Crónico Salmonella Modelo de ratón infectado

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo de ratón crónicamente infectado con salmonela. Esto se logra primero preparando una solución de salmonela. El segundo paso del procedimiento consiste en administrar por gavaje estreptomicina a los ratones, seguida de salmonela, o solo estreptomicina.

El tercer paso del procedimiento consiste en aislar Salmonella a partir de materia fecal de ratón y detectar la infección por Salmonella en el intestino del ratón utilizando placas cromogénicas BL. El paso final del procedimiento es observar y registrar la masa corporal del ratón y anotar los cambios en la vitalidad tras la infección por Salmonella. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que puede establecerse una infección por Salmonella en el intestino de ratones inoculados por vía de gavaje con Salmonella.

Hola, soy Michelle P del laboratorio del Dr. Johnson del Departamento de Medicina de la Universidad de Rochester. También soy del Laboratorio Sun y soy Y del Laboratorio Sun. Hoy les mostraremos un procedimiento para establecer un modelo de masa infectada con Alytic Lennar.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la transducción de señales en la interacción huésped-bacteria y la génesis tumoral. Comencemos. Antes de la experimentación, prepare suficientes placas de caldo luria, berti o LB para cada cepa de salmonella y para usar durante todo el experimento.

Las placas pueden refrigerarse y almacenarse durante varios meses. A continuación, prepare el cultivo de salmonela. Retire un vial del stock de salmonela congelado a menos 80 grados Celsius y déjelo descongelar sobre la superficie de trabajo para sembrar la salmonela por llama.

Coloque un asa de inoculación en la llama de un mechero Bunsen y sumérjala en el stock bacteriano descongelado. Trace líneas en zigzag con el asa de un lado a otro en el tercio superior de la placa de LB. Flamee nuevamente el asa y gire la placa.

Realice un movimiento en zigzag con el asa para cruzar las estrías previas y distribuir las bacterias sobre el segundo tercio de la placa. Repita una vez más. Vuelva a flamear el asa.

No permita que el asa penetre en el agar. Deje crecer las colonias almacenando las placas en una incubadora a 37 grados Celsius durante la noche. Si se realiza correctamente, la placa de salmonela debe producir colonias individuales en al menos una sección.

Al día siguiente, seleccione un clon de la placa de LB utilizando un palillo estéril o un asa bacteriológica y colóquelo en siete mililitros de LB en un tubo de 12 mililitros. Agite el tubo a 37 grados Celsius durante aproximadamente cinco horas.

Utilice 0,05 mililitros de este cultivo para inocular 50 mililitros de LB en un tubo Falcon. Incube a 37 grados Celsius sin agitación durante aproximadamente 18 horas.

Centrifugar el cultivo bacteriano de 50 mililitros durante la noche a temperatura ambiente a 5.000 RPM durante 10 minutos y desechar el sobrenadante. A continuación, añadir 1,5 mililitros de solución salina tamponada con Hank o HBSS al tubo para resuspender las bacterias, o 100 partes de LB a tres partes de HBSS. Luego llevar el volumen total a 15 mililitros con HBSS o una proporción de uno a 10 de LB respecto a HBSS.

Cada ratón requiere 100 microlitros de cultivo diluido de salmonela, o entre uno por diez a la seis y uno por diez a la ocho unidades formadoras de colonias, antes de iniciar la retirada de agua y alimento de los ratones cuatro horas previas al experimento. Luego, prepare inmediatamente antes de la gavaje una solución de estreptomicina diluyendo 7,5 miligramos de estreptomicina en polvo en 100 microlitros de HBSS. Para cada ratón inyectado, asegúrese de preparar un volumen adicional para compensar las pérdidas antes de la administración por gavaje.

Primero, prepare una aguja de alimentación con 100 microlitros de solución de estreptomicina. Saque el primer ratón de la jaula para administrarle la gavaje y sostenga al ratón con la cara hacia la superficie del banco. Agarre firmemente la piel sobre el hombro del ratón con el pulgar y el dedo medio, estirando la cabeza y el cuello con el dedo índice para alinear el esófago.

