Name: Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Aprende a seleccionar aptámeros de ARN que se unen específicamente a la proteína amiloide β, implicada en la enfermedad de Alzheimer, mediante métodos de evolución in vitro. Esta técnica ofrece aplicaciones terapéuticas y diagnósticas prometedoras.

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Este trabajo fue apoyado por becas AG030709 de NIH / NIA y 07-65798 del Departamento de Salud de California. Reconocemos Margaret M. Condron para la síntesis de péptidos y análisis de aminoácidos, la Dra. Elizabeth F. Neufeld para ayudar y apoyar a los pasos iniciales del proyecto, el Dr. Chi-Hong Chen B. de proporcionar apoyo y reactivos, y el Dr. Andrew D. . Ellington útil para los debates.

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El punto de partida del proceso SELEX es la síntesis de oligonucleótidos de una biblioteca al azar por lo general con 10 12 -10 15 secuencias. En el ADN SELEX, esta biblioteca se utiliza inmediatamente después de una piscina ssDNA se genera, mientras que en el ARN SELEX, ha demostrado aquí, la biblioteca de ADN de cadena simple se convierte primero en un grupo de ARN enzimáticamente por la transcripción in vitro. Entonces, SELEX se realiza iterativamente mediante el cual cada ciclo compren...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>Laboratorio de Biopolímeros de la UCLA</td><td></td><td>Polvo liofilizado</td></tr><tr><td>MX5 Automatizada-S Microbalanza</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,6 ml recubiertos con silicona</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 o C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Utilice en una campana extractora.</td></tr><tr><td>Peroxidisulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. El APS se prepara fresco cada vez y debe usarse dentro de las 48 h.</td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipiridil)diclororutenio(II) hexahidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. Cubra el tubo de RuBpy con papel de aluminio para proteger el reactivo de la luz ambiental. El RuBpy se prepara fresco cada vez y debe utilizarse dentro de las 48 h.</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; Excellulosa&amp;#8482; columnas de desalado</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>acetato de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos recubiertos de silicona, de 0,6 ml</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine Gels (10&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10 pocillos; tamaño mini (8 cm X 8 cm); 25 &amp;#x03BC;l volumen de carga por pocillo; rango de separación de 5 kDa a 40 kDa</td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU 640 espectrofotómetro</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>biblioteca de ADN de cadena sencilla</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Pedido personalizado</td><td>La biblioteca fue diseñada para contener 49 nucleótidos aleatorios flanqueados por dos regiones constantes que poseen sitios de unión para cebadores y de clonación: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; G TCC GTT CGG GAT CCT C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasa</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>Recombinante &lt;em&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; ADN polimerasa suministrada con 10&amp;#215; Tampón de PCR y un tubo separado de MgCl₂ 25 mM&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; para PCR de rutina.</td></tr><tr><td>Mezcla de nucleótidos para PCR, solución 10 mM</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(10 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>Cebador directo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Pedido personalizado</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Primer inverso</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Pedido personalizado</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Ciclador térmico</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificación QIAquick PCR (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos estériles de 1,6 ml con tapas sujetas con anillos tóricos</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; Sistema de producción de ARN a gran escala&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>El kit contiene: 120 &amp;#x03BC;l Mezcla de enzimas (ARN polimerasa, RNasin recombinante)&amp;#174; inhibidor de ribonucleasa e inorganic pirofosfatas recombinante); 240 &amp;#x03BC;l tampón de transcripción 5; 100 &amp;#x03BC;l cada uno de 4 rNTPs, 100 mM; 110 U de DNasa RQ1 libre de RNasa, 1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;ADN de control lineal, 1 mg/ml; 1 ml de acetato de sodio 3 M (pH 5,2); 1,25 ml de agua libre de nucleasas</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-citidina 5&amp;rsquo;-trifosfato, 250 &amp;mu;Ci (9,25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>Actividad específica: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, Tricina 50 mM (pH 7,6)</td></tr><tr><td>Fenol saturado con citrato:cloroformo:alcohol isoamílico (125:24:1, pH 4,7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo:alcohol isoamílico (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto para biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada Z216-MK</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; Columnas Micro G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>Obtenido de Fisher Scientific (45-001-487)</td><td>Precargado con Sephadex&amp;#8482; G-50 grado ADN y pre-equilibrado en tampón STE que contiene 0,15 % de Kathon como biocida</td></tr><tr><td>Contador de centelleo Triathler de sobremesa</td><td>Hidex Oy, Turku, Finlandia</td><td>Modelo LSC Triathler: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; Tampón de muestra TBE-Urea (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>Geles de TBE-Urea al 6%, 1,0 mm, 10 pozos</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; Tampón de electroforesis para TBE (5&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>Descontaminante de radioactividad</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>Puntas para carga de geles</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-célula</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-célula</td></tr><tr><td>Película de auto radiografía</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>Utilice en completa oscuridad</td></tr><tr><td>Película de auto-radiografía, Hyperfilm&amp;#8482; ECL</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>Puede utilizarse bajo luz segura roja.</td></tr><tr><td>Discos de membrana</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>Ester de celulosa mixto, hidrófilo, 0.22-&amp;#x03BC;membranas de disco m</td></tr><tr><td>Base de soporte de vidrio fritado para matraz de 125 ml</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol para biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor recombinante de RNasa</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;Sistema de transcripción inversa</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor recombinante de RNasa</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; Colorante de carga</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de alzheimer

