Name: Crónico Salmonella Modelo de ratón infectado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende a establecer un modelo crónico de infección por Salmonella en ratones mediante gavage con estreptomicina y detección en placas BL. Este método permite estudiar la colonización intestinal persistente durante 27 semanas.

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Este trabajo fue apoyado por el NIDDK KO1 DK075386 subvención y la Sociedad Americana del Cáncer RSG-09-075-01-MBC de junio dom

Este protocolo incluye tres partes: la detección de un cultivo bacteriano, una sonda de ratón, y Salmonella. 1. Salmonella condiciones de crecimiento. <ol><li> Prepare la Salmonella caldo Luria-Bertani (LB) placa, se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Elige un clon de la placa de LB y puesto en LB 7 ml en un tubo de 12 ml y agitar a 37 º C durante 5 horas. </li><li> Inocular 50 ml de LB con 0,05 ml de un cultivo en fase estacionaria y se incuba a 37 ° C sin agitación durante aproximadamente 18 horas. </li><li> Giro cultivo bacteriano durante la noche a temperatura ambiente con 6000 rpm durante 10 minutos, suspender las bacterias en HBSS con relación 100:3 (LB: HBSS). Por ejemplo: Cada cultura LB 50 ml se suspenderá en 1,5 ml HBSS. </li><li> Para la alimentación forzada de animales, diluir aún más el cultivo bacteriano en una proporción de 1:10. Por ejemplo: Todas las culturas de 1,5 ml LB será suspendido en 15 ml HBSS. </li></ol> 2. Salmonella infección modelo *. <ol><li> Prepare la solución de estreptomicina. Cada ratón se le dará 7,5 mg de estreptomicina en 100 l HBSS. Por ejemplo, prepare un total de 90 mg de estreptomicina en 1,2 ml de HBSS 10 ratones. Siempre tienen algo de volumen extra en la preparación de la solución de estreptomicina. </li><li> Retirar el agua y la comida 4 horas antes del tratamiento de una sonda nasogástrica. </li><li> Ratones sonda con estreptomicina con 7,5 mg de estreptomicina (100 l de HBSS para los ratones de control). Coge la piel sobre el hombro del ratón firmemente con el pulgar y el dedo medio, estirar la cabeza y el cuello con el dedo índice para hacer que el esófago directamente. Dirigir el balón de punta de la aguja de alimentación a lo largo del techo de la boca y hacia el lado derecho de la parte posterior de la faringe, y luego suavemente pase hacia el esófago y se inyecta la solución de 100 l. No hay resistencia se debe sentir. </li><li> A las 20 horas después del tratamiento con estreptomicina, el agua extraída y la comida de nuevo antes de los ratones infectados con la bacteria. </li><li> Sonda cada ratón con 100 l de suspensión en HBSS o tratados con HBSS estéril (control) mediante una sonda nasogástrica. El procedimiento de alimentación forzada es lo mismo que 2.3) ratones sonda con estreptomicina. </li></ol> * Experimentos con animales se realizaron mediante el uso de patógenos específicos libre C57BL mujeres / 6 ratones (Taconic, Hudson, Nueva York), que fueron 6-7 semanas de edad, como se describió anteriormente 1. El protocolo fue aprobado por la Universidad de la Universidad de Rochester Comité de Recursos Animales (UCAR). 3. La detección de Salmonella en el intestino. <ol><li> Recoger las heces de ratón (100 mg). </li><li> Transferencia de la muestra fecal en un tubo de centrífuga de 1,5 micro con 1 ml de PBS y agitar vigorosamente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 rpm. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio. </li><li> Centrifugación a 6000 rpm durante 5 minutos. Sobrenadante se descarta y 200 l de PBS se añade a los gránulos y vortex. </li><li> La racha de 200 l de PBS con un esparcidor celular desechable en una placa BBL CHROMagar para detectar Salmonella. Especies de Salmonella aparecen de color malva (rosa a púrpura, ver figura 1). Si los rendimientos de 200 l colonias demasiados en la placa, utilice 100 l ó 50 l durante la racha. </li></ol> 4. Los resultados representativos. Cuando el protocolo se hace correctamente, Salmonella typhimurium colonización se puede detectar en el intestino del ratón más de 6 meses. Salmonella pueden ser detectados por cultivo fecal más de 6 meses (Fig. 1). Como fuera típica vienen de este modelo, el cuerpo de pérdida de peso y la muerte ocurren dentro de las 4 semanas después de la infección. Depende de las cepas de Salmonella utilizados para la infección, algunos ratones no pueden sobrevivir más de 6 meses. <img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Salmonella Intestinal en la especie Salmonella aparecen de color malva (rosa a púrpura) en color, debido a las diferencias metabólicas en presencia de cromógenos seleccionado. Otras bacterias son inhibidas o producen colonias de color azul-verdoso o incoloro. <img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Proporciones de supervivencia de ratones infectados con Salmonella cepa mutante c PhoP, PhoP c Avra, y PhoP c AvrA-/AvrA +, c PhoP Avra durante 4 semanas (28 días). Tabla 1. Peso corporal de los ratones infectados con Salmonella durante 4 semanas. