Análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de Self-Made Cytospin

Hola, mi nombre es Rick Pasqua, estudiante del Laboratorio de Ingeniería de Células Madre en el Departamento de Ciencias Químicas y de la Vida de la Universidad Estatal de Virginia. En este video, demostraré cómo nuestro laboratorio utiliza un aparato de centrifugación STO económico y hecho en casa para crear una monocapa observable de células madre pluripotentes humanas con el fin de cuantificar marcadores de superficie celular. Dado que muchos protocolos inmuniquímicos se adaptan para células PSC humanas cultivadas en láminas con cámaras en forma de colonias, pueden surgir problemas al caracterizar la expresión de los biomarcadores a nivel celular individual.

Tener las células en una monocapa facilita no solo el análisis visual de estas, sino posiblemente también la cuantificación de su expresión; el aparato de espín sinusal que utilizan nuestros laboratorios puede construirse con materiales disponibles en la mayoría de los laboratorios, solo requiere una pequeña muestra de células y no necesita ningún tipo de reactivo específico. Y lo más importante, es capaz de reproducir de forma confiable una distribución de células individuales para su observación. A continuación, se indican algunos de los elementos necesarios para construir el aparato de citosina.

Placas de plástico, ya que estas no necesariamente deben estar limpias, puede usar placas de cámara usadas si lo desea. Placas de vidrio previamente limpiadas. Estas deben limpiarse porque aquí se creará la monocapa celular.

Papel de filtro, cualquier tipo sirve, y puntas de micropipeta. Las puntas de uno a 10 microlitros son las que nuestro laboratorio utiliza antes de que pueda comenzar la construcción. Primero se deben hacer agujeros en las láminas de plástico.

Esto puede realizarse utilizando una taladradora. El diámetro de los orificios depende del tamaño de la punta de micropipeta y debe ser aproximadamente igual al ancho de la sección más ancha de la punta utilizada para una micropipeta estándar de uno a 10 microlitros. Esto debería ser de alrededor de siete milímetros.

La cantidad de orificios que crea en las láminas de plástico depende completamente del uso previsto para ellas. Por ejemplo, para la tinción inmunoquímica en nuestro laboratorio, generalmente utilizamos dos orificios, uno para la tinción positiva y otro para el control negativo del fondo. Estas láminas pueden reutilizarse una cantidad indefinida de veces.

Para el papel de filtro, simplemente corte un trozo del mismo según las dimensiones de la portaobjetos de plástico. Utilice los orificios de la portaobjetos como referencia para hacer orificios en el papel de filtro. El tamaño del orificio en el papel de filtro debe ser lo suficientemente grande como para que la punta de la micropipeta encaje firmemente, como se muestra aquí.

Luego, debemos recortar el número adecuado de puntas de pipeta microlitera, una para cada orificio, aproximadamente a la mitad de su longitud. Esto servirá como base de la lámina de vidrio donde se creará la monocapa celular. A continuación, se colocará el papel de filtro encima de esto.

El papel de filtro servirá para absorber cualquier medio en exceso de la tinción por suspensión. A continuación, se colocará encima la lámina de plástico, que hará las veces de soporte sólido del aparato. Posteriormente, se puede sellar por los cuatro lados con cinta adhesiva común.

Finalmente, se insertan puntas completas de micropipeta en las puntas cortadas del aparato. Aquí es donde se colocarán las muestras celulares tras la tinción en suspensión. También puede ser útil marcar inicialmente la posición de las puntas cortadas sobre el portaobjetos para facilitar su reconocimiento.

El protocolo de tinción en suspensión inmunoquímica que utiliza nuestro laboratorio implica primero la recolección de células madre en una suspensión de células individuales, lo cual generalmente se realiza mediante disociación enzimática, usando tripsina o tampones de disociación celular sin enzimas basados en EDTA. Las células se transfieren entonces a tubos microcéntrifugos de uno o dos mililitros con su medio de crecimiento estándar. A continuación, se centrifugan a 200 G durante cuatro minutos.

Se utilizará la misma velocidad de centrifugación para todos los pasos subsiguientes de lavado y precipitación. Luego, el medio se aspira manualmente; tenga especial cuidado durante la aspiración para asegurarse de que el precipitado celular permanezca intacto. A continuación, se lava con un ml de PBS dos veces, centrifugando y aspirando cada vez.