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad progresiva, dependiente de la edad, enfermedades neurodegenerativas con un curso insidioso que hace que su diagnóstico presintomático difícil 1. Diagnóstico del TDA definitiva se logra sólo postmortem, estableciendo así el diagnóstico presintomático, precoz de la EA es crucial para desarrollar y administrar tratamientos eficaces 2,3. Β-amiloide, proteína (Aß) es fundamental para la patogénesis de la EA. Asambleas soluble, Aß oligoméricas se cree que afecta a la neurotoxicidad de la disfunción sináptica y la pérdida de neuronas en el año 4,5. Diversas formas de Aß soluble asambleas se han descrito, sin embargo, sus interrelaciones y la importancia de la etiología y la patogénesis de AD son complejos y no se entiende bien 6. Herramientas específicas para el reconocimiento molecular pueden desentrañar las relaciones entre los conjuntos de Aß y facilitar la detección y caracterización de estos conjuntos de principios en el curso de la enfermedad antes de aparecer los síntomas. Reconocimiento molecular comúnmente se basa en anticuerpos. Sin embargo, una clase alternativa de herramientas de reconocimiento molecular, aptámeros, ofrece importantes ventajas con respecto a los anticuerpos 7,8. Los aptámeros son oligonucleótidos generados por in-vitro de selección: la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) 9,10. SELEX es un proceso iterativo que, al igual que la evolución darwiniana, permite la selección, amplificación, el enriquecimiento y la perpetuación de una propiedad, por ejemplo, ávida, específica, de unión al ligando (aptámeros) o la actividad catalítica (ribozimas y ADNzimas). Pesar de la aparición de aptámeros como herramientas de la biotecnología moderna y la medicina 11, han sido poco utilizados en el campo de amiloide. Pocos o ARN aptámeros ssDNA han sido seleccionados contra las distintas formas de proteínas priónicas (PrP) 12-16. Un aptámero ARN generados contra PrP bovina recombinante ha demostrado que reconocer bovina PrP-β de 17 años, soluble, oligómero, β-hoja-rica variante de conformación de larga duración PrP que forma fibrillas de amiloide 18. Aptámeros generado con las formas monoméricas y varios de β fibrilar se encontraron 2-microglobulina (β 2 m) para enlazar las fibrillas de ciertas proteínas amiloidogénica otros, además de las fibrillas de β 2 m 19. Ylera et al. describe aptámeros de ARN seleccionados en contra inmovilizado monoméricas Aβ40 20. Inesperadamente, estos aptámeros obligado fibrilar Aβ40. En conjunto, estos datos plantean varias cuestiones importantes. ¿Por qué aptámeros seleccionado frente a las proteínas monoméricas reconocer sus formas poliméricas? Podría aptámeros contra las formas monoméricas y / o de las proteínas oligoméricas amiloidogénica se obtiene? Para abordar estas cuestiones, hemos intentado seleccionar aptámeros para covalentemente estabilizado oligoméricas Aβ40 21 generados usando foto-inducido de entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) 22,23. Similar a los hallazgos previos 17,19,20, estos aptámeros reaccionaron con fibrillas de Aß y otras proteínas amiloidogénica probable que el reconocimiento de un amiloide potencialmente estructural común aptatope 21. A continuación, presentamos la metodología SELEX utilizados en la producción de estos aptámeros 21.