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 </td><td> 1 semana </td><td> 2 semanas </td><td> 3 semanas </td><td> 4 semanas </td></tr><tr><td> control </td><td> 16,78 ± 1,05 </td><td> 16,91 ± 1,28 </td><td> 18,26 ± 1,23 </td><td> 19,31 ± 1,26 </td><td> 20,26 ± 1,15 </td></tr><tr><td> PhoP c </td> 16,89 ± 1,03 <td> 17,14 ± 1,19 </td><td> 17,43 ± 1,63 * </td><td> 18,68 ± 1,78 </td><td> 20,05 ± 1,11 </td></tr><tr><td> PhoP c Avra- </td><td> 16,91 ± 1,12 </td><td> 16,96 ± 1,39 </td><td> 17,06 ± 2,14 ** </td><td> 18,71 ± 2,18 </td><td> 20,15 ± 1,56 </td></tr><tr><td> PhoP c AvrA-/AvrA + </td><td> 16,94 ± 0,96 </td><td> 17,17 ± 1,02 </td><td> 17,63 ± 1,42 * </td><td> 18,44 ± 2,03 </td><td> 20,09 ± 1,17 </td></tr></tbody></table> * En comparación con el grupo control p &lt;0,05 ** En comparación con el grupo control p &lt;0,01 Tabla 2. Cepas de Salmonella utilizada en este estudio. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Descripción </td><td> Referencia o fuente </td></tr><tr><td> Salmonella 14028s </td><td> De tipo salvaje S. typhimurium </td><td> ATCC </td></tr><tr><td> PhoP c </td><td> No patógenos mutantes regulador complejo </td><td> Miller et al., 1990 </td></tr><tr><td> PhoP c Avra- </td><td> Avra-mutación </td><td> Collier-Hyams et al., 2002 </td></tr><tr><td> PhoP c AvrA-/AvrA + </td><td> PhoP c Avra Avra complementa con plásmido que codifica </td><td> Collier-Hyams et al., 2002 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+activity+negatively+regulates+bacteria-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation.</a> Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).</li>
<li>Barthel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Miller, S. I., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+the+phoP+regulon+attenuates+Salmonella+virulence+and+survival+within+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages.</a> Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).</li>
<li>Valdez, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+expression+by+dendritic+cells+modulates+inflammatory+responses+during+Salmonella+Typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).</li>
<li>Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+Salmonella+colitis+with+features+of+diarrhea+in+SLC11A1+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).</li>
<li>Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+call-and-response%3A+how+Salmonella+learns+the+gospel+from+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host.</a> Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).</li>
<li>Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions%3A+Host+resistance+factor+Nramp1+up-regulates+the+expression+of+Salmonella+pathogenicity+island-2+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).</li>
<li>Townsend, P., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Animal+Care+Policies+and+Regulations%3A+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom.</a> ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+endpoints+for+infectious+disease+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Humane endpoints for infectious disease animal models.</a> ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+effector+AvrA+regulation+of+colonic+epithelial+cell+inflammation+by+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination.</a> Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enteric+salmonella+infection+in+mice+leads+to+severe+and+persiste+nt+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+murine+model+of+chronic+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Development of a murine model of chronic Salmonella infection.</a> Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).</li>
<li>Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).</li>
<li>Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+effects+of+a+Salmonella+type+III+secretion+effector+protein+AvrA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo.</a> PLoS ONE. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Para utilizar este sistema, es necesario que el investigador que aprender a alimentación forzada de los animales. Se detalla una metodología para preparar un cultivo bacteriano y alimentación forzada de los ratones. También muestra cómo controlar la persistencia de Salmonella en el tracto gastrointestinal (GI). Los pasos críticos de este protocolo, incluyendo: <ol><li> Estreptomicina pretratamiento: estreptomicina pretratamiento podría deshacerse de algunos flora intestinal comensal y que los ratones suscep...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria-Bertani</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de alimentación</td><td>Popper &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina </td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr><tr><td>BBL CHROMagar &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>214983</td><td></td></tr><tr><td>Esparcidores celulares desechables</td><td>Biologix Research Company</td><td>65-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

