Análisis inmunocitoquímico de las células madre pluripotentes utilizando un aparato de Self-Made Cytospin

Hola, mi nombre es Rick Pasqua, estudiante del Laboratorio de Ingeniería de Células Madre aquí en el Departamento de Ciencias Químicas y de la Vida de la Universidad de la Commonwealth de Virginia. En este video, demostraré cómo nuestro laboratorio utiliza un aparato de espín STO barato y de fabricación propia para crear una monocapa observable de células madre pluripotentes humanas para la cuantificación de marcadores de superficie celular. Dado que muchos protocolos INMUNOQUÍMICOS están adaptados para las PSC h cultivadas en portaobjetos de cámara como colonias, pueden surgir problemas en la caracterización de la expresión de los biomarcadores a nivel de célula individual.

Tener las células en una monocapa ayuda no solo en el análisis visual de estas, sino posiblemente también en la cuantificación de su expresión, el aparato de espín sinusal que utilizan nuestros laboratorios se puede construir utilizando materiales que se encuentran en la mayoría de los laboratorios, solo necesita una muestra de células pequeñas y no necesita ningún tipo de reactivo específico. Y, lo que es más importante, es capaz de reproducir de forma fiable una dispersión de células individuales para su observación. Estas son algunas de las cosas que necesitarás para construir el aparato de citosina.

Los portaobjetos de plástico, dado que no necesariamente tienen que estar limpios, puedes usar toboganes de cámara viejos si lo deseas. Portaobjetos de vidrio previamente limpiados. Estos deben limpiarse porque aquí será donde se creará la monocapa de celda.

Papel de filtro, cualquier tipo debe servir, y puntas de micro pipeta. Puntas de uno a 10 microlitros es lo que nuestro laboratorio utiliza antes de que pueda comenzar la construcción. Primero se deben hacer agujeros en los portaobjetos de plástico.

Esto se puede hacer usando una taladradora. El diámetro de los orificios depende del tamaño de la punta de la micropipeta y debe ser aproximadamente el ancho de la sección más ancha de la punta utilizada para una punta de micropipeta estándar de una a 10 micropipetas. Esto debería estar en alrededor de siete milímetros.

La cantidad de agujeros que cree en los portaobjetos de plástico depende completamente del uso que le vaya. Para la tinción inmunoquímica de nuestro laboratorio, por ejemplo, solemos utilizar dos orificios, uno para la tinción positiva y otro para el control de fondo negativo. Estas diapositivas se pueden reutilizar por una cantidad indefinida de veces.

Para el papel de filtro, simplemente corte un trozo de él según los parámetros del portaobjetos de plástico. Usa los agujeros de la corredera como referencia para hacer agujeros en el papel de filtro. El tamaño del orificio del papel de filtro debe ser lo suficientemente grande como para que la punta de la micropipeta pueda encajar perfectamente, como se muestra aquí.

A continuación, tenemos que cortar el número adecuado de puntas de micropipeta, una para cada orificio con aproximadamente la mitad de su longitud. Esto servirá como base de la diapositiva de vidrio donde se creará la capa mono celular. A continuación, se colocará el papel de filtro encima de esto.

El papel de filtro servirá para absorber el exceso de medio de la mancha de la suspensión. A continuación, se completará con la corredera de plástico que servirá de soporte sólido del aparato. A continuación, se puede sellar por los cuatro lados con cinta adhesiva doméstica normal.

Finalmente, las puntas de las micropipetas enteras se insertan en las puntas de corte del aparato. Aquí será donde se colocarán las muestras celulares después de la tinción en suspensión. También puede ser útil marcar inicialmente en qué parte del portaobjetos de vidrio están las puntas de corte para un reconocimiento más conveniente.

El protocolo de tinción inmunoquímica en suspensión que utiliza nuestro laboratorio implica primero la recolección de células madre en una suspensión de una sola célula, generalmente realizada mediante enzimáticos, utilizando tripsina o tampones de disociación celular no enzimáticos basados en EDTA. A continuación, las células se transfieren a tubos de microcentrífuga de dos ml y su medio de crecimiento estándar. A continuación, se centrifugan a 200 G durante cuatro minutos.

