Name: Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Aprende a seleccionar aptámeros de ARN que se unen específicamente a la proteína amiloide β, implicada en la enfermedad de Alzheimer, mediante métodos de evolución in vitro. Esta técnica ofrece aplicaciones terapéuticas y diagnósticas prometedoras.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por becas AG030709 de NIH / NIA y 07-65798 del Departamento de Salud de California. Reconocemos Margaret M. Condron para la síntesis de péptidos y análisis de aminoácidos, la Dra. Elizabeth F. Neufeld para ayudar y apoyar a los pasos iniciales del proyecto, el Dr. Chi-Hong Chen B. de proporcionar apoyo y reactivos, y el Dr. Andrew D. . Ellington útil para los debates.

<ol><li>Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnostics+and+therapeutics+for+Alzheimer%27s+disease-how+early+can+we+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Neurother%22%5BJournal%5D)">Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there.</a> Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).</li>
<li>Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+early+detection+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the early detection of Alzheimer's disease.</a> Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).</li>
<li>Kawas, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+practice.+Early+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical practice. Early Alzheimer's disease.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B2-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shifts+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%3A+the+emerging+role+of+oligomeric+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies.</a> J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+pre-fibrillar+protein+assemblies+in+Alzheimer%27s+disease+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Alzheimer+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders.</a> Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+therapeutics+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aptamer therapeutics advance.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).</li>
<li>Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+specifically+interact+with+the+prion+protein+PrP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP.</a> J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).</li>
<li>Bibby, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+novel+in+vitro+selection+technique+to+isolate+and+characterise+high+affinity+DNA+aptamers+binding+mammalian+prion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins.</a> J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).</li>
<li>Rhie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+2%27-fluoro-RNA+aptamers+that+bind+preferentially+to+disease-associated+conformations+of+prion+protein+and+inhibit+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion.</a> J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).</li>
<li>King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioaptamer+interactions+with+prion+proteins%3A+sequence-specific+and+non-specific+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites.</a> J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).</li>
<li>Proske, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-protein-specific+aptamer+reduces+PrPSc+formation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation.</a> ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).</li>
<li>Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-bovine+prion+protein+RNA+aptamer+containing+tandem+GGA+repeat+interacts+both+with+recombinant+bovine+prion+protein+and+its+%CE%B2+isoform+with+high+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity.</a> Prion. 2, 73-80 (2008).</li>
<li>Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+formation+by+recombinant+full-length+prion+proteins+in+phospholipid+bicelle+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions.</a> J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).</li>
<li>Bunka, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+RNA+aptamers+specific+for+amyloid+fibril+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes.</a> J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).</li>
<li>Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+RNA+aptamers+to+the+Alzheimer%27s+disease+amyloid+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+generated+against+oligomeric+A%CE%B240+recognize+common+amyloid+aptatopes+with+low+specificity+but+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity.</a> PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heregulin+signaling+by+an+aptamer+that+preferentially+binds+to+the+oligomeric+form+of+human+epidermal+growth+factor+receptor-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).</li>
<li>Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+DS+%22Lab+math%3A+a+handbook+of+measurements%2C+calculations%2C+and+other+quantitative+skills+for+use+at+the+bench%22">Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+developed+for+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Methods developed for SELEX.</a> Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).</li>
<li>Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+selected+against+amyloid+%CE%B2-peptide+%28A%CE%B2%29+inhibit+the+aggregation+of+A%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ.</a> Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).</li>
</ol>

