20. Corte las hojas en tiras delgadas y divida el tejido equitativamente en dos tubos plásticos estériles de 50. Se prepara una mezcla de digestión de hojas x agregando una alícuota de cinco mililitros de solución stock 10 x, preparada disolviendo 2% peso por volumen de mazero R 10 y 4% peso por volumen de celulasa onuzo R 10 en tampón TEX, hasta 45 mililitros de tampón TEX fresco.

Añada aproximadamente 25 mililitros de digestión 1x a las tiras de hoja en cada tubo, de modo que todo el tejido foliar quede cubierto. Proceda a la vacío, infiltrando el tejido foliar en la digestión.

Mezcle en tubos abiertos durante una hora a temperatura ambiente utilizando un desecador al vacío conectado a una bomba de agua. Mantenga los tubos con tejido foliar y la mezcla de digestión de hojas envueltos en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. A continuación, incube durante tres horas a temperatura ambiente en un agitador con agitación suave.

Después de tres horas, aumente la velocidad del agitador durante dos minutos para liberar los protoplastos. Filtre la suspensión cruda de protoplastos a través de dos capas de gasa estéril para eliminar los restos y recoja el filtrado en un vaso de precipitados estéril. Filtre el filtrado a través de una malla de nailon estéril de 100 micrómetros hacia una placa de Petri estéril.

Recoger el flujo y transferirlo a un nuevo tubo estéril de 50 mililitros. Utilizar de 15 a 20 mililitros de tampón TEX fresco para lavar la placa de Petri estéril y recoger cualquier protoplasto adherido a la superficie. Centrifugar el flujo a 100 × g a 10 °C durante 15 minutos utilizando una centrífuga con rotor de cestillos, con la aceleración ajustada a seis y la desaceleración en cero cuando finalice la centrifugación.

Utilice una pipeta de vidrio estéril de nueve pulgadas conectada a una bomba peristáltica para eliminar alrededor de 25 a 30 mililitros del líquido situado debajo de la capa de protoplastos flotantes, que contiene restos y residuos sedimentados, sin perturbar la capa de protoplastos flotantes, dejando aproximadamente entre 10 y 50 mililitros. Tras eliminar los residuos sedimentados, añada tampón TEX fresco hasta un volumen final de 40 mililitros. Mientras se resuspenden suavemente los protoplastos, repita la eliminación de los residuos y la resuspensión del resto de protoplastos flotantes.

Repetir dos veces más para eliminar la mayor cantidad posible de restos celulares D. El tiempo de centrifugación se reduce a 10 minutos en la primera repetición y a cinco minutos en la repetición final. Finalmente, utilice una pipeta de transferencia estéril de un mililitro para aspirar los protoplastos flotantes y trasvasarlos a un nuevo tubo de 15 mililitros.

Continúe directamente con la clasificación antes de la clasificación. Examine los protoplastos mediante microscopía de barrido láser confocal o CLSM, en breve, utilizando un láser de 488 nanómetros para la excitación con el fin de confirmar la integridad de los protoplastos y la presencia de fluorescencia GFP en la población de protoplastos. Es necesario un mínimo de restos celulares para evitar la obstrucción de la boquilla de clasificación; clasifique los PROTOPLASTOS aislados en tampón TEX mediante fax.

Utilizando una boquilla de 200 micrómetros en una cabeza de clasificación macro con tasas de eventos entre 6.000 y 15.000 y una presión del sistema de aproximadamente nueve PSI siguiendo un protocolo adaptado, use PROTOPLASTOS salvajes no GFP para determinar los umbrales de autofluorescencia y recolectar protoplastos positivos para GFP clasificando células mediante un láser de argón de Argonne operado a 100 milivatios en una línea de argón de 488 nanómetros. Para identificar la fluorescencia GFP, utilice un filtro de paso de banda 530/30. Después de la recolección de protoplastos positivos para GFP, examine nuevamente los protoplastos clasificados bajo el microscopio como se hizo antes del inicio de la clasificación, para el perfilado de expresión.

Extraiga ARN total de los protoplastos clasificados. Luego se puede preparar el ADNc para hibridación. A continuación, el ADNc se somete a hibridación con matrices genómicas completas TH one OPSYS Ametri.

A continuación se presentan algunos resultados representativos del ordenamiento de protoplastos del control de tipo silvestre. Los protoplastos no presentan ninguna señal en la compuerta positiva para GFP. Sin embargo, se identifican señales positivas para GFP en muestras de protoplastos aisladas de líneas GAL4GFP antes del ordenamiento, mientras que los protoplastos aislados de plantas de tipo silvestre no muestran ninguna fluorescencia de GFP en los análisis mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM).

Se detecta una mezcla de protoplastos con y sin fluorescencia GFP en muestras de protoplastos procedentes de líneas GAL4GFP tras los hechos. El análisis mediante microscopía confocal de láser (CLSM) indica el aislamiento de protoplastos GFP positivos a partir de una línea representativa GAL4GFP; el ARN es extraíble de los protoplastos aislados y un mililitro proporciona una cantidad suficiente de ARN para su detección mediante fluoroespectrometría. Acabamos de mostrar cómo aislar protoplastos foliares de atopia ANA para el ordenamiento celular asistido por fluorescencia y el análisis de expresión génica específica por tipo celular.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar manipular con cuidado los protoplastos y limitar su exposición a la luz. Eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.