Los aptámeros son ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corto seleccionado por<em&gt; In-vitro</em&gt; Métodos de la evolución basada en la afinidad de un objetivo específico. Los aptámeros son herramientas de reconocimiento molecular con la versatilidad de las aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. Demostramos métodos para la selección de aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causal de la enfermedad de Alzheimer.

Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo y dependiente de la edad, con un curso insidioso que hace que su diagnóstico presintomático...

El objetivo general de los experimentos de selección es seleccionar moléculas de ARN que se unan de manera específica y con alta afinidad a una proteína diana en las selecciones de ARN. Esto se logra mediante la transcripción in vitro de ARN a partir de una biblioteca de oligonucleótidos de ADN aleatorios, seguida de la incubación del conjunto de ARN transcrito con la proteína diana. Como segundo paso, se utiliza un filtro de unión.Esto separa las moléculas de ARN de unión al blanco del grupo de ARN no ligado. A continuación, se eluyen las moléculas de ARN que se unen al blanco. Se transcriben inversamente a ADN, se amplifican por PCR y se transcriben nuevamente a ARN.Este grupo de ARN, que ahora está enriquecido con algunos aptámeros de unión, se utiliza para la unión al objetivo en el siguiente ciclo de selección. Generalmente, después de ocho a 20 ciclos, se seleccionan y caracterizan aptámeros altamente específicos y con gran afinidad por el objetivo. Hola, soy Gal Bean del Departamento de Neurología en la UCLA, hoy Far Rahimi.Un posdoctorado senior en mi laboratorio va a demostrar un proceso llamado cellex. Hemos utilizado este proceso en el laboratorio para seleccionar abers contra oligómeros de beta amiloide. Así que comencemos.Para lectura, es todo suyo. En este experimento selecto, se preparan ligamentos proteicos estables libres de agregados homogéneos compuestos por la proteína amiloide beta A beta 40 mediante el procedimiento de recolección descrito en un protocolo previo de Jove con modificaciones detalladas en el protocolo escrito adjunto. Tras la reticulación, purifique la mezcla de ligamentos reticulados utilizando columnas de desalado de cinco mililitros.Primero, coloque la columna sobre un soporte con un vaso de precipitados debajo de la salida de la columna. Retire la tapa superior de la columna y saque el tapón de salida. Deje que el tampón de almacenamiento fluya a través de la columna y recójalo en el vaso de precipitados.A continuación, equilibre la columna con cinco volúmenes de lecho de resina en alícuotas de tres mililitros de acetato de amonio 10 milimolar, pH 8,3. Tras equilibrar la columna, aplique una alícuota de 0,5 mililitros de la mezcla de reacción de captura a la columna. Permita que la mezcla de proteínas se absorba en la resina y deseche el flujo inicial.En el vaso de precipitados, coloque el primer tubo de recolección debajo de la salida de la columna. Añada 0,5 mililitros del tampón acetato a la columna y recoja la primera fracción de 0,5 mililitros que fluye a través. Repita la elución para recopilar fracciones de 8,5 mililitros en los tubos correspondientes.Las muestras se caracterizan mediante electroforesis SDS-PAGE y absorbancia. Combine las fracciones con el mayor contenido de proteína y mezcle suavemente utilizando una pipeta, como se describe en el protocolo escrito. Guarde una alícuota de 10 microlitros para el análisis de aminoácidos y almacene el resto.A continuación, prepare el pool de ARN. Comience amplificando la biblioteca de ADN monocatenario sintético mediante PCR, como se describe en el protocolo escrito adjunto. Purifique el producto de ADN amplificado y verifique la cantidad de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.Generalmente, la concentración y el rendimiento de ADN son de 160 más o menos 10 nanogramos por microlitro en 50 microlitros por tubo. A continuación, transcriba in vitro el ADN en presencia de CTP radiactivo durante la noche, seguido de la digestión de la plantilla de ADN amplificada mediante ADN durante cuatro horas para generar un grupo de ARN marcado con P 32, como se detalla en el protocolo escrito adjunto. Aunque el fabricante Promega recomienda una incubación de 15 minutos con ADNasa, en nuestros experimentos hemos encontrado que una incubación de cuatro horas da como resultado la eliminación completa de toda la plantilla de ADN tras la incubación con d ns.Extraiga el ARN añadiendo un volumen de fenol cloroformo citrato saturado, alcohol isoamílico, vortexee durante aproximadamente un minuto y centrifugue a 16.000 Gs durante dos minutos a temperatura ambiente; tras la centrifugación, transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Utilizando