El punto de partida del proceso SELEX es la síntesis de oligonucleótidos de una biblioteca al azar por lo general con 10 12 -10 15 secuencias. En el ADN SELEX, esta biblioteca se utiliza inmediatamente después de una piscina ssDNA se genera, mientras que en el ARN SELEX, ha demostrado aquí, la biblioteca de ADN de cadena simple se convierte primero en un grupo de ARN enzimáticamente por la transcripción in vitro. Entonces, SELEX se realiza iterativamente mediante el cual cada ciclo compren...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>Laboratorio de Biopolímeros de la UCLA</td><td></td><td>Polvo liofilizado</td></tr><tr><td>MX5 Automatizada-S Microbalanza</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,6 ml recubiertos con silicona</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 o C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Utilice en una campana extractora.</td></tr><tr><td>Peroxidisulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. El APS se prepara fresco cada vez y debe usarse dentro de las 48 h.</td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipiridil)diclororutenio(II) hexahidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. Cubra el tubo de RuBpy con papel de aluminio para proteger el reactivo de la luz ambiental. El RuBpy se prepara fresco cada vez y debe utilizarse dentro de las 48 h.</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; Excellulosa&amp;#8482; columnas de desalado</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>acetato de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos recubiertos de silicona, de 0,6 ml</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine Gels (10&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10 pocillos; tamaño mini (8 cm X 8 cm); 25 &amp;#x03BC;l volumen de carga por pocillo; rango de separación de 5 kDa a 40 kDa</td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU 640 espectrofotómetro</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>biblioteca de ADN de cadena sencilla</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Pedido personalizado</td><td>La biblioteca fue diseñada para contener 49 nucleótidos aleatorios flanqueados por dos regiones constantes que poseen sitios de unión para cebadores y de clonación: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; G TCC GTT CGG GAT CCT C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasa</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>Recombinante &lt;em&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; ADN polimerasa suministrada con 10&amp;#215; Tampón de PCR y un tubo separado de MgCl₂ 25 mM&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; para PCR de rutina.</td></tr><tr><td>Mezcla de nucleótidos para PCR, solución 10 mM</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(10 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>Cebador directo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Pedido personalizado</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Primer inverso</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Pedido personalizado</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Ciclador térmico</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificación QIAquick PCR (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos estériles de 1,6 ml con tapas sujetas con anillos tóricos</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; Sistema de producción de ARN a gran escala&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>El kit contiene: 120 &amp;#x03BC;l Mezcla de enzimas (ARN polimerasa, RNasin recombinante)&amp;#174; inhibidor de ribonucleasa e inorganic pirofosfatas recombinante); 240 &amp;#x03BC;l tampón de transcripción 5; 100 &amp;#x03BC;l cada uno de 4 rNTPs, 100 mM; 110 U de DNasa RQ1 libre de RNasa, 1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;ADN de control lineal, 1 mg/ml; 1 ml de acetato de sodio 3 M (pH 5,2); 1,25 ml de agua libre de nucleasas</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-citidina 5&amp;rsquo;-trifosfato, 250 &amp;mu;Ci (9,25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>Actividad específica: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, Tricina 50 mM (pH 7,6)</td></tr><tr><td>Fenol saturado con citrato:cloroformo:alcohol isoamílico (125:24:1, pH 4,7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo:alcohol isoamílico (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto para biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada Z216-MK</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; Columnas Micro G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>Obtenido de Fisher Scientific (45-001-487)</td><td>Precargado con Sephadex&amp;#8482; G-50 grado ADN y pre-equilibrado en tampón STE que contiene 0,15 % de Kathon como biocida</td></tr><tr><td>Contador de centelleo Triathler de sobremesa</td><td>Hidex Oy, Turku, Finlandia</td><td>Modelo LSC Triathler: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; Tampón de muestra TBE-Urea (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>Geles de TBE-Urea al 6%, 1,0 mm, 10 pozos</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; Tampón de electroforesis para TBE (5&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>Descontaminante de radioactividad</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>Puntas para carga de geles</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-célula</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-célula</td></tr><tr><td>Película de auto radiografía</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>Utilice en completa oscuridad</td></tr><tr><td>Película de auto-radiografía, Hyperfilm&amp;#8482; ECL</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>Puede utilizarse bajo luz segura roja.</td></tr><tr><td>Discos de membrana</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>Ester de celulosa mixto, hidrófilo, 0.22-&amp;#x03BC;membranas de disco m</td></tr><tr><td>Base de soporte de vidrio fritado para matraz de 125 ml</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol para biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor recombinante de RNasa</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;Sistema de transcripción inversa</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor recombinante de RNasa</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; Colorante de carga</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de alzheimer

