Name: Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Aprende técnicas de disección de cerebros y retinas de Drosophila para imagen en vivo e inmunohistoquímica. Este protocolo demuestra métodos efectivos para estudiar células fotorreceptoras en neurobiología.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Welch (I-1657) y el NIH (RO1EY18884). PRH es un erudito de Eugene McDermott en la investigación biomédica.

1. Introducción En este video, vamos a demostrar cómo preparar cerebro de Drosophila y retinas de imágenes en vivo e inmunohistoquímica con un enfoque en las células fotorreceptoras. En primer lugar, vamos a mostrar cómo prepararse para la disección del cerebro. A continuación, vamos a demostrar dos disecciones básicos comúnmente utilizados para inmunohistoquímica que forman la base para la preparación en vivo. Estas dos preparaciones son el cerebro adulto y disecciones del ojo. A continuación, vamos a demostrar la disección utilizado para imágenes en vivo del cerebro adulto y en desarrollo, con énfasis en su uso de imágenes en vivo de los fotorreceptores. Por último, se describe la forma en que el tejido de imágenes en vivo y mostrar algunos ejemplos de imágenes en vivo utilizando microscopía confocal de resonancia. 2. Disección de la preparación <ol><li> Para las disecciones bueno, usted necesita pinzas afiladas. El uso de un bloque de afilar o papel de lija muy fino (&gt; 1500), pasar suavemente la pinza de ida y vuelta en cada lado hasta que los extremos se encuentran en una punta fina. Utilizamos una piedra nivel de nitidez estándar. No vamos a cubrir la técnica de enfoque aquí, pero tenga en cuenta que las pinzas afiladas son esenciales para las disecciones en vivo. Afilamos fórceps antes de cada disección. </li><li> Para la disección del cerebro adulto, el lugar de las moscas en una plataforma de CO 2 para anestesiar y resolver el genotipo deseado. Para las disecciones de pupa, simplemente la mano en el frasco y retirar con cuidado una pupa con sus pinzas, teniendo cuidado de no romper la envoltura pupal. </li><li> Humedezca un Kimwipe con agua. Van a utilizar este durante la disección para eliminar los restos de su fórceps. Coloque un plato de disección en el escenario de un estereoscopio y llenarlo con una solución HL3. Todas las disecciones se llevará a cabo en HL3 para asegurarse de que el tejido se mantiene vivo y saludable durante el proceso de disección. Además, usamos un plato de disección que tiene una cubierta inferior de Sylgard para proteger fórceps durante la disección. </li><li> Ahora, preparar la fijación de solución si va a realizar la inmunohistoquímica. Lugar 180μL de HL3 en un tubo de microcentrífuga de 500μL. Añadir 20μL de formaldehído al 37% para obtener una solución de formaldehído al 3,7%. </li><li> Por último, la posición adecuada de las manos es importante para las disecciones buena. Con la posición de la mano buena, la pinza se firme y capaz de movimientos controlados y sutil. Primero, coloque la pinza en el lado del dedo pulgar. A continuación, llevar el dedo índice hacia abajo de tal manera que la punta del dedo se apoya en la parte superior. Ahora descansa al lado de la pinza en el lado del dedo medio y pasar al plato de la disección. Tener contacto físico con el plato de su dedo pulgar y el dedo medio. Mientras descansa el pulgar y el dedo medio en el plato, planta de la muñeca en la platina del microscopio. De esta manera, usted tiene tres puntos firmemente plantados en las superficies durante la disección y ahora es posible hacer manipulaciones muy sutiles de las pinzas. Esta técnica se puede sentir un poco incómodo al principio, pero con la práctica, que pronto será un maestro de la disección del cerebro. </li></ol> 3. Cerebro adulto <ol><li> En la plataforma de CO 2, orientar una mosca adulta lado ventral hacia arriba con la cabeza lejos de su mano. Coge el tórax, inmediatamente por debajo de la cabeza. Si se realiza correctamente, las piernas y la trompa se extiende. Al tiempo que visualiza en un estereoscopio, agarrar la trompa extendida con pinzas para quitar de la cabeza. Deseche el cuerpo y sumergir la cabeza. Reorientar a la cabeza sumergida. La disección completa se llevará a cabo en solución. Es muy importante mantener a la cabeza con unas pinzas en todo momento. De lo contrario, el jefe va a flotar y es difícil de recuperar. Si la cabeza se mueve fuera de foco durante la disección, sólo tiene que mover de nuevo en el plano focal, sin ajustar el microscopio. Esta tarea aparentemente simple puede ser difícil al principio, pero manteniendo la cabeza en el enfoque será más fácil el paso del tiempo. </li><li> Comenzar la disección, en primer lugar romper el tejido conjuntivo entre la trompa y el ojo. Lágrima en el ojo mientras se mantiene firme con al menos una pinza en todo momento. Asegúrese de que la punta de la pinza es justo debajo de la retina o cutícula, para evitar daños en la parte de abajo del cerebro. Alternando izquierda y derecha, utilice el fórceps para separarse de la retina, trabajando hacia la parte posterior de la cabeza. Arrancando la retina aumenta las probabilidades de que la lámina se mantiene unido al lóbulo óptico a lo largo de esta disección. Continuar por la parte trasera de la cabeza, lagrimeo cutícula en el camino. Lágrima en el ojo y otros que comienzan a separarse cutícula. Siempre y cuando se están apoderando de la cutícula, usted sabe que no están aplastando el cerebro! Con esto en mente, seguir para sacar la cutícula y la retina se desprenda hasta que el cerebro