Dirija la punta esférica de la aguja de alimentación a lo largo del paladar y hacia el lado derecho de la parte posterior de la faringe. Luego, pásela suavemente hacia abajo dentro del esófago e inyecte los 100 microlitros de solución de estreptomicina. No se debe sentir ninguna resistencia.

Repita este procedimiento para todos los ratones experimentales y de control sometidos a experimentación. Aproximadamente 20 horas después de la strp de m y la administración por cánula, y cuatro horas antes de la administración oral de salmonella por cánula, retire el agua y la comida de los ratones que recibirán salmonella por cánula. Administre por cánula a cada ratón de la misma manera que antes, utilizando 100 microlitros de solución de salmonella en HBSS.

Después de la administración por gavaje, transfiera cada ratón a una nueva jaula para comenzar la recolección de heces. A partir de aproximadamente ocho horas después del gavaje, retire inmediatamente las heces de la jaula tras la defecación. Recolecte 100 miligramos de materia fecal de ratón como muestra experimental.

Recolecte muestras diariamente o semanalmente, según la duración del estudio, para el análisis de salmonela en materia fecal. Transfiera la muestra fecal a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros con un mililitro de PBS y vortexe vigorosamente durante 10 minutos a 800 RPM. Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1,5 mililitros y centrifugue a 6.000 RPM durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros de PBS a los pellet; vortexee para resuspender. A continuación, detecte *Salmonella* con una placa BB l roag. Utilice de 10 a 100 microlitros de solución de materia fecal por placa, extendiéndola sobre la placa como se muestra en la sección dos.

Las especies de salmonela aparecen de color morado debido a diferencias metabólicas en presencia de cromógenos seleccionados. Cuente las colonias de salmonela en la placa para comparar el nivel de infección entre ratones individuales. En este procedimiento experimental utilizamos ratones hembras C 57 negro seis libres de patógenos específicos, con una edad de seis a siete semanas.

Los ratones fueron infectados con salmonela y estreptomicina más HBSS. Los ratones recibieron por gavaje controlado solo estreptomicina; las cepas de salmonela utilizadas incluyen la cepa silvestre de Salmonella typhimurium, ATCC 1 4 0 2 8 S FP C, una cepa mutante no patógena de salmonela y tres cepas FPC del laboratorio del Dr. James Madera que portan el gen de virulencia asociado AAV R age en el plásmido de baja copia PSKW 29. Mediante este protocolo, puede detectarse la colonización por Salmonella tyrian en el intestino del ratón.

La infección crónica por salmonela se midió mediante el análisis de materia fecal y se recolectaron muestras de peso corporal y de tejido intestinal para tinción inmunofluorescente. Típicamente, la pérdida de peso corporal y la muerte ocurren dentro de las cuatro semanas posteriores a la infección. Aquí se muestran las proporciones de supervivencia a las cuatro semanas posteriores a la infección.

Una vez que los ratones sobreviven cuatro semanas después de la infección, aumentan de peso corporal y la incidencia de muerte disminuye durante las 23 semanas restantes. En general, más del 65 % de los ratones infectados con cepas de Salmonella, FSY fsy, A VRA nula o fsy. A VRA heterocigota pueden sobrevivir más de seis meses con una infección persistente de Salmonella en el intestino.

Después de la infección aguda, los sobrevivientes aún portaban salmonela, que podía detectarse seis meses después de la infección mediante el método descrito en este protocolo. El análisis de inmunofluorescencia de muestras de tejido del intestino de ratón muestra la invasión de salmonela en la mucosa intestinal a las 27 semanas posteriores a la infección. En esta imagen, los núcleos están teñidos en azul y las células infectadas con salmonela se muestran en verde.

Como se muestra en el grupo control, no hay tinción verde brillante, lo que indica ausencia de colonización por salmonela. En cambio, en los ratones infectados con salmonela a las 27 semanas posteriores a la infección, se observa tinción verde brillante en la mucosa intestinal. Esto muestra la persistencia de la infección por salmonela en el ratón previamente tratado con estreptomicina.

Acabamos de mostrarle cómo inducir una infección crónica en algunos modelos de ratón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar un cultivo fresco para el garaje, las habilidades correctas de garaje y detectar la presencia de ANA para asegurarse de que su modelo experimental funcione. Eso es todo.

Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.