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad progresiva, dependiente de la edad, enfermedades neurodegenerativas con un curso insidioso que hace que su diagnóstico presintomático difícil 1. Diagnóstico del TDA definitiva se logra sólo postmortem, estableciendo así el diagnóstico presintomático, precoz de la EA es crucial para desarrollar y administrar tratamientos eficaces 2,3. Β-amiloide, proteína (Aß) es fundamental para la patogénesis de la EA. Asambleas soluble, Aß oligoméricas se cree que afecta a la neurotoxicidad de la disfunción sináptica y la pérdida de neuronas en el año 4,5. Diversas formas de Aß soluble asambleas se han descrito, sin embargo, sus interrelaciones y la importancia de la etiología y la patogénesis de AD son complejos y no se entiende bien 6. Herramientas específicas para el reconocimiento molecular pueden desentrañar las relaciones entre los conjuntos de Aß y facilitar la detección y caracterización de estos conjuntos de principios en el curso de la enfermedad antes de aparecer los síntomas. Reconocimiento molecular comúnmente se basa en anticuerpos. Sin embargo, una clase alternativa de herramientas de reconocimiento molecular, aptámeros, ofrece importantes ventajas con respecto a los anticuerpos 7,8. Los aptámeros son oligonucleótidos generados por in-vitro de selección: la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) 9,10. SELEX es un proceso iterativo que, al igual que la evolución darwiniana, permite la selección, amplificación, el enriquecimiento y la perpetuación de una propiedad, por ejemplo, ávida, específica, de unión al ligando (aptámeros) o la actividad catalítica (ribozimas y ADNzimas). Pesar de la aparición de aptámeros como herramientas de la biotecnología moderna y la medicina 11, han sido poco utilizados en el campo de amiloide. Pocos o ARN aptámeros ssDNA han sido seleccionados contra las distintas formas de proteínas priónicas (PrP) 12-16. Un aptámero ARN generados contra PrP bovina recombinante ha demostrado que reconocer bovina PrP-β de 17 años, soluble, oligómero, β-hoja-rica variante de conformación de larga duración PrP que forma fibrillas de amiloide 18. Aptámeros generado con las formas monoméricas y varios de β fibrilar se encontraron 2-microglobulina (β 2 m) para enlazar las fibrillas de ciertas proteínas amiloidogénica otros, además de las fibrillas de β 2 m 19. Ylera et al. describe aptámeros de ARN seleccionados en contra inmovilizado monoméricas Aβ40 20. Inesperadamente, estos aptámeros obligado fibrilar Aβ40. En conjunto, estos datos plantean varias cuestiones importantes. ¿Por qué aptámeros seleccionado frente a las proteínas monoméricas reconocer sus formas poliméricas? Podría aptámeros contra las formas monoméricas y / o de las proteínas oligoméricas amiloidogénica se obtiene? Para abordar estas cuestiones, hemos intentado seleccionar aptámeros para covalentemente estabilizado oligoméricas Aβ40 21 generados usando foto-inducido de entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) 22,23. Similar a los hallazgos previos 17,19,20, estos aptámeros reaccionaron con fibrillas de Aß y otras proteínas amiloidogénica probable que el reconocimiento de un amiloide potencialmente estructural común aptatope 21. A continuación, presentamos la metodología SELEX utilizados en la producción de estos aptámeros 21.

Los aptámeros son ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corto seleccionado por<em&gt; In-vitro</em&gt; Métodos de la evolución basada en la afinidad de un objetivo específico. Los aptámeros son herramientas de reconocimiento molecular con la versatilidad de las aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. Demostramos métodos para la selección de aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causal de la enfermedad de Alzheimer.

Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo y dependiente de la edad, con un curso insidioso que hace que su diagnóstico presintomático...

El objetivo general de los experimentos de selección es seleccionar moléculas de ARN que se unan de manera específica y con alta afinidad a una proteína diana en las selecciones de ARN. Esto se logra mediante la transcripción in vitro de ARN a partir de una biblioteca de oligonucleótidos de ADN aleatorios, seguida de la incubación del conjunto de ARN transcrito con la proteína diana. Como segundo paso, se utiliza un filtro de unión.Esto separa las moléculas de ARN de unión al blanco del grupo de ARN no ligado. A continuación, se eluyen las moléculas de ARN que se unen al blanco. Se transcriben inversamente a ADN, se amplifican por PCR y se transcriben nuevamente a ARN.Este grupo de ARN, que ahora está enriquecido con algunos aptámeros de unión, se utiliza para la unión al objetivo en el siguiente ciclo de selección. Generalmente, después de ocho a 20 ciclos, se seleccionan y caracterizan aptámeros altamente específicos y con gran afinidad por el objetivo. Hola, soy Gal Bean del Departamento de Neurología en la UCLA, hoy Far Rahimi.Un posdoctorado senior en mi laboratorio va a demostrar un proceso llamado cellex. Hemos utilizado este proceso en el laboratorio para seleccionar abers

selection-aptamers-for-amyloid-protein-causative-agent-alzheimer-s

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe una técnica para la preparación de aclarar homogeneizados humanos cortical, la separación de proteínas por SDS-PAGE, la recuperación de antígeno y la inmunotransferencia con un anticuerpo para el péptido Aß. El uso de este protocolo, estamos constantemente detectar Aß monoméricos y multimérica en el tejido cortical de los seres humanos con la patología de Alzheimer.