se pone de manifiesto. </li><li> Una vez que el cerebro es visible, se puede empezar a eliminar la tráquea conectado al cerebro (Fig. 1A). Continuar a tirar de la tráquea y la cutícula hasta que el cerebro está aislado. En este punto, se debe reorientar hacia el fondo de su plato para tque pasos restantes. Retire el resto de la tráquea, porque el cerebro de lo contrario pueden flotar durante el lavado de anticuerpos durante la noche. Para obtener imágenes de las terminales de los fotorreceptores, es conveniente mantener la lámina, pero tiene que quitar de la retina, que contiene los cuerpos celulares y los pigmentos fuertemente autofluorescentes. Para ello, tire con cuidado los restos celulares espesas y pigmentadas sin dañar la lámina. Esta es una habilidad más fino y requiere práctica. </li><li> El cerebro adulto puede ser mantenido con vida durante horas o incluso días con las condiciones que se discutirán en la sección 6. Por inmunohistoquímica, el cerebro adulto está listo para ser fijado en formol. 2 Utilice un pipetteman P20 establecido en 5μL para mover el cerebro de un adulto a la solución de fijación que ya ha preparado. Continúe la disección de los cerebros de adultos durante 20 minutos, que debe producir 4.10 cerebros. Deja el cerebro de fijar por un período adicional de 40 minutos, sin embargo, este plazo puede variar para la tinción óptima anticuerpo primario. Retire la solución de formaldehído y lavar el cerebro de 3 veces durante 5 minutos cada uno en 400μL de una solución de PBS y 0,4% TritonX-100, en lo sucesivo, PBS-Tritón. Después de terminar de lavar la solución de arreglo, es posible agregar la solución de anticuerpo primario. </li></ol> 4. Ojo adulto <ol><li> Comience esta disección se ha descrito para el cerebro adulto. Después de sumergir la cabeza y la reorientación del microscopio, empezar por romper el tejido conjuntivo entre la trompa y el ojo. Por encima de la trompa, aparte de la cutícula de los ojos. Ahora, separado de la cutícula de la parte inferior del ojo, trabajando hacia la parte posterior de la cabeza. Con una pinza, tomar el centro de la parte posterior de la cabeza. Con el otro, llaman la atención y tirar. Permitir que el ojo se depositan en el fondo del plato (Fig. 1B). La lámina es probable que permanece unido a la vista y se puede utilizar para obtener imágenes en directo de los terminales de las células fotorreceptoras completamente intacto en este momento. Para continuar con imágenes en vivo de los órganos de las células fotorreceptoras, vaya a la sección 4.5. Las tres secciones siguientes explican inmunohistoquímica ojos fijos. </li><li> Por inmunohistoquímica, mover el ojo a la fijación de solución con un conjunto de pipetteman P20 5μL. Continúe la disección de los ojos de un adulto para un total de 10 minutos. Dejar los ojos en la solución durante 30 minutos. Eliminar la solución de fijar y realizar lavados como se describe en la disección del cerebro adulto. </li><li> Si en última instancia, desean a la imagen de la estructura ommatidial del ojo de la lámina debe ser retirado ahora. Volver la mirada fija en su plato de disección y eliminar las células tráquea o grasa que aún se puede unir. A continuación, mientras mantiene la parte exterior del ojo con una pinza, retire la lámina con la otra. Se debe salir en una sola pieza, dejando al descubierto la cellbodies debajo (Fig. 1B). Tenga cuidado al agarrar la lámina única! De lo contrario, corre el riesgo de desprendimiento de los fotorreceptores de la retina. </li><li> El uso de un pipetteman P20, mover los ojos a 400uL PBS-Tritón en un tubo de 500 ul. Con cuidado, la roca a 4 grados durante la noche para eliminar el pigmento rojo autofluorescentes de los fotorreceptores. Al día siguiente, se puede descartar la solución de lavado y agregar la solución de anticuerpo primario. </li><li> Para imágenes en vivo de los ojos de un adulto y sólo la usamos moscas pharate adultos, es decir, las pupas de etapa tardía, poco antes de la eclosión. En esta etapa, los cuerpos de las células fotorreceptoras por separado desde las terminales de la lámina durante la disección. </li><li> Pharate adultos pupas tienen bien definidas las alas, ojos, y la cutícula visible a través de la envoltura pupal. Seleccione una pupa y eliminar la parte anterior de la cápsula de la pupa para exponer la región de la cabeza. Retire con cuidado la membrana delgada interior que encierra, además, la mosca en desarrollo. Coge la base de la cabeza con su pinza y tire. Deseche el resto de la pupa, mientras que mantener la cabeza sumergida. </li><li> Proceder como se demuestra en la disección de los ojos para inmunohistoquímica. En la etapa adulta pharate, sin embargo, los cuerpos de las células fotorreceptoras se desprenden más fácilmente de la lámina, lo que le permite a la imagen de los cuerpos celulares ubicado en la retina. Además, la lámina permanece unido al lóbulo óptico, lo que le permite a la imagen de la lámina distal. Si desea la imagen de la lámina proximal, donde los cartuchos de la terminal de fotorreceptores se puede observar, a continuación, realizar la disección del ojo de una mosca adulta, donde es más fuerte la lámina adjunta a la vista. </li></ol> 5. El desarrollo de los ojos del cerebro disco complejos <ol><li> El disco del ojo en desarrollo en un 20% el desarrollo pupal (P 20%) se ha convertido en uno de los favoritos para obtener imágenes en vivo en nuestro laboratorio, porque esta sola capa de células en desarrollo relativamente grande es fácilmente observable mediante microscopía confocal. 