crónico salmonella modelo de ratón infectado

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

El modelo de ratón infectado de bacterias es un sistema poderoso modelo para el estudio de áreas tales como infección, inflamación, la inmunología, la transducción de señales y tumorigénesis. Muchos investigadores han tomado ventaja de la colitis inducida por<em&gt; Salmonella</em&gt; Typhimurium para los estudios en la fase temprana de la inflamación y la infección. Sin embargo, sólo unos pocos informes se encuentran en la infección crónica<em&gt; In vivo</em&gt;. Los ratones con<em&gt; Salmonella</emExistencia&gt; persistente en el tracto gastrointestinal nos permiten explorar el anfitrión-bacterial interacción a largo plazo, la transducción de señales y tumorigénesis. Hemos establecido un modelo de crónica bacteriana ratones infectados con el<em&gt; Salmonella</em&gt; Typhimurium colonización en el intestino del ratón más de 6 meses. Para utilizar este sistema, es necesario que el investigador para aprender a preparar el cultivo de bacterias y alimentación forzada de los animales. Se detalla una metodología para el cultivo de bacterias y preparar a los ratones por sonda nasogástrica. También muestra la forma de detectar la<em&gt; Salmonella</em&gt; Persistencia en el tracto gastrointestinal. En términos generales, este protocolo ayudará a los investigadores con el modelo de ratón infectado de bacterias para hacer frente a cuestiones biológicas y microbiológicas de fundamental importancia.

Establecer un modelo de crónica bacteriana ratones infectados con el persistente<em&gt; Salmonella</em&gt; Typhimurium colonización en el intestino durante 27 semanas.

Crónico Salmonella Modelo de ratón infectado

El modelo de ratón infectado por bacterias es un sistema modelo potente para estudiar áreas como la infección, la inflamación, la inmunología, la transducción de señales y...

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo de ratón crónicamente infectado con salmonela. Esto se logra primero preparando una solución de salmonela. El segundo paso del procedimiento consiste en administrar por gavaje estreptomicina a los ratones, seguida de salmonela, o solo estreptomicina.El tercer paso del procedimiento consiste en aislar Salmonella a partir de materia fecal de ratón y detectar la infección por Salmonella en el intestino del ratón utilizando placas cromogénicas BL. El paso final del procedimiento es observar y registrar la masa corporal del ratón y anotar los cambios en la vitalidad tras la infección por Salmonella. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran que puede establecerse una infección por Salmonella en el intestino de ratones inoculados por gavaje con Salmonella.Hola, soy Michelle P del laboratorio del Dr. Johnson en el Departamento de Medicina de la Universidad de Rochester. También soy del Laboratorio Sun y soy Y del Laboratorio Sun. Hoy les mostraremos un procedimiento para establecer un modelo de masa infectada con Alytic Lennar.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la trans

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