Name: Análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de Self-Made Cytospin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a realizar inmunocitoquímica en células madre pluripotentes humanas utilizando un aparato de cytospin casero. Este método económico permite crear monocapas celulares para cuantificar marcadores de superficie como SSEA-3 y SSEA-4.

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Parte de los fondos para este trabajo fue proporcionado por la NSF CARRERA 0744556 (Rao) y una beca a través de la Educación-UCV HHMI Ciencia e Investigación (Pascual).

Parte 1: La tinción inmunocitoquímica de suspensión <ol><li> Las células se recogen en una suspensión de células individuales. </li><li> Las células se transfieren a tubos de microcentrífuga de 1,5 2 ml y se centrifuga a 200 g durante 4 minutos. </li><li> Se lavan las células mediante la aspiración de sobrenadante, se resuspendieron en 1 ml de PBS - (sin Mg 2 + y Ca 2 +) y luego se centrifuga de nuevo a 200 g durante 4 minutos. Esto debe hacerse dos veces. </li><li> Después del lavado, las células se fijan por la re-suspensión en paraformaldehído% 1 ml de 4 (PFA) a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Las células se lavan de nuevo dos veces con 1 ml de PBS -. </li><li> Después de lavar las células bloque, por volver a suspender en 1 ml de solución de bloque (6% serum/94% PBS -). Incubar estos a temperatura ambiente durante 45 minutos. </li><li> Después, centrifugar los tubos a 200 g durante 4 minutos y aspirar a la solución de bloque. Vuelva a suspender las células en 1 ml de la solución de anticuerpo primario (hecho con la solución de bloque a la dilución recomendada). Las células pueden ser incubados a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 ° C durante la noche antes de proceder al siguiente paso. </li><li> Las células se lavan dos veces con 1 ml de solución de bloque. </li><li> Después, volver a suspender las células en 1 ml de solución de anticuerpo secundario (hecho con la solución de bloque a la dilución recomendada) e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Después de 1 hora, las células se deben lavar de nuevo dos veces con 1 ml de solución de bloque. </li><li> Después de lavar con solución de bloque, lavar las células de nuevo con 1 ml de PBS -. </li><li> Después de los lavados diferentes, volver a suspender las células en 1 ml de DAPI tinción nuclear (1:10.000 dilución de DAPI en PBS -) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Después de 5 minutos, centrifugar los tubos a 200 g durante 4 minutos. Aspirar la solución de DAPI nuclear mancha y volver a suspender las células en 1 ml de PBS -. </li></ol> Parte 2: Incorporación de hPSCs en las diapositivas generadas por el aparato citospina <ol><li> Toboganes de plástico son preparados por lo que la cantidad deseada de agujeros con un taladro. El diámetro debe ser como máximo de 1 mm más grande que el diámetro más ancho de la punta de la micropipeta (s) que se utilizará. </li><li> Papel de filtro se corta a los parámetros de la corredera de plástico con unas tijeras. </li><li> Entonces se hacen agujeros en el papel de filtro. El tamaño del agujero (s) debe ser lo suficientemente grande que la punta de la micropipeta (s) queda a su medida a través de él. </li><li> Después, uno de los toboganes de plástico preparado se coloca en la parte superior y una lámina de vidrio en colocar en la parte inferior del papel de filtro de corte (Figura 1). Las capas están asegurados con cinta adhesiva. </li><li> Un máximo de 100μL (dependiendo de la densidad deseada monocapa) de la suspensión de células manchadas de la parte 1 se coloca en la parte superior de la punta de la micropipeta (s). </li><li> Si es necesario, el aparato con una solución de células pueden ser pesados ​​y crearon un contrapeso de un peso similar. </li><li> El aparato citospina y contrarrestar pueden se colocan en una centrífuga de sobremesa y se centrifuga a 200 g durante 4 minutos. </li><li> Después de la centrifugación, el aparato ha sido cuidadosamente citospina desmontado de una manera que doesnt caer las células de la lámina de vidrio. </li><li> Si es necesario, el exceso de PBS alrededores - en el lado de vidrio en aspirado a cabo. </li><li> Las células se pueden ver utilizando un microscopio de fluorescencia para comprobar si la monocapa celular deseado ha sido alcanzado. </li></ol> Parte 3: Montaje de diapositivas <ol><li> Una caída de los medios de montaje deseada se coloca directamente en el centro de cada área que contiene las células. </li><li> Después, una hoja de cubierta es suave baja en las diapositivas tratando de evitar burbujas de aire si es posible. </li><li> El exceso de medios de montaje se elimina a partir de diapositivas. </li><li> Después, los laterales de la cubierta se desliza se sellan con esmalte de uñas. </li><li> Las diapositivas se pueden mantener en un área de almacenamiento en la oscuridad hasta que los resultados son observados y documentados. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