3 </li><li> Para seleccionar un 20% de pupa, busque los túbulos de Malpighi, un punto verde aparece debajo de la del caso de pupa, pupa y evitar que tengan un &quot;cuerpo negro&quot; 4. Después de seleccionar un sumergirse P +20% pupa, en HL3 en su plato de disección y retire con cuidado una porción anterior de la bolsa de pupa, teniendo cuidado deno para penetrar en la membrana interna delgada. Sujete la membrana interna con sus pinzas y se separan. </li><li> Con cuidado, buscar a través de los contenidos lanzado para encontrar el desarrollo del cerebro y los discos de los ojos que son muy prominentes (Fig. 1C). El ojo de disco complejo del cerebro que se separa fácilmente en esta etapa de la metamorfosis. Aislar el cerebro en la parte inferior de la placa de disección. Separar cuidadosamente el cerebro central del lóbulo óptico. La óptica del lóbulo / ojo disco se va utilizar en las imágenes en vivo. </li></ol> 6. Vivir de imagen: En el microscopio <ol><li> Si desea la imagen de un corto período de tiempo en sólo una o dos soluciones, es posible que la imagen de su tejido en un portaobjetos de vidrio. En este caso, preparar la diapositiva por primera capa de la superficie con Sylgard con las instrucciones del fabricante. Lugar 20μL HL3 en el centro de la diapositiva. El transporte de sus tejidos disecados en 20 l adicionales de HL3 a la diapositiva. El tejido NUNCA debe ser expuesto al aire. Además, el estrés o la tensión de la manipulación o la pipeta de la tensión superficial solución debe ser evitado. </li><li> Para imágenes en vivo, el tejido debe estar firmemente asegurado con una manipulación mínima y el contacto. De manera segura a la posición del cerebro utilizando el GluShield agua polimerización pegamento quirúrgico aplicado a través de un microelectrodo, una técnica habitual utilizada para la preparación de embriones para la electrofisiología 5. Obtener un electrodo de vidrio como los que sacó de los registros electrofisiológicos. Romper la punta y rellene el final con GluShield presión de aire negativa generada por la boca. Romper sólo lo suficiente del electrodo que el pegamento puede entrar. Ahora el uso de presión positiva para aplicar una pequeña cantidad de pegamento a la Sylgard en una gota de HL3. Ahora, rápidamente el tejido de la cola, el mantenimiento de la orientación deseada para la imagen en vivo. Una lente de inmersión en agua se puede utilizar ahora para obtener imágenes. Si quiere añadir un colorante membrana permeable, se puede añadir al baño, mientras que la imagen. </li><li> Nosotros usamos un microscopio de barrido confocal de resonancia que permite imágenes rápidas con la reducción de photobleaching. 6 Para imágenes durante largos períodos de tiempo o de soluciones de intercambio total o varias veces, se utiliza una cámara de perfusión (Harvard IC30 microscopía confocal de la cámara) que se conecta a una bomba peristáltica que poco a poco perfunde solución de cultivo sobre el tejido vivo (Fig. 2A). Movimiento de cambio constante contacto con líquidos y GluShield mínima reducir el aplastamiento de los tejidos que se ha observado durante períodos más largos de tiempo 7. Tenga en cuenta que para la imagen de los períodos de tiempo de desarrollo, el ojo de disco complejo del cerebro que tiene que estar intacto y tienen un contacto mínimo con el pegamento. </li><li> Use una hoja de cubierta revestida con una gota de Sylgard que se afeita para que sea delgada y plana. Dispense 20μL HL3 en el centro del cubreobjetos y la cola del tejido vivo de la Sylgard. Generar una junta que permitir que las burbujas para pasar a través de la cámara, sin exponer el tejido vivo al aire (Fig. 2B). La junta debe ser lo suficientemente gruesa como para evitar el aplastamiento de los tejidos, pero lo suficientemente delgada como para que el tejido cerca de la lente de un microscopio confocal, que utilizamos en nuestra configuración de 250 micras. Montar la cámara de perfusión, teniendo cuidado de mantener el tejido sumergido por completo en todo momento. Comenzar la perfusión inicialmente a una tasa cercana a 100μL por minuto, utilizando una bomba peristáltica. Esta velocidad es más rápida en función del espesor de la junta que define la altura de la cámara. Para la imagen en la escala de horas, puede que tenga que añadir 20 hidroxiecdisona y antibióticos, antimicóticos, pero no, y realizar la perfusión a una velocidad mucho más baja alrededor de 10μl por minuto. Finalmente, la burbuja de oxígeno en el medio de cultivo que abastece a la cámara de perfusión. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Al final de nuestro protocolo de vídeo se muestra un ejemplo de imagen en vivo de las células fotorreceptoras de desarrollo a través de la preparación en la Sección 5. Esta preparación se aprovecha de Drosophila transgénesis de células expresan específicamente a los periodistas fluorescentes. En el ejemplo mostrado, dos reporteros fluorescentes se expresan bajo el control de los fotorreceptores específicos de GMR-Gal4 conductor 8: la membrana de la etiqueta myrRFP y el marcador endosomal 2xFYVE-GFP 9. De dos canales conjuntos de datos 3D con una caja de delimitación de 70x70x17.5μm y un tamaño de voxel de 137x137x700nm (512x512x26) se obtuvieron cada 1 min. La película muestra un plano seleccionado con el tiempo en esta base de datos 4D que revela la dinámica del tráfico intracelular de vesículas endosomal y eventos de fusión. Imágenes representativas de preparaciones de tejidos fijos del ojo y la lámina se muestra en la figura. 3.

