Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes de células neuronales con alta resolución en el embrión de pez cebra. En primer lugar, se inyecta ADN que codifica una proteína verde fluorescente dirigida a la membrana en un embrión de pez cebra en estadio de una sola célula, lo que da lugar a una herencia mosáica que permite una mejor visualización de células dispersas. Luego, los embriones se marcan inmunológicamente con anticuerpos anti-GFP y se seccionan, lo que posibilita la visualización de la morfología de células individuales con alta resolución en una preparación fija. Alternativamente, se pueden examinar embriones vivos mediante microscopía de video de lapso de tiempo para observar la dinámica celular.

Se obtienen resultados que muestran la morfología o la dinámica celular. Aquí, el cerebro posterior del pez cebra se imagina mediante microscopía confocal. Hola a todos.

Soy PR Chandran del laboratorio de la Dra. Rachel Brewster en el departamento de ciencias biológicas de la Universidad de Maryland en Baltimore County. Hoy les mostraremos un procedimiento para etiquetar e imaginar células neuronales en embriones de pez cebra con mayor resolución. Normalmente utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar los mecanismos de la neurogénesis en embriones de pez cebra a nivel celular.

Entonces, comencemos. Coloque toallitas húmedas de Kim alrededor del borde de una placa de Petri de 100 milímetros.

Sujete cuidadosamente una aguja de microinyección de vidrio sobre una tira de cera dentro del recipiente humedecido. Bajo un microscopio estereoscópico de disección, alinee la aguja con una regla graduada. Para obtener una punta del tamaño adecuado, utilice una cuchilla limpia para golpear suavemente la aguja en el punto donde tenga un diámetro de un micrómetro.

Conecte la aguja al micropipeta del aparato de microinyección y coloque 0,5 microlitros de una solución de rojo de fenol y agua sobre una película para parafina; llene la aguja desde delante con las gotas. Establezca la presión de microinyección en siete kilopascales e inicie un pulso de 20 milisegundos. Cuente el número de pulsos necesarios para dispensar todo el líquido. Varíe el tiempo entre 10 y 30 milisegundos de modo que se necesiten aproximadamente 250 pulsos para dispensar.

0.5 microlitros de solución. Utilice una micropipeta para rellenar la aguja con 0.5 a un microlitro de MG FPD NA en agua, mezclado con rojo de fenol para visualización. Cubra el recipiente humedecido para evitar la evaporación de la solución fuera de la aguja bajo el microscopio estereoscópico.

Coloque embriones de peces separados en un estadio de una célula en una placa de Petri de 60 milímetros llena con medio embrionario. Utilice pinzas finas para sujetar suavemente el corion y estabilizar el embrión. Introduzca la aguja cargada con MGFP y rojo de fenol en la zona diana para la inyección.

Para una expresión amplia de MGFP, inyecte en el vitelo o en el citoplasma. Utilice el aparato de microinyección para administrar aproximadamente dos nanolitros de la solución de MGFP. Observe la ubicación del indicador rojo de fenol para confirmar la inyección adecuada.

Retire cuidadosamente la aguja del embrión. Inyecte todos los embriones en la placa, hasta 30 embriones a la vez. Evite exponer los embriones a la luz e incube a 28,5 grados Celsius para permitir que los embriones se desarrollen hasta la etapa deseada bajo el microscopio estereoscópico.

Utilice pinzas finas para desprender suavemente el corion de los embriones. Use una pipeta de pasta para eliminar el corion vacío del recipiente, dejando solo los embriones descorionados. Utilice una pipeta de pasta pulida al fuego para transferir los embriones inyectados descorionados a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

Retire tanto medio adicional como sea posible, luego agregue un mililitro de ative. Lave los embriones en una XPBS a temperatura ambiente 3 veces durante cinco minutos cada vez. Transfiera los embriones a una placa de Petri llena con una XPBS bajo el microscopio estereoscópico.