A los efectos de nuestro laboratorio, un plato de 35 mm de cultivos de células madre cultivadas en fibroblastos de ratón embrionario (MEFs) es asignado para el procedimiento de tinción inmunohistoquímica para su uso con el aparato cytospin. Las células se recogen por medio de pases enzimática, eliminar la mayor cantidad de la capa de MEF como sea posible, en una suspensión de una sola célula. Si más eficaz de aislamiento de células madre de la capa de MEF se desea, las colonias pueden ser recogidos manualmente después s...

<table><tbody><tr><td>Placa con cámara Lab Tek Permanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>Material para placas de plástico reutilizadas</td></tr><tr><td>Placas microscópicas Superfrost/Plus precleaned</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Puntas filtrantes de 0,1-10&amp;mu;L</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos microscópicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>Medio de montaje</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal ratón anti-SSEA-4</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>Anticuerpo primario para tinción de SSEA-4</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal rata anti-SSEA-3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>Anticuerpo primario para tinción de SSEA-3</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG de cabra anti-ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Anticuerpo secundario para tinción de SSEA-4</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 marcado IgG de cabra anti-rata</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Anticuerpo secundario para tinción de SSEA-3</td></tr><tr><td>DAPI, dihidrocloruro</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de self-made cytospin

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Las células madre pluripotentes (hPSCs) que incluyen células madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) son una fuente interesante de células debido a su ilimitada capacidad de auto-renovación y su potencial de diferenciarse en múltiples tipos de células. El estado pluripotente de hPSCs se suele evaluar mediante técnicas como la PCR cuantitativa, inmunocitoquímica, y por otros<em&gt; In vitro</em&gt; Y<em&gt; In vivo</em&gt; Estrategias de diferenciación en múltiples tipos de células. Entre ellas, las técnicas de inmunohistoquímica se han desarrollado para la caracterización de rutina del estado indiferenciado de hPSCs basado en el análisis de biomarcadores candidatos intracelular y la superficie celular. Teniendo en cuenta el hecho de que hPSCs crecen como colonias, los problemas surgen en la cuantificación de la expresión de estos marcadores en el nivel de células individuales en forma rutinaria. Análisis de citometría de flujo sirven para solucionar este problema, pero requieren el número de células y el uso de reactivos que normalmente no son propicias para la evaluación de rutina de control de calidad de las culturas hPSC. Por lo tanto, el desarrollo de medios prácticos y reproducible de la creación de muestras monocapa de células con integridad conservado para la evaluación de marcadores tiene muchas ventajas en la investigación con células madre. Esto beneficia en gran medida el análisis inmunocitoquímico, porque las células individuales de la monocapa pueden ser fácilmente observados y cuantificados para la expresión de marcadores específicos. Para lograr este objetivo, un aparato hecho a sí mismo citospina fue construido y optimizado para su uso con la tinción inmunohistoquímica. Dos marcadores de la superficie celular (SSEA3/SSEA4) la expresión se analizaron en una línea de células madre variante BG01 con el propósito de este protocolo.

Tinción inmunohistoquímica suspensión de las células madre pluripotentes (hPSCs) para los marcadores de la superficie celular (SSEA-3/SSEA-4) se logró basada en el uso de un aparato hecho a sí mismo citospina para crear una monocapa de células para la observación y cuantificación.

Análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de Self-Made Cytospin

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC), que incluyen las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), son células fascinantes...