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Las sondas fluorescentes para la imagen A continuación se describen las ventajas y limitaciones de la preparación del sistema visual de Drosophila para una selección de sondas fluorescentes a partir de tres clases: (1) Las sondas que se añaden a una preparación de tejido vivo exógenamente, (2) las proteínas fluorescentes que están genéticamente codificados por tanto en directo como imágenes fijas, (3) tintes fluorescentes que se añaden al tejido fijado para inmunohistoquímica. 1. Sondas exógenas: LysoTracker Verde DND-26 o Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Estos se encuentran disponibles comercialmente fluorescente membrana, compuestos que se acumulan en los compartimentos fuertemente acidificados en la célula, lo más prominente lisosomas, endosomas tarde, y autofagosomas. LysoTracker en concentraciones nanomolares (que suelen utilizar 50 nm) penetra en la L3 y la P 20% dto los ojos totalmente en menos de un minuto. Desde LysoTracker continuamente se acumula y ejerce un efecto alcalinizante, que la imagen en menos de 5 minutos. En contraste con los discos de los ojos, LysoTracker no penetra en el cerebro, sin alteración de los tejidos. Sin embargo, cuidado de rotura de la membrana externa permite la penetración de un diámetro de unos pocos celulares en el lóbulo óptico. Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) En contraste con LysoTracker, Lysosensor no se acumula en compartimentos acidificados, sino que exhibe un aumento de fluorescencia a pH ácido. Lysosensor tiene características de penetración que son muy similares a LysoTracker. Usamos Lysosensor a una concentración de 1μM. 2. Sondas genéticamente codificados: Para muchos experimentos de imagen en vivo, que expresan los genes etiquetados con diferentes moléculas fluorescentes, como las buenas prácticas agrarias, TagRFP 10 o el pHluorin sensible al pH 11 bajo el control del sistema de expresión binaria GAL4/UAS 12. Gal4 líneas que expresan en los fotorreceptores en desarrollo incluyen GMR-GAL4 (todos los fotorreceptores) 8 y mDelta0.5-Gal4 (desarrollo R4 y R7) 13. Varios subtipos específicos de conducir Gal4 existen líneas directas que los promotores del uso de diferentes rodopsina 14. Sondas fluorescentes especialmente útil en imágenes en vivo son proteínas fotoconvertible. Hemos utilizado con éxito Dendra2, un monómero de verde a rojo proteína photoconvertable 15. Tenga en cuenta que Dendra2 está diseñado para ser fotoconvertible utilizando un rayo láser de argón 488 nm. Sin embargo, no somos capaces de lograr una conversión con la luz azul visible con nuestro set-up en modo de escaneo de resonancia convencional o confocal. Por el contrario, la conversión con láser UV 405 nm es eficiente. 3. Inmunohistoquímica: Para el ojo del adulto fijo, a menudo elegir rodamina phalloidin (Invitrogen, Inc.) o anti-Chaoptin (un anticuerpo específico de fotorreceptor 16) para visualizar la estructura rabdomérica (Fig. 1A). Una buena manera de analizar la estructura de la lámina de cartuchos es la combinación de anti-chaoptin 16, el marcador anti-gliales ébano 17 y 18 anti-sec6 (fig. 1B). Como se muestra en la figura. 3, esta combinación de anticuerpos que distingue a los principales presináptica (chaoptin) y postsinápticos (sec6) procesos, así como las células de epitelio (fiesta) en la lámina 19. Montaje de la cámara de perfusión Para imágenes en vivo, contamos con una cámara de perfusión que permite el intercambio lento de soluciones sin molestar a la preparación del tejido. Una demostración de montaje de cámara de perfusión está incluido en el vídeo y se muestra esquemáticamente en la Figura 2. Asamblea de la cámara de perfusión se ilustra en la figura. 