una micropipeta, añada un volumen de cloroformo alcohol isoamílico, vortexee durante un minuto y centrifugue. Como antes, elimine la fase inferior por aspiración utilizando una micropipeta.Tenga en cuenta que en este paso es más fácil eliminar la fase inferior en lugar de la superior. La fase inferior se descarta como residuo. A continuación, precipite el ARN añadiendo un volumen equivalente de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M y un volumen equivalente de isopropanol.Mezcle y coloque en un congelador a menos 20 grados Celsius durante 15 minutos. Después de 15 minutos, centrifugue, aspire el sobrenadante y lave el pellet de ARN con 0,5 mililitros de etanol al 70 %. Tras el lavado con etanol, centrifugue nuevamente y deseche el etanol. Seque el pellet de ARN a 37 grados Celsius durante cinco minutos en un bloque calefactor y disuelva la muestra de ARN en tampón STE 150 milimolar pH 8,0 hasta un volumen idéntico al de la reacción de transcripción in vitro.Caliente el tubo que contiene el producto de ARN a 70 grados Celsius durante 10 minutos en un bloque térmico y vortexee. Para facilitar la disolución del ARN, centrifugue a velocidad máxima durante un minuto a temperatura ambiente, y reserve un microlitro de Eloqua de ARN para recuento de centelleo y electroforesis en gel de poliacrilamida con urea TPE. Después de la disolución del ARN, elimine los nucleótidos no incorporados utilizando columnas G 50, siguiendo las instrucciones del fabricante.Recuerde reservar un microlitro del ARN purificado mediante G 50 para la conteo de centelleo y electroforesis en gel desnaturalizante. Utilice los dos alícuotas de un microlitro de ARN procedentes de la precipitación del ARN y del paso de desalado en G 50 para el conteo de centelleo. Calcule el porcentaje de incorporación del marcador tras el conteo de centelleo y el cálculo del porcentaje de incorporación; luego, calcule el rendimiento del ARN y la actividad específica del ARN.Finalmente, examine el ARN antes y después de la purificación mediante G 50, separando las muestras en un gel de poliacrilamida al 6% TBE con urea y visualizando el ARN mediante auto radiografía, como se describe en el protocolo escrito adjunto. Si queda satisfecho con la calidad del producto marcado, proceda a mezclar la biblioteca de ARN con la muestra de proteína para los selects. Incube el stock de ARN a 90 grados Celsius durante 10 minutos para la desnaturalización y luego a temperatura ambiente durante 10 minutos para una renaturalización lenta.Mientras el ARN se incuba, disuelva un tubo de proteína en ocho microlitros de hidróxido de sodio 60 milimolar más 36 microlitros de agua desionizada libre de núcleos. Somete la mezcla a sonicación durante un minuto y agregue 36 microlitros de tampón de unión a ARN 2X. Para el control negativo.Combine el ARN con 20 microlitros de tampón de unión 10 X para ARN y complete el volumen hasta 200 microlitros añadiendo agua libre de núcleos. Para la reacción de unión, combine 20 microlitros de la mezcla de proteína y ARN con 20 microlitros de tampón de unión 10 X para ARN y complete el volumen hasta 200 microlitros con agua libre de nucleasas.Incube los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras las muestras están en incubación, prepare los filtros y el montaje para la unión al filtro. Primero, conecte un matraz de brazo lateral de 125 mililitros a la entrada de vacío. Coloque un soporte de vidrio poroso previamente limpiado para el filtro sobre el matraz de brazo lateral.A continuación, equilibre tres membranas de filtro en dos a tres mililitros de tampón de unión XRNA en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros durante 10 a 15 minutos. Cuando las muestras de control negativo y las muestras de reacción de unión hayan terminado la incubación, centrifúgelas a máxima velocidad durante cinco minutos. A temperatura ambiente, proceda a encender el vacío y coloque la primera membrana sobre el vidrio poroso; utilice una micropipeta para aplicar por goteo 0,5 mililitros de tampón de unión de ARN sobre la membrana.Ajuste el vacío para permitir que cada gota del tampón fluya lentamente a través de la membrana. Este primer filtro se utiliza únicamente para ajustar la succión del vacío. A continuación, coloque la segunda membrana sobre el vidrio poroso y, utilizando la misma velocidad de flujo, aplique el control negativo sobre la membrana.Después de aplicar la muestra, lávela cuatro veces con alícuotas de 0,5 mililitros de un tampón de unión a ARN. Retire la membrana del control negativo y colóquela en un tubo para el recuento de centelleo. Reemplace el vidrio poroso con un segundo soporte de vidrio poroso previamente limpiado.Coloque el tercer disco sobre el vidrio poroso y aplique