El siguiente paso consiste en fijar las células utilizando reactivos de formaldehído al 4% o PFA necesarios para preparar esta solución o detallados en la descripción adjunta de este video. Las células se incuban en la solución de formaldehído al 4% y se dejan a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se recomienda realizar este paso antes de la suspensión extracelular y la tinción para el uso del aparato citocentrífugo.

Posteriormente, las células se lavan dos veces con PBS para eliminar rastros de PFA. A continuación, las células deben bloquearse para evitar la tinción inespecífica. Después de los lavados con PBS en el paso anterior, aspire el líquido de lavado y agregue un ml de la solución de bloqueo.

Deje esto a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 minutos. Mientras espera la solución de bloqueo, puede preparar el anticuerpo primario diluyéndolo a la dilución recomendada en la solución de bloqueo. Almacene esta mezcla a cuatro grados Celsius.

Después de que las células hayan estado en la solución de bloqueo durante aproximadamente 45 minutos, centrifugue y aspire esta solución, luego resuspenda las células en la solución de anticuerpo primario. A fin de detectar unión inespecífica y controlar el fondo, es recomendable mantener al menos una muestra como control negativo, a la que no se le añada anticuerpo primario y que simplemente se resuspenda en PBS.

Todas las muestras se dejan a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. Si se desea, las células fijadas pueden dejarse en suspensión en la solución de anticuerpo primario durante la noche y luego lavarse dos veces con la solución de bloqueo. Mientras se realiza el lavado, puede prepararse la solución de anticuerpo secundario.

Los anticuerpos secundarios suelen ser sensibles a la luz, por lo que, si es posible, atenúe las luces del laboratorio y cubra los recipientes utilizados con papel de aluminio; esto se hace para prevenir el desvanecimiento de la fluorescencia. Los reactantes antifa pueden incorporarse al protocolo, pero debe tenerse cuidado en su uso, ya que pueden provocar un fondo más elevado, al igual que el anticuerpo primario diluido a la concentración recomendada en la solución de bloqueo. Aplique un vis a todas las muestras, independientemente de si se agregó o no el anticuerpo primario, una vez finalizado el lavado.

Deje que esta mezcla repose en un área oscura, como dentro de un frasco, durante aproximadamente una hora. Lave las células dos veces con un ml de solución bloqueadora. Ahora las células deben estar listas para la tinción nuclear con el colorante DPI.

Prepare la solución de DPI inicialmente en una dilución de uno a 10.000 en PBS, lave las células una vez con un ml de PBS, luego resuspenda en DPI y deje reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente cinco a 10 minutos. Al igual que el anticuerpo secundario, el DAPI es sensible a la luz, por lo que realice los ajustes necesarios para evitar el blanqueo de la fluorescencia. Lave una vez con un ml de PBS y finalmente, resuspenda.

Suspender nuevamente en un ml de PBS. Esto debería estar listo entonces para su uso con un aparato de citocentrifugación. Colocar como máximo 100 microlitros de la solución de células individuales en la parte superior de las puntas de micropipeta.

Se recomienda una cantidad menor para evitar desbordamientos o goteo innecesarios. Posteriormente, coloque un aparato de citocentrifugación y el contrapeso en una centrífuga de banco y centrifugue a 1000 RPM durante cuatro minutos. A continuación, desarme cuidadosamente el aparato de citocentrifugación de manera que se minimice la posibilidad de desprendimiento de las células del portaobjetos de vidrio.

Verifique que la sedimentación haya tenido lugar bajo el microscopio de fluorescencia antes del montaje. Estas son imágenes tomadas de una monocapa de células BG one V teñidas con cuatro marcadores de superficie celular SSCA procedentes del aparato citocentrífugo. Observe lo aisladas que están las células unas de otras, lo que permite observaciones y registros a nivel de célula individual.

Lo bueno de este protocolo es que es capaz de reproducir una monocapa de células factible, rentable y fácilmente adaptable para cualquier análisis rutinario de cultivos de células madre. Con esto, espero que este video les sea útil y encuentren el protocolo de utilidad en su propia investigación.