Detección SDS-PAGE/Immunoblot de multímeros Aß en el tejido cortical humano homogeneizados utilizando antígeno de recuperación del epítopo

Utilizando microscopía de fuerza atómica en combinación con la tecnología de biopanning, creamos un sistema de biopanning negativo y positivo para adquirir anticuerpos contra variantes de proteínas específicas de enfermedades presentes en cualquier material biológico, incluso a bajas concentraciones.  Tuvimos éxito en la obtención de anticuerpos contra las variantes de la proteína TDP-43 implicadas en la esclerosis lateral amiotrófica.

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Mientras se estudia de forma relativamente fácil el transporte de proteínas de superficie celular, visualizando el tráfico de proteínas intracelulares es mucho más difícil. Aquí, utilizamos construcciones que incorporen buenas prácticas agrarias fotoactivable y demostrar un método para seguir con precisión la proteína precursora de amiloide del aparato de Golgi compartimentos río abajo y siga su aclaramiento.

Imágenes del tráfico intracelular de APP con GFP fotoactivable

Para estudiar los efectos del Aβo in vivo, desarrollamos un modelo basado en infusiones repetidas de Aβo soluble en el hipocampo junto con una infusión continua de anticuerpo Aβo (6E10) en el hipocampo utilizando bombas osmóticas para contrarrestar el efecto neurotóxico del Aβo.

Neurodegeneración en un modelo animal de beta-amiloide crónica Oligómero de infusión es contrarrestado por el anticuerpo Tratamiento Con una infusión de bombas osmóticas

Aquí nos presenta un protocolo de purificación por HPLC a medida que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 (? 42) y beta amiloides 40 (AP40), apto para la formación de oligómeros. El amiloide beta es un péptido altamente propensos agregación, hidrófoba implicada en la enfermedad de Alzheimer. La naturaleza del péptido amiloidogénico hace su purificación un desafío.

Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros

Se describe un protocolo abreviado de fraccionamiento para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem.

Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

Este protocolo describe cómo preparar oligómeros de Aß de un péptido sintético en vitro y evaluar cantidades relativas de oligómero Aβ mediante un punto de análisis el borrar.

A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis

La proyección de imagen molecular con láser asistida por matriz basada en desorción/ionización de espectrometría de masas (MALDI-IMS) permite la asignación simultánea de múltiples analitos en muestras biológicas. Aquí, presentamos un protocolo para la detección y visualización de la proteína β amiloide en los tejidos cerebrales de la enfermedad de Alzheimer y las muestras de la Angiopatía amiloide cerebral usando MALDI-IMS.

Visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del Spectrometry total de la proyección de imagen

El presente protocolo describe y compara el procedimiento para realizar un análisis de región o subregión de interés completa de secciones cerebrales de ratón sagitales para cuantificar la carga beta amiloide en el modelo de ratón transgénico APP / PS1 de la enfermedad de Alzheimer.

Cuantificación completa versus subregional de la carga beta amiloide en secciones cerebrales de ratón

Este método de purificación bioquímica con análisis proteómico basado en espectrometría de masas facilita la caracterización robusta de los núcleos de fibrilla amiloide, lo que puede acelerar la identificación de objetivos para prevenir la enfermedad de Alzheimer.

Purificación bioquímica y caracterización proteómica de núcleos de fibrillas amiloides del cerebro

Aquí, describimos un sistema de levadura que reconstituye la γ-secretasa humana. Este sistema permite la identificación y el estudio de las mutaciones que afectan a la actividad y el cribado de los inhibidores de la γ-secretasa (GSIs). Utilizando las propiedades de pérdida de función de los mutantes familiares de la enfermedad de Alzheimer, es posible detectar moduladores de la γ-secretasa (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modelos de la enfermedad de Alzheimer para detectar genes, mutaciones y sustancias químicas que afectan la producción de beta amiloide por γ-secretasa

Aprende a seleccionar aptámeros de ARN que se unen específicamente a la proteína amiloide β, implicada en la enfermedad de Alzheimer, mediante métodos de evolución in vitro. Esta técnica ofrece aplicaciones terapéuticas y diagnósticas prometedoras.

Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer

Explorar más videos