2A. Comience colocando la junta sobre la primera muestra, y luego continuar con el montaje como se muestra. El propósito de la junta es crear un espacio entre la base de la cámara y la tapa, un espacio dentro de la cual se sella el tejido y por el cual la solución de flujo. El espacio dentro de la junta debe incluir la entrada (solución entra aquí), la preparación de tejidos, y la salida a través del cual la solución sale de la cámara. Dos características de la junta son fundamentales: en primer lugar, la junta debe ser lo suficientemente gruesa para que el cerebro aún lo suficientemente delgada como para permitir que las imágenes con una lente de alta resolución. El espesor de la junta ideal depende de la configuración específica de los parámetros. En segundo lugar, una muesca en la junta proporciona un compartimiento que permite una burbuja para pasar sin ponerse en contacto con la muestra (Fig. 2B). Imágenes en el microscopio Utilizamos un 63x (apertura 1.3) lente de inmersión en glicerina para la cámara de perfusión o de una lente de 63x de inmersión en agua directamente en el medio de cultivo en una diapositiva. Lentes de glicerina proporcionan mayor distancia de trabajo que las lentes de petróleo. Nosotros usamos un microscopio de barrido confocal de resonancia que explora a un ritmo mucho más rápido que un escáner convencional (8000 Hz en comparación con 1400 Hz, respectivamente). De exploración de resonancia permite grabaciones en 3 dimensiones en el tiempo en rápidoer velocidades de fotogramas. Además, la mayor velocidad de escaneo láser reducen significativamente fototoxicidad 6, que es una preocupación importante para los análisis repetidos de los tejidos vivos. Un balance de la intensidad del láser y el voltaje de PMT (ganancia) se debe lograr maximizar la señal y reducir al mínimo el ruido y photobleaching. Una consideración importante es que la cantidad de impactos de láser en una región dada se determina por resolución y zoom. Por ejemplo, una región de la elección se explora en la misma resolución a 256x256, zoom de 2x al 512x512, zoom 1x, sin embargo, la velocidad de imagen en vivo al máximo posible es 4 veces más rápido en 256x256, zoom de 2x. Para registrar la actividad de movimiento rápido compartimentos intracelulares, hemos registrado con éxito con los siguientes valores: 5 fotogramas por z-stack, a razón de un z-stack por 10 segundos con una velocidad de escaneo de 8000 Hz y un promedio de línea de 2x. Para las sesiones de formación de imágenes de largo en la escala de horas, que a menudo reducen la velocidad de fotogramas a una por varios minutos y elegir áreas más grandes como la preparación es más probable que cambie. Anatomía del sistema visual de Drosophila La Figura 3 muestra la anatomía del ojo adulto de Drosophila (Fig. 3A), el cerebro adulto (Fig. 3B), y el 20% y 25% complejo de pupa ojo disco / cerebro (Fig. 3C). Figura 3 ilustra el ojo del adulto, con y sin la lámina y las células de grasa adherida. Durante la disección del ojo adulto, la lámina, la cual se encuentra en el centro del ojo situado en un recipiente formado por los cuerpos de las células fotorreceptoras (izquierda), se debe extraer sin alterar los cuerpos celulares de bajo (derecha). Para la disección del cerebro adulto, uno debe ser capaz de distinguir los cuerpos de las células fotorreceptoras, la lámina, el lóbulo óptico, el cerebro central, y la tráquea (Fig. 3B). Los fotorreceptores y la tráquea que ser eliminado debido a que esta disección, dejando la lámina adjunta en el lóbulo óptico. Para ayudar en la identificación de los ojos de pupa 20-25% del disco / cerebro complejo, una imagen en vivo se presenta en la Figura 3C. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Diagrama de anatomía neural que muestra el cerebro, el lóbulo óptico, los cuerpos celulares; disección de lámina, fotorreceptores." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) del cerebro adulto. (B) para adultos ojo. (C) 20% -25% de pupa complejo eye-disc/brain. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Diagrama de configuración microfluídica con flujo de muestra, lente objetivo, entradas, salidas, bomba, junta, base." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. (A) conjunto de la cámara de perfusión y (B) junta posicionamiento relativo a la muestra. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Imágenes de microscopía fluorescente; estructuras celulares, marcadores verdes/rojos, comparación experimental." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. (A) tinción de Adultos rhabdomere utilizando anti-chaoptin. (B) Adultos lámina tinción con anti-chaoptin (verde, los fotorreceptores), anti-ébano (de color rojo, la glía), y sec6 (azul, las interneuronas).

