Análisis de la expresión génica en el barrenador esmeralda del fresno ( Agrilus planipennis) Utilizando Real-PCR cuantitativa en tiempo

El objetivo general del siguiente experimento es analizar la expresión génica en tejidos y etapas de desarrollo del Boer de frambuesa esmeralda mediante PCR cuantitativa. Esto se logra mediante la disección de tejidos larvales y la clasificación de las etapas de desarrollo. Como segundo paso, se extrae el ARN de los tejidos y etapas de desarrollo utilizando el reactivo triol, el cual se utiliza luego como molde para generar la primera cadena de ADNc; tras la síntesis de la primera cadena de ADNc, se realiza la PCR cuantitativa con retrotranscriptasa.

Se obtienen resultados que muestran la expresión diferencial del gen diana en diversos tejidos larvales y etapas de desarrollo, basados en datos completos de cambio obtenidos a partir de los valores de umbral de ciclo tras las amplificaciones cuantitativas de R-T-P-C-R. Hola, soy Prakash Mi, el investigador principal de este laboratorio en el Departamento de Entomología de la Universidad Estatal de Ohio.

Mi laboratorio se centra principalmente en los aspectos genómicos o moleculares de las interacciones entre el emal, el lash, el burer y el ash. El emal, lash, burer o EAB es una plaga exótica invasora proveniente de China que amenaza la existencia misma de las poblaciones de ash en toda América del Norte. Hoy les mostraremos un protocolo para realizar análisis de expresión génica en el EAP mediante QPCR o PCR cuantitativa en tiempo real.

Y los miembros del laboratorio que participarán en este protocolo son Swapna Priou, quien realizará las disecciones de las válvulas, y Bin Bandari, quien mostrará el aislamiento de ARN. Finalmente, Lauren Rivera Vega realizará el análisis de QPC. También utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la expresión génica de ash.

Así que comencemos. Antes de iniciar este procedimiento, coloque larvas de emerald ash B o EAD sobre papel de tissue húmedo. Hasta que se realicen las disecciones, mantenga la solución salina tamponada con fosfatos al uno por ciento o PBS recién preparada sobre hielo para mantener el tampón frío durante toda la disección.

Para comenzar, sujete las larvas de EAB en la placa de disección con alfileres finos de disección. Luego agregue PBS 1X frío a la placa de disección. Primero, seccione la cabeza de las larvas con un par de tijeras finas de disección.

Posteriormente, retire el último segmento abdominal de las larvas utilizando una pinza de relojero. Levante la cutícula del cadáver larval y luego realice una incisión a lo largo del cadáver usando un par de tijeras. Tenga cuidado de no romper el intestino.

Mientras se realiza la incisión, aísle cuidadosamente el tejido del intestino medio de otros tejidos como los cuerpos grasos y el tejido conectivo. Luego enjuague el tejido en 1 mL de tampón PBS 1X fresco para asegurar que no haya contaminación con tejido graso. Transfiera el intestino medio a 500 microlitros de reactivo TRIol previamente enfriado en un tubo eppendorf de 1,5 mililitros.

A continuación, aísle el tejido del cuerpo graso utilizando pinzas y transfiéralo a un tubo eppendorf de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de reactivo triol frío. Finalmente, aísle el tejido de la cutícula del cadáver larval raspando cualquier tejido adherido, teniendo cuidado de no dañar la integridad del tejido.

Lave el tejido de cutícula aislado con tampón PBS fresco y transfiéralo a un tubo eppendorf de 1,5 mililitros con 500 microlitros de reactivo de triazol frío. Los tejidos aislados de cutícula, cuerpo graso y intestino medio pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius hasta la extracción de ARN. Como preparación para la extracción de ARN, clasifique las diversas muestras de EAB según las etapas de desarrollo.

Estas etapas incluyen primero, segundo, tercer y cuarto estadios en estrellas, PrepU y adultos. Para iniciar la extracción de ARN, primero use punzones de plástico para homogeneizar los tejidos en el triol que contiene tubos Eppendorf de 1,5 mililitros. Después de la homogeneización, lleve el volumen total de cada muestra a un mililitro con el reactivo triol.

Para las etapas de desarrollo, homogenice el animal completo en nitrógeno líquido con un mortero y un pistilo. Luego agregue una alícuota del homogenato a un mililitro de triol. Incube los tubos de muestra con un mililitro de triol durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Tras la incubación, agregue inmediatamente 200 microlitros de cloroformo a cada tubo justo después de añadir el cloroformo. Agite los tubos vigorosamente durante aproximadamente 15 segundos. Luego, incube los tubos a temperatura ambiente durante dos o tres minutos adicionales.

A continuación, centrifugue las muestras a 12,000 GS durante 15 minutos a dos grados Celsius. Tras la centrifugación, el ARN se encontrará en la fase acuosa. El volumen de la fase acuosa debe ser de 600 microlitros o 60 % del volumen total de triol.

Retire cuidadosamente solo la fase acuosa. La presencia de sustancias debajo de la fase acuosa causará contaminación del ARN extraído. Luego, transfiera la fase acuosa a un tubo einor de 1.5 mililitros adecuadamente etiquetado.

Para precipitar el ARN de la mezcla de la fase acuosa, agregue 0,5 mililitros de alcohol isopropílico a cada tubo. Incube las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras la incubación, centrifugue los tubos a 12 000 G durante 10 minutos a dos grados Celsius. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante de los tubos.