Utilice pinzas finas para sostener el embrión cerca de la región de la cola. Utilice un segundo par de pinzas o una aguja para intentar eliminar la mayor cantidad posible de vitelo sin tocar la región del armazón posterior. Observando bajo el microscopio estereoscópico, utilice las pinzas finas para levantar el embrión del recipiente y colocarlo en un molde para inclusión lleno con punto de fusión bajo al 4 % Aros.

Coloque el embrión hacia un extremo del molde. Deje solidificar el aros a temperatura ambiente. Utilice una espátula para retirar el bloque endurecido de aros del molde, elevando la hoja para cortar uniformemente el extremo inferior del bloque.

Si se desea, use una gota de pegamento instantáneo para fijar el bloque en la plataforma vibratoria con el lado cortado hacia abajo. Alinee varios bloques sobre la plataforma. Fije la plataforma al vibrato.

Asegúrese de que la cuchilla corte por completo cada embrión, pero sin atravesar del todo el bloque. Llene la platina con una sección de XPBS. Corte cuidadosamente los embriones hasta la parte posterior de un bloque de agarosa y transfiéralos a una placa de Petri llena con XPBS.

Separar las secciones bajo el microscopio estereoscópico. Utilizar pinzas finas para colocar las secciones deseadas en una placa de múltiples pocillos llenas con un XPBS. Usar un pocillo diferente para cada embrión.

Tiña las secciones con DPI y marque inmunológicamente con anticuerpo anti GFP. En caso contrario, realice la adquisición de imágenes dentro de las 48 horas. Monte hasta seis secciones por portaobjetos y coloque un cubreobjetos sobre las secciones para la imagen confocal.

Guarde las láminas en la oscuridad para evitar el desvanecimiento por luz. Durante la imagenología en vivo, los embriones inyectados con MGFP deben protegerse de la luz. Utilice pinzas para recubrir los embriones 30 minutos antes de que alcancen la etapa de desarrollo deseada.

Transfiera los embriones recubiertos a una solución sedante de medio para embriones con 0,01 % Trica e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Deposite con pipeta una gota de 1 % de agarosa regular en agua sobre un recipiente de cultivo de 35 milímetros con fondo de vidrio, de modo que llene el molde. Deje que la agarosa solidifique.

Utilice el tubo capilar de vidrio de 90 milímetros para hacer tres orificios en la gota de aros bajo el microscopio estereoscópico. Examine la parte inferior de la cavidad y retire cualquier resto de aros con pinzas. Llene el recipiente con medio embrionario bajo el microscopio estereoscópico.

Utilice una pipeta de pasta para transferir un embrión a cada orificio en los aros. Use pinzas finas para orientar el embrión de modo que la zona de interés, en este caso la cabeza dorsal, quede apoyada contra el vidrio. Tape el recipiente.

Transporte cuidadosamente el plato al portaobjetos de un microscopio confocal. Utilice calentadores de ambiente para mantener a los embriones a 28.5 grados Celsius durante todo el proceso de obtención de imágenes. A continuación se muestra una sección del cerebro posterior de un embrión de tipo silvestre con cuatro a cinco somitas, marcado doblemente con GFP dirigido a la membrana en verde y D en azul; solo una célula está marcada con GFP unido a la membrana, lo que permite la obtención de imágenes de alta resolución de la morfología y organización celular.

Esta es una imagen comparable del cerebro posterior de un embrión mutante nardi din en estadio de cuatro a cinco somitas. Esta imagen revela que las células en los mutantes nardi no logran orientarse adecuadamente hacia la línea media durante la neurulación. A diferencia del método para marcar células con MGFP, la etiquetación del cerebro posterior con un marcador general de la superficie celular, como la beta-catenina, no permite visualizar la morfología de células individuales.

La imagen de lapso de tiempo del cerebro posterior de un embrión marcado con MG FP revela que los comportamientos celulares que impulsan la neurogénesis en el pez cebra son muy dinámicos e implican la extensión de protrusiones de membrana mientras las células migran e interactúan. Acabamos de mostrarle cómo preparar tanto embriones de pez cebra fijados como vivos para la obtención de imágenes a nivel de célula individual con alta resolución. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.