Equipos especiales: <ol><li> Alcance de la disección: Leica Mz12.5 con cámara digital </li><li> Leica TCS SP5 Confocal Tandem-Scanner microscopio para la exploración convencional y resonancia en vivo imágenes de microscopía, incluyendo el azul (488nm), verde (561nm), naranja (594nm) y rojo lejano (633 nm) láser, así como 63x especial, glicerina y un 1.4 63x, 1,3 lentes de inmersión en agua. </li><li> Harvard Instrumentos microscopía confocal Cámara RC-30 y la bomba peristáltica modelo 720 </li><li> Sutter extractor pipeta P-97 </li><li> Software: Amira 5.2, Visage Imaging </li></ol>

preparación de desarrollo y de adultos drosophila los cerebros y retinas de imágenes en vivo

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Cerebro y el sistema visual son ampliamente utilizados sistemas modelo para estudiar el desarrollo neuronal de funciones, y la degeneración. Aquí se muestran tres preparaciones de cerebro y del sistema visual que cubren la gama desde el ojo-cerebro en desarrollo del disco complejo en el desarrollo de las pupas de ojos individual y la disección del cerebro de las moscas adultas. Todos los protocolos están optimizados para la cultura viva de los preparativos. Sin embargo, también presentan las condiciones para inmunohistoquímica del tejido fijado en su caso. Finalmente, se muestran las condiciones en vivo de imágenes de estas preparaciones de uso convencional y resonancia 4D imagen confocal en vivo en una cámara de perfusión. En conjunto, estos protocolos sirven de base para imágenes en vivo a diferentes escalas temporales que van desde los ensayos funcionales intracelular en la escala de minutos a los procesos de desarrollo o degenerativas en la escala de muchas horas.

Este protocolo describe tres<em&gt; Drosophila</em&gt; Preparación: 1) la disección del cerebro adulto, 2) la disección de retina adulta y 3) el desarrollo del ojo-cerebro disco disección complejos. Se hace hincapié en las técnicas de preparación y condiciones especiales para imágenes en vivo, a pesar de todos los preparativos pueden ser utilizados para inmunohistoquímica del tejido fijo.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

El cerebro y el sistema visual de Drosophila son sistemas modelo ampliamente utilizados para estudiar el desarrollo, la función y la degeneración neuronal. Aquí mostramos tres...

Cómo lo hacen ustedes, en este video, demostraré cómo preparar muestras de cerebro y retina para imágenes en vivo e inmunohistoquímica, centrándome en las células fotorreceptoras. Primero, les mostraré cómo prepararse para las disecciones de cerebro. Luego, demostraré tres disecciones diferentes: el cerebro adulto, la retina adulta y el ojo en desarrollo.Para cada uno de estos, el tejido puede fijarse para inmunohistoquímica o visualizarse en vida. Finalmente, describiré cómo visualizamos tejido en vida, y mostraré algunos ejemplos de imágenes en vivo utilizando microscopía confocal de barrido por resonancia. Así que comencemos.Para las secciones de bondad, se necesitan pinzas afiladas. Utilizando un bloque de afilado o papel de lija muy fino, pase suavemente las pinzas hacia adelante y hacia atrás en cada lado hasta que las puntas coincidan. En un punto fino, utilizamos una piedra de afilado estándar.No trataré aquí la técnica de afilado, pero diré que las pinzas afiladas son esenciales para las disecciones en vivo. Afilamos las pinzas todos los días para las disecciones de cerebro adulto. Coloque las moscas sobre una almohadilla de CO2 para anestesiarlas y seleccione el genotipo deseado.Para las disecciones de pupilas, simplemente introduzca la pinza en el frasco y retire cuidadosamente una pupila, teniendo cuidado de no romper la cápsula de la pupila. Haga una bola con una toalla absorbente (kim wipe) y humedézcala con agua. Utilizará esto durante la disección para eliminar los restos de la pinza.Coloque un recipiente de disección sobre la platina de un estereoscopio y llénelo con solución HL tres. Todos los disecciones se realizarán en HL tres para asegurar que el tejido permanezca vivo y saludable durante el procedimiento de disección. Además, me gusta utilizar un recipiente de disección que tenga una capa inferior de Sylgard para proteger mis pinzas durante la disección.Ahora, prepare una solución fijadora. Si planea realizar inmunohistoquímica, coloque 180 microlitros de HL3 en un tubo microcentrífugo de 500 microlitros.Añada 20 microlitros de formaldehído al 37 % para obtener una solución de formaldehído al 3,7 %. Finalmente, la posición adecuada de las manos es importante para realizar disecciones correctas con una buena posición de las manos. Sus pinzas estarán firmes y serán capaces de realizar movimientos sutiles controlados.Primero, coloque la pinza al lado del pulgar, luego baje el dedo índice directamente hacia abajo de modo que la punta del dedo quede apoyada encima. Ahora, apoye el lateral de la pinza contra el lateral del dedo medio y muévalo hacia el recipiente de disección. Establezca contacto físico con el recipiente mediante el pulgar y el dedo medio, manteniendo el pulgar y el dedo medio apoyados sobre el recipiente.Coloque su muñeca sobre la platina del microscopio. Así. Tiene tres puntos firmemente apoyados sobre superficies durante la disección, y ahora es posible realizar únicamente manipulaciones muy sutiles de la pinza.En la placa de CO2. Oriente una mosca adulta con el lado ventral hacia arriba