la mezcla de reacción de unión. Lave el filtro como se acaba de mostrar; el número de lavados puede aumentarse en ciclos de selección posteriores. Para aumentar la rigurosidad de las condiciones de selección, retire el disco del filtro y colóquelo en un tubo de 1,6 mililitros etiquetado como reacción de unión.Realice el recuento de centelleo para ambos filtros. Calcule el nivel de radioactividad retenida en el filtro en comparación con la cantidad total de radioactividad aplicada a las membranas. Esto indica el enriquecimiento por unión a medida que avanza la selección.Después del recuento de centelleo, retire el filtro de la reacción de unión del tubo y colóquelo en una placa de Petri limpia y seca de 35 por 10 milímetros. Utilizando un escalpelo limpio y un par de pinzas, corte la membrana en trozos pequeños. Use las pinzas para transferir los trozos cortados de vuelta al vial de centelleo.Añada 400 microlitros de tampón de evolución e incube el tubo a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Al final de los 10 minutos, mezcle mediante vortex y centrifugue el tubo a velocidad máxima a temperatura ambiente, aspire y recoja el tampón de extracción en un nuevo tubo etiquetado. Mida los conteos de radioactividad restantes en el tubo que contiene los fragmentos de membrana mediante recuento de centelleo. Para evaluar la eficiencia de extracción, repita la extracción tres veces; la eficiencia tras tres extracciones suele ser aproximadamente del 95 al 96 %. A continuación, añada tres a cuatro microlitros de glicógeno como coprecipitante de ARN y extraiga y precipite el ARN liberado del filtro como se indicó anteriormente, excepto que debe colocarse en un congelador a menos 20 grados Celsius durante la noche.Después de la incubación nocturna, centrifugue la muestra; el ARN precipita en una fase líquida apenas visible. Aspire el sobrenadante cuidadosamente sin desalojar esta fase precipitada apenas visible en el fondo del tubo. Lave el pellet de ARN con 0,5 mililitros de etanol al 70 %, centrifugue durante cinco minutos a velocidad máxima a cuatro grados Celsius y deseche el etanol por aspiración sin desalojar la fase precipitada apenas visible.Disuelva el pellet de ARN en 50 microlitros de tampón STE y continúe con la purificación G 50 según se describe para el ARN recién transcrito en el protocolo escrito adjunto. Para pasar al siguiente ciclo de selecciones, realice la transcripción inversa del ARN a ADN seguida de la amplificación por PCR según se describe en el protocolo escrito adjunto. Recuerde incluir una muestra de control negativo sin la transcriptasa inversa.Verifique los productos de PCR en un gel si la banda del control negativo está vacía y las demás bandas son como se esperaba. Continúe con la transcripción y etiquetado del ARN como se mostró anteriormente para su uso. En el siguiente ciclo de selección, elija el oligómero generado por captación.Una proteína beta 40 utilizada aquí para los seleccionados fue purificada según se muestra en este protocolo en video y luego analizada mediante mediciones de absorbancia mostradas por el trazo rojo y electroforesis SDS-PAGE. La proteína eluye consistentemente de la columna en las fracciones tres a cinco, y el reactivo de reticulación salut indica, después de la fracción seis, un aumento de la absorbancia en la fracción siete. La electroforesis SDS-PAGE muestra la distribución típica de todos los ligamentos beta 40.La integridad del ARN para cada ciclo de selección es importante para la progresión iterativa de las selecciones. Después de la transcripción y marcado del ARN, la calidad del ARN marcado se evalúa mediante electroforesis en gel desnaturalizante. A continuación se muestra un perfil típico de un producto de ARN marcado intacto antes y después de la purificación G 50. La presencia de ADN molde contaminante de ciclos de selección previos aún presente tras la reacción de transcripción in vitro podría reducir la suficiencia de la selección, lo que requeriría más ciclos.La electroforesis en gel del producto de la reacción de transcripción inversa seguida de amplificación por PCR muestra el producto de ADN esperado. La ausencia de producto de ADN en los tubos de reacción de control negativo indica la eliminación exitosa de la plantilla de ADN mediante el tratamiento con DNasa después de la transcripción in vitro. Bien, acabamos de mostrarle cómo seleccionar anticuerpos para oligómeros de beta amiloide 40 estabilizados covalentemente mediante fotoenlace. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que ambas moléculas deben tener una estructura estable para que puedan tener alta afinidad, y también recordar que ambas poseen una estructura tridimensional en la cual interactúan.Vale, eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