El ARN se encuentra en el pellet de consistencia gelatinosa que se forma en el fondo del tubo. Lave el pellet con etanol al 75 %, añadiendo al menos un mililitro de etanol al 75 % por cada mililitro mezclado mediante vortex. A continuación, centrifugue los tubos a 7 500 ×g durante cinco minutos a dos grados Celsius.

Deseche el sobrenadante de los tubos. Centrifugue los tubos nuevamente en la centrífuga de mesa pequeña durante un minuto. Retire cualquier sobrenadante residual del tubo mediante pipeteo cuidadoso.

Deje el tubo abierto y permita que el precipitado se seque al aire durante cinco a 10 minutos. Tenga cuidado de no secar en exceso el precipitado, ya que esto disminuirá significativamente su solubilidad después del secado al aire. Re_suspenda el precipitado en percarbonato de dathyl o agua tratada con dep sea.

La cantidad de agua utilizada para resuspender el precipitado dependerá del tamaño del mismo. Utilice 50 microlitros de agua de mar tratada para un precipitado pequeño o 100 microlitros para un precipitado grande. Deje que el precipitado se disuelva completamente en agua de mar tratada moviendo la punta de la pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Una vez que el precipitado se haya disuelto, coloque la muestra a 55 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, mida la concentración de cada muestra de ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. Finalmente, realice la síntesis de ADN de cadena primera para las muestras de ARN respectivas utilizando el sistema de síntesis de cadena primera SuperScript de Invitrogen para RT-PCR.

Este procedimiento puede encontrarse en la sección escrita de este protocolo. Para comenzar el diseño de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real o Q-R-T-P-C-R, diseñe cada cebador para que tenga una temperatura de fusión de 60 grados Celsius y un tamaño de producto de aproximadamente 100 pares de bases. AP par uno se utiliza como el gen de interés en este experimento.

Se necesita un gen de referencia o control interno para el análisis posterior y la normalización de los datos. Aquí, la proteína ribosomal a P RRP uno se utiliza como gen de referencia. A continuación, diseñe una plantilla que indique el nombre de la muestra para cada pocillo y la placa de qPCR.

Recuerde incluir patrones para cada gen y al menos dos réplicas técnicas por muestra. Luego encienda la máquina de PCR cuantitativa y configure los parámetros de ciclado para preparar la placa para la máquina CFX 96. Primero, prepare la mezcla maestra para cada gen en un tubo separado por cada pocillo.

La mezcla maestra consiste en dos microlitros de agua libre de nucleasas, cuatro microlitros de cyber green 2,5 x, un microlitro de cebador directo y un microlitro de cebador inverso, para un volumen total de ocho microlitros. De acuerdo con la plantilla diseñada previamente, añada dos microlitros de ADNc a cada pozo. Luego añada ocho microlitros de la mezcla maestra a cada pozo, obteniendo un volumen total de 10 microlitros por reacción; pase la muestra hacia arriba y hacia abajo con la pipeta para asegurar que esté bien mezclada.

Verifique que no quede líquido en la punta. Para evitar la contaminación cruzada, utilice una punta nueva para cada muestra. Una vez que toda la placa esté preparada, cubra la placa con cinta óptica.

Evite tocar la cinta, ya que la presencia de grasa puede afectar la lectura. Luego, centrifugue la placa a 500 RPM durante un minuto para asegurar que todos los productos en los pocillos estén en el fondo de la placa tras la centrifugación. Verifique que no haya hielo ni agua en la parte inferior de la placa.

Finalmente, coloque la placa en la máquina de PCR cuantitativa y ejecute el programa de PCR representativo para el barrenador esmeralda del arce larval. Aquí se muestran la disección y la PCR cuantitativa. La disección del larva del barrenador esmeralda del arce debe revelar el intestino medio en la parte central de la larva.

El intestino medio de la larva de EAB se aísla como se muestra aquí, valores medios de expresión relativos o RAV. Aquí se muestran los valores para el gen de paratrophina AP par uno en diferentes tejidos larvales, incluyendo cutícula, intestino medio y cuerpos grasos. La proteína ribosomal específica de EAB, ARP uno, se utilizó como control interno para normalizar los datos obtenidos para el gen de interés.

Se extrajo el cambio relativo de expresión de AP AP par uno para los diferentes tejidos larvarios. El tejido de la cutícula mostró la expresión más baja y, por lo tanto, se utilizó como muestra calibradora para los valores promedio de RV de AP Perry. Uno en diferentes estadios de desarrollo de EAB, incluyendo las primeras, segundas, terceras y cuartas estrellas LAR.

Los PrepU y los adultos se determinaron utilizando aprp uno como control interno para normalizar los datos. Se determinó el cambio relativo de expresión de AP Perry uno en diversas etapas de desarrollo. Aquí, la muestra PrepU mostró el nivel más bajo de ARNm y, por lo tanto, se utilizó como calibrador.

Acabamos de mostrarle cómo realizar disecciones laterales y posteriormente análisis de expresión génica utilizando la región lateral, así como diversas etapas de desarrollo de Emeral ra, mediante R-T-P-C-R cuantitativo durante este procedimiento. Debe tener cuidado al realizar la disección para no contaminar cruzadamente las muestras de tejido. Además, se debe tener precaución al realizar la Q-R-T-P-C-R para asegurarse de pipetear las muestras respectivas en la cubeta de PCR correspondiente.

Así que eso es todo. Gracias por ver nuestro video y buena suerte con sus experimentos.