y la cabeza alejada de su mano. Sujete el tórax justo debajo de la cabeza.Si se realiza correctamente, las patas y el probóscide se extenderán al observar bajo un estereoscopio; sujete el probóscide extendido con la pinza para retirar la cabeza, deseche el cuerpo y sumerja la cabeza. Vuelva a enfocar sobre la cabeza sumergida. Toda la disección se realizará bajo solución.Es muy importante sujetar la cabeza con la pinza en todo momento. De lo contrario, la cabeza flotará. Y recuerde, una cabeza flotante siempre es difícil de recuperar.Si la cabeza se sale del plano de enfoque durante la disección, simplemente regrésela al plano focal sin ajustar el microscopio. Esta tarea aparentemente sencilla puede resultar difícil al principio, pero con el tiempo será más fácil mantener la cabeza enfocada. Comience la disección rasgando primero el tejido conectivo entre el probóscide y el ojo.Desgarre a través del ojo mientras sostiene firmemente con al menos una pinza en todo momento. Asegúrese de que la punta de la pinza esté apenas debajo de la retina o la cutícula. Para evitar dañar el cerebro situado debajo, alterne entre izquierda y derecha.Utilice la pinza para desgarrar la retina trabajando hacia la parte posterior de la cabeza. Desgarrar la retina aumentará las probabilidades de que la lámina permanezca adherida al lóbulo óptico. Durante toda esta disección, continúe alrededor de la parte posterior de la cabeza, desgarrando el cutículo sobre el camino, atraviese el otro ojo y comience a separar el cutículo.Mientras agarre la cutícula, sabrá que no está aplastando el cerebro. Con esto en mente, siga retirando la cutícula y la retina hasta que quede expuesto el cerebro. Una vez que el cerebro sea visible, puede comenzar a eliminar la tráquea adherida al cerebro; siga tirando de ella, junto con la tráquea y la cutícula, hasta que el cerebro quede aislado.En este momento, debe volver a enfocar en la parte inferior de su placa para los pasos restantes de la obtención de imágenes de los terminales fotorreceptores. Es recomendable conservar la lámina, pero necesita eliminar la retina, que contiene los cuerpos celulares y el pigmento fuertemente autofluorescente. Para ello, tire cuidadosamente de los restos de los cuerpos celulares peludos sin dañar la lámina.Esta es una habilidad más refinada y requiere práctica. Retire la tráquea restante. Debido a que de lo contrario su cerebro podría flotar durante los lavados con anticuerpos nocturnos, el cerebro adulto puede mantenerse vivo durante horas o incluso durante la noche utilizando condiciones que discutiré en la sección siete. Para inmunohistoquímica, el cerebro adulto ya está listo para ser fijado con formaldehído.Utilice una pipeta P20 ajustada a cinco microlitros para transferir el cerebro adulto a la solución de fijación que ya ha preparado. Continúe diseccionando cerebros adultos durante 20 minutos, lo que debería producir entre cuatro y diez cerebros. Deje los cerebros en fijación durante 40 minutos adicionales.Sin embargo, esta duración puede variar. Para una tinción óptima con el anticuerpo primario, retire la solución de formaldehído y lave los cerebros tres veces durante cinco minutos cada vez con 400 microlitros de una solución que contiene PBS y 0,4 % TRITON X-100, en adelante denominada PBS Triton. Después de eliminar completamente la solución fijadora, puede añadir la solución de anticuerpo primario.Comience esta disección como se describió para el cerebro adulto. Después de sumergir la cabeza y reenfocar el microscopio, comience por rasgar el tejido conectivo entre el probóscide y el ojo situado por encima del probóscide. Separe la cutícula del ojo. A continuación, separe la cutícula de la cara inferior del ojo, avanzando hacia la parte posterior de la cabeza con una pinza.Sujete el centro de la parte posterior de la cabeza para esta disección. Es aceptable aplastar el cerebro con la otra pinza. Sujete el ojo y sepárelo.Deje que el ojo se asiente en el fondo del recipiente. Es probable que la lámina aún esté adherida al ojo y se puede utilizar para imágenes en vivo de los terminales de los fotorreceptores a partir de células fotorreceptoras completamente intactas. Las tres secciones siguientes explican cómo preparar el ojo para inmunohistoquímica.Para inmunohistoquímica, coloque el ojo en la solución fijadora. Utilizando un micropipeta P 20 de Petman ajustada a cinco microlitros, continúe diseccionando ojos adultos durante un total de 10 minutos. Deje los ojos y fíjelos durante 30 minutos adicionales.Retire la solución fijadora y realice los lavados según se describe en la disección del cerebro adulto. Si finalmente desea obtener imágenes de la estructura material del ojo, entonces este debe ser retirado. Ahora regrese los ojos fijados a su recipiente de disección y elimine cualquier tráquea o células grasas que aún puedan estar adheridas.Luego, mientras sostiene el exterior del ojo con una pinza, retire la lámina con la otra. Debe desprenderse en una sola pieza, exponiendo los cuerpos celulares debajo. Tenga cuidado de agarrar únicamente la lámina; de lo contrario, corre el riesgo de despegar los cuerpos celulares de la retina.Utilizando un pipeta P20, transfiera los ojos a 400 microlitros de PBS con Tritón en un tubo de 500 microlitros. Agite suavemente a cuatro grados durante la noche para eliminar el pigmento rojo autofluorescente de los fotorreceptores al día siguiente. Puede