Se describe una técnica para la preparación de aclarar homogeneizados humanos cortical, la separación de proteínas por SDS-PAGE, la recuperación de antígeno y la inmunotransferencia con un anticuerpo para el péptido Aß. El uso de este protocolo, estamos constantemente detectar Aß monoméricos y multimérica en el tejido cortical de los seres humanos con la patología de Alzheimer.

Detección SDS-PAGE/Immunoblot de multímeros Aß en el tejido cortical humano homogeneizados utilizando antígeno de recuperación del epítopo

Utilizando microscopía de fuerza atómica en combinación con la tecnología de biopanning, creamos un sistema de biopanning negativo y positivo para adquirir anticuerpos contra variantes de proteínas específicas de enfermedades presentes en cualquier material biológico, incluso a bajas concentraciones.  Tuvimos éxito en la obtención de anticuerpos contra las variantes de la proteína TDP-43 implicadas en la esclerosis lateral amiotrófica.

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Mientras se estudia de forma relativamente fácil el transporte de proteínas de superficie celular, visualizando el tráfico de proteínas intracelulares es mucho más difícil. Aquí, utilizamos construcciones que incorporen buenas prácticas agrarias fotoactivable y demostrar un método para seguir con precisión la proteína precursora de amiloide del aparato de Golgi compartimentos río abajo y siga su aclaramiento.

Imágenes del tráfico intracelular de APP con GFP fotoactivable

Para estudiar los efectos del Aβo in vivo, desarrollamos un modelo basado en infusiones repetidas de Aβo soluble en el hipocampo junto con una infusión continua de anticuerpo Aβo (6E10) en el hipocampo utilizando bombas osmóticas para contrarrestar el efecto neurotóxico del Aβo.

Neurodegeneración en un modelo animal de beta-amiloide crónica Oligómero de infusión es contrarrestado por el anticuerpo Tratamiento Con una infusión de bombas osmóticas

Aquí nos presenta un protocolo de purificación por HPLC a medida que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 (? 42) y beta amiloides 40 (AP40), apto para la formación de oligómeros. El amiloide beta es un péptido altamente propensos agregación, hidrófoba implicada en la enfermedad de Alzheimer. La naturaleza del péptido amiloidogénico hace su purificación un desafío.

Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros

Se describe un protocolo abreviado de fraccionamiento para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem.

Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

Este protocolo describe cómo preparar oligómeros de Aß de un péptido sintético en vitro y evaluar cantidades relativas de oligómero Aβ mediante un punto de análisis el borrar.

A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis

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Visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del Spectrometry total de la proyección de imagen

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Cuantificación completa versus subregional de la carga beta amiloide en secciones cerebrales de ratón

Este método de purificación bioquímica con análisis proteómico basado en espectrometría de masas facilita la caracterización robusta de los núcleos de fibrilla amiloide, lo que puede acelerar la identificación de objetivos para prevenir la enfermedad de Alzheimer.

Purificación bioquímica y caracterización proteómica de núcleos de fibrillas amiloides del cerebro

Aquí, describimos un sistema de levadura que reconstituye la γ-secretasa humana. Este sistema permite la identificación y el estudio de las mutaciones que afectan a la actividad y el cribado de los inhibidores de la γ-secretasa (GSIs). Utilizando las propiedades de pérdida de función de los mutantes familiares de la enfermedad de Alzheimer, es posible detectar moduladores de la γ-secretasa (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modelos de la enfermedad de Alzheimer para detectar genes, mutaciones y sustancias químicas que afectan la producción de beta amiloide por γ-secretasa

Aprende a seleccionar aptámeros de ARN que se unen específicamente a la proteína amiloide β, implicada en la enfermedad de Alzheimer, mediante métodos de evolución in vitro. Esta técnica ofrece aplicaciones terapéuticas y diagnósticas prometedoras.

Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer

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