Hola, mi nombre es Rick Pasqua, estudiante del Laboratorio de Ingeniería de Células Madre en el Departamento de Ciencias Químicas y de la Vida de la Universidad Estatal de Virginia. En este video, demostraré cómo nuestro laboratorio utiliza un aparato de centrifugación STO económico y hecho en casa para crear una monocapa observable de células madre pluripotentes humanas con el fin de cuantificar marcadores de superficie celular. Dado que muchos protocolos inmuniquímicos se adaptan para células PSC humanas cultivadas en láminas con cámaras en forma de colonias, pueden surgir problemas al caracterizar la expresión de los biomarcadores a nivel celular individual.Tener las células en una monocapa facilita no solo el análisis visual de estas, sino posiblemente también la cuantificación de su expresión; el aparato de espín sinusal que utilizan nuestros laboratorios puede construirse con materiales disponibles en la mayoría de los laboratorios, solo requiere una pequeña muestra de células y no necesita ningún tipo de reactivo específico. Y lo más importante, es capaz de reproducir de forma confiable una distribución de células individuales para su observación. A continuación, se indican

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Inmunocitoquímica es un poderoso método para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitan una para conservar los anticuerpos y sacar el máximo provecho de su coloración.

Inmunocitoquímica: células madre neurales humanas

Las células madre pluripotenciales de crecimiento en suspensión se diferencian en cuerpos embrioides (EBS). Aquí se demuestra cómo obtener alta calidad cryosections EB útil para el estudio de los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis, mientras que la preservación de su organización en forma de agregados.

El análisis de las células madre pluripotentes utilizando criosecciones de cuerpos embrioides

Este video muestra un ensayo para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Las iPSC humanas son inducidas a formar cuerpos embrioides (EB). Las EB se cultivan sobre un andamio de polímero utilizando un medio de inducción, lo que promueve la diferenciación en células madre neurales, células progenitoras y neuronas inmaduras. Finalmente, los EB se incrustan en una matriz y se transfieren a un medio de mantenimiento para la formación de organoides...

Generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Este protocolo proporciona una forma sencilla y eficiente de propagar células madre pluripotentes humanas (hPSCs) utilizando solo medios condicionados derivados de la placenta humana en un plato recubierto de gelatina sin suplementación exógena adicional o sustratos sintéticos específicos de hPSC.

Una Cultura Modelo Novela de Pluripotentes Stem Cell Propagación de gelatina en Media Placenta acondicionado

La caracterización regular de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), para determinar el mantenimiento de su estado pluripotente, es un paso importante antes de que estas células se utilicen para otras aplicaciones. En este trabajo describimos un método para la propagación a pequeña escala de iPSCs humanas diseñado específicamente para permitir su caracterización fácil y rutinaria a través de inmunocitoquímica.

Propagación de pequeña escala de iPSCs humano en condiciones sin suero para la caracterización inmunocitoquímica de rutina

Este Protocolo introduce un método de dos pasos simples para diferenciar células epiteliales limbares córneas de células de vástago pluripotent humana bajo condiciones de cultivo libre de xeno - y alimentador. Los métodos de cultivo celular presentados aquí permiten la producción a gran escala, costo-eficiente de células de calidad clínica aplicables al uso de terapia celular corneal.

Eficiente y escalable diferenciación dirigida de clínico Compatible córnea Limbal epitelial las células madre de células madre pluripotentes humanas

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Aquí, presentamos un protocolo para un sistema automatizado de cultivo celular. Este sistema de cultivo automatizado reduce la mano de obra y beneficia a los usuarios, incluidos los investigadores que no están familiarizados con el manejo de células madre pluripotentes inducidas (iPS), desde el mantenimiento de las células iPS hasta la diferenciación en varios tipos de células.

Un sistema de cultivo automatizado para mantener y diferenciar células madre pluripotentes inducidas por humanos

Aprende a realizar inmunocitoquímica en células madre pluripotentes humanas utilizando un aparato de cytospin casero. Este método económico permite crear monocapas celulares para cuantificar marcadores de superficie como SSEA-3 y SSEA-4.

Análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de Self-Made Cytospin

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