desechar la solución de lavado y añadir el anticuerpo primario para la imagen viva de ojos adultos sin la lámina.Solo utilizamos moscas adultas de hurón, que son larvas de última etapa poco antes de la ecdisis. En esta etapa, los cuerpos celulares de los fotorreceptores se separan de los terminales en la lámina durante la disección del hurón. Las larvas adultas de hurón presentan alas, ojos y cutícula bien definidos, visibles a través del caso pupal.Seleccione una pupa y sumérjala en HL tres. Retire la porción anterior del capullo para exponer la región cefálica. Retire cuidadosamente la membrana interna delgada que adicionalmente rodea a la mosca en desarrollo.Sujete la base de la cabeza con la pinza y tire. Deseche el resto de la pupa mientras mantiene la cabeza sumergida. Proceda como se describe en la disección del ojo para inmunohistoquímica en el estadio adulto de fer.Sin embargo, los cuerpos celulares de los fotorreceptores se desprenderán más fácilmente de la lámina, lo que le permitirá observar los cuerpos celulares alojados en la retina. Además, la lámina permanece unida al lóbulo óptico, permitiendo visualizar la lámina distal. Si desea observar la lámina proximal, donde pueden verse los cartuchos terminales de los fotorreceptores, realice la disección del ojo en una mosca adulta, en la cual la lámina está más firmemente unida al ojo.El disco del ojo en desarrollo en el estadio 20% de desarrollo de la pupa se ha convertido en un material favorito para el análisis por imagen en vivo en nuestro laboratorio. Esta única capa de células en desarrollo relativamente grandes es fácilmente observable mediante microscopía confocal. Para seleccionar una pupa al 20%, busque los túbulos de Ian, una mancha verde que aparece debajo del caparazón pupal, y evite las pupas que tienen un cuerpo oscuro, el cual se forma tras el 20% de desarrollo pupal.Después de seleccionar una pupa, sumérjala en HL tres en su plato de disección y retire cuidadosamente una porción anterior de la bolsa pupal, teniendo cuidado de no penetrar la delgada membrana interna. Sujete la membrana interna con la pinza y sepárela.Busque cuidadosamente entre los contenidos liberados para encontrar los discos cerebrales y oculares en desarrollo, que son bastante prominentes. Aísle el cerebro en la parte inferior del recipiente de disección. Separe cuidadosamente el cerebro central del lóbulo óptico.Se utilizará el complejo disco del lóbulo óptico I para la imagen en vivo. Si desea realizar imágenes durante un período corto de tiempo en solo una o dos soluciones, puede obtener imágenes de su tejido en un portaobjetos de vidrio. En este caso, prepare el portaobjetos recubriendo primero la superficie con Sylgard siguiendo las instrucciones del fabricante.Coloque 20 microlitros de HL tres en el centro del portaobjetos. Transfiera su tejido diseccionado en 20 microlitros adicionales de HL tres al portaobjetos. El tejido nunca debe exponerse al aire.Además, debe evitarse cualquier estrés o tensión provocada por el manejo de la pipeta. Para la imagen en vivo, el tejido debe fijarse firmemente. Obtenga un electrodo de vidrio como los elaborados para grabaciones electrofisiológicas.Rompa la punta y llene el extremo con pegamento mediante una presión de aire negativa generada por la boca; rompa solo la cantidad suficiente del electrodo para que el pegamento pueda entrar. Ahora, use presión positiva para aplicar una pequeña cantidad de pegamento al reborde protector bajo una gota de HL tres. A continuación, coloque rápidamente el tejido sobre el pegamento, manteniendo la orientación deseada para la imagenología en vivo.Ahora se puede utilizar un objetivo de inmersión en agua para la adquisición de imágenes. Si desea añadir un colorante permeable a la membrana, puede agregarlo al baño. Durante la adquisición de imágenes por períodos prolongados o para intercambiar completamente o varias veces las soluciones, utilizamos una cámara de perfusión que se conecta a una bomba peristáltica que perfunde lentamente la solución de cultivo sobre el tejido vivo.Utilice un cubreobjetos recubierto con una gota de Sylgard que se ha afeitado para hacerla delgada y plana. Añada 20 microlitros de HL3 al centro del cubreobjetos. Coloque el tejido vivo sobre el cubreobjetos y péguelo al Sylgard.Genere una junta que permita que las burbujas pasen a través de la cámara sin exponer el tejido vivo al aire. La junta debe ser lo suficientemente gruesa para evitar comprimir el tejido, pero lo suficientemente delgada para acercar el tejido al objetivo del microscopio confocal. Arme la cámara de perfusión teniendo cuidado de mantener el tejido completamente sumergido en todo momento.Por lo tanto, los intercambios de solución pueden realizarse a velocidades de hasta 100 microlitros por minuto. Para imágenes en una escala de horas, puede ser necesario añadir 20 hydroxy Dyson y antibiótico, pero no antifúngico, y realizar la perfusión a velocidades mucho más bajas, alrededor de 10 microlitros por minuto. Además, burbujeamos oxígeno en el medio de cultivo que alimenta la bomba peristáltica.Ahora tiene todas las habilidades necesarias para realizar con éxito la disección del cerebro y la retina de Drosophila. Además, puede obtener imágenes de discos oculares en desarrollo vivo o de fotorreceptores adultos. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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