Se utilizará la misma velocidad de centrifugación para todas las etapas de lavado y centrifugado posteriores. A continuación, el medio se aspira manualmente, tenga mucho cuidado al aspirar para asegurarse de que el pellet de la célula no se altere. A continuación, se lava con un ml de PBS dos veces girando hacia abajo y aspirando cada vez.

El siguiente paso consiste en fijar las células utilizando el 4% de formaldehído o los reactivos PFA necesarios para hacer esto o que se enumeran en el artículo adjunto a este video. Las células se incuban en la solución de formaldehído al 4% y se dejan a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se recomienda que este paso se lleve a cabo antes de la suspensión ex extracelular, tinción para el uso del aparato de citoespín.

Posteriormente, las células se lavan dos veces con PBS para eliminar los restos de PFA. A continuación, se debe bloquear la célula para evitar tinciones inespecíficas. Después de los lavados de PBS en el paso anterior, aspire el lavado y agregue un ml de la solución de bloqueo.

A continuación, debe dejarse a temperatura ambiente durante unos 45 minutos. Mientras espera la solución de bloqueo, puede preparar el anticuerpo primario diluyéndolo hasta la solución de dilución y bloqueo recomendada. Guárdelo a cuatro grados centígrados.

Después de que las células hayan estado en la solución de bloqueo durante unos 45 minutos, gire hacia abajo y aspire esto y vuelva a suspenderlas en la solución de anticuerpos primarios. Con el fin de detectar la unión no específica y el control de fondo, es mejor mantener al menos una muestra como negativa. No se aplicó ningún anticuerpo primario y simplemente se suspende en PBS.

Todas las muestras se dejan a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. Si se desea, las células fijas pueden dejarse en suspensión en la solución de anticuerpos primarios durante la noche y lavarse dos veces con solución de bloqueo. La solución de anticuerpos secundarios se puede producir mientras se realiza el lavado.

Los anticuerpos secundarios suelen ser sensibles a la luz, por lo que, si es posible, tenue las luces de laboratorio y cubra los recipientes utilizados con papel de aluminio, esto se hace para evitar el blanqueo por fluorescencia. Los reactivos Antifa se pueden incorporar al protocolo, pero se debe tener cuidado en su uso, ya que puede resultar en un fondo más alto como el anticuerpo primario diluido a la concentración recomendada en una solución bloqueante. Aplique una vis a todas las muestras, ya sea que se les haya agregado o no primario después de completar el lavado.

Déjalo reposar en un área oscura, como dentro de un frasco, durante aproximadamente una hora. Lave las células con un ml de solución bloqueante dos veces. La célula ahora debería estar lista para la tinción nuclear con tinte DPI.

Prepare la solución de DPI en una dilución de uno a 10,000 en PBS inicialmente, lave las células en un ml de PBS una vez, luego resus, suspenda en ppp y deje reposar a temperatura ambiente durante unos cinco a 10 minutos. Al igual que el anticuerpo secundario, DAPI es sensible a la luz, por lo que debe realizar los ajustes necesarios para evitar la fluorescencia y el blanqueo. Lavar una vez con un ml de PBS y por último, reutilizar.

Suspender de nuevo en un ml de PBS. A continuación, debería estar listo para su uso con un aparato de centrifugado. Coloque un máximo de 100 microlitros de la solución de una sola célula en la parte superior de las puntas de las micropipetas.

Sin embargo, se recomienda una cantidad menor para evitar desbordamientos o goteos innecesarios. Después. Coloque un aparato de centrifugado y el contrapeso en una centrífuga de escritorio y gire a 1000 RPM durante cuatro minutos. A continuación, desmonte con cuidado el aparato de centrifugado de forma que se minimice la posibilidad de que las células se desprendan del portaobjetos de vidrio.

Verifique que se haya colocado de pie bajo el microscopio de fluorescencia antes de montar. Estas son imágenes tomadas de una monocapa de BG una célula V teñida con marcadores de superficie de cuatro células SSCA del aparato de citoespín. Observe lo aisladas que están las celdas entre sí, lo que hace posible las observaciones y el registro de una sola célula.

Lo bueno de este protocolo es que es capaz de reproducir una célula monocapa que es factible, rentable y fácilmente adaptable para cualquier análisis rutinario de cultivos de células madre. Así que con eso, espero que dibujes este video y encuentres el protocolo de uso en tu propia investigación.