Flash de congelación y muestras criostáticas E12.5 cerebro de ratón

Hola, soy Spencer Curley de la Universidad de California en Irvine y el laboratorio de Ed Maki, y voy a demostrar cómo hacer criosecciones. Para ello, primero utilizo estos reactivos de uso común. El compuesto de inclusión o medio de inclusión que utilizo se llama OCT para la temperatura de corte óptima.

Es una solución transparente, es muy espesa y viscosa, y sostiene bien el tejido mientras puedes orientarlo y luego se congela, y finalmente es soluble en agua para que puedas deshacerte de él durante cualquier tipo de procedimiento de tinción. Así que incrusté el tejido en un molde. Estos contenedores de biopsia de moho criogénico vienen en varios tamaños.

Usaré este molde más pequeño aquí porque hago tejido embrionario de ratón. Congelamos rápidamente nuestros tejidos y nitrógeno líquido. Así que primero voy a llenar este matraz protector de vacío con nitrógeno líquido de nuestro tanque aquí.

Antes de congelar rápidamente el tejido, debe lo que se llama crioproteger el tejido, de lo contrario, la congelación en sí misma destruirá el tejido. Así que lo que haces es hundir el tejido en una solución de sacarosa al 30% durante la noche. Y si tarda más, no pasa nada, siempre y cuando el tejido se hunda.

Y como pueden ver, las cabezas de ratón del día 12.5 del día embrionario de visa están, se han hundido en la solución de sacarosa, por lo que están listas para ser congeladas. Así que ahora simplemente voy a verter el tejido que está en una solución de sacarosa en un plato más grande que yo, para poder manipular el tejido. Voy a tomar un poco de este OCT y vertirlo en este plato de 35 milímetros que en realidad está descansando sobre su tapa para poder colocarlo en ángulo.

Por lo tanto, la OCT se acumula a lo largo del borde para obtener profundidad. Así que estoy usando un par de pinzas viejas y desafiladas simplemente porque no necesitas que estén afiladas y no quieres arruinar otro par de pinzas. Así que yo, las tomo y levanto una de estas cabezas muy suavemente, y la coloco en este primer baño de OCT.

Solo quiero recubrir el embrión en OCT. Esto permite una congelación mejor y más uniforme del tejido. No querrás que quede sacarosa alrededor del tejido ni burbujas de aire.

Definitivamente evite las burbujas de aire. Así que estoy revolviendo suavemente la OCT alrededor y debajo de la cabeza, moviendo la cabeza a través de la OCT y dejándola reposar allí durante unos segundos mientras lleno mi molde criogénico. Así que ahora voy a llenar el molde criogénico con el, el OCT, de nuevo, evitando las burbujas.

Y voy a llenarlo hasta la parte superior del molde. Y como te darás cuenta, he etiquetado el molde. Así que lo haré, podré ver mi orientación después de que esté congelado.

Cuando la OCT se congela, se vuelve blanca y ya no se puede ver el tejido. Así que definitivamente quieres etiquetar en un marcador permanente. El, el molde criogénico.

De hecho, obtuve una burbuja en el OCT, así que voy a usar mis pinzas para empujarla hacia afuera por el borde. No quieres que eso interfiera con la congelación de tu tejido. Así que ahora voy a transferir la cabeza de este plato al OCT que está en mi molde.

Solo voy a sacarlo del plato y colocarlo en el molde muy suavemente. Luego voy a ir al microscopio donde voy a orientar el tejido. Tengo el tejido en mi molde criogénico aquí, y voy a mirar a través del endoscopio para poder orientarlo.

Voy a hacer secciones coronales a través de esta cabeza de ratón. Así que necesito orientarlo para poder colocarlo en el criostato para secciones coronales. Así que, de nuevo, estoy usando estas viejas pinzas desafiladas y, como pueden ver, hay algunas burbujas aquí y voy a hacer todo lo posible para sacarlas.

Pero estas burbujas más pequeñas no son, no son malas. No he notado nada con estas burbujas más pequeñas. Simplemente no quieres burbujas grandes.

Así que voy a sacarlos lo mejor que pueda y definitivamente limpiaré las pinzas con frecuencia porque de esa manera puedes evitar mejor las burbujas. Y ahora, si pueden ver mi etiquetado, tengo una t aquí arriba y una F a mi izquierda aquí. Eso solo me indica que la cabeza, la parte superior de la cabeza va a estar hacia arriba y el frente o la cara va a estar a mi izquierda.

De esa manera, sé qué superficie cortar para las secciones coronales y solo estoy empujando el tejido. Y de nuevo, a veces eso introduce burbujas y sólo quieres empujarlas para que no se congelen junto con el tejido. Por lo tanto, es malo tener burbujas, principalmente porque cuando te estás congelando, las burbujas de tejido pueden causar una congelación inconsistente.

El propósito de la congelación instantánea es tener todo congelado a la vez. Además, cuando estás cortando el tejido y el criostato, si la cuchilla pasa a través de una burbuja en lugar de la OCT o el tejido, puede causar un enganche o un desgarro y destruir o, ya sabes, romper tu tejido. Así que definitivamente querrás evitar estas burbujas a toda costa.

Sobre todo los más grandes. Así que todavía lo estoy orientando aquí. Este tejido ha sido fijado durante 24 horas, por lo que es bastante resistente a mis manipulaciones.

Otros tejidos pueden ser un poco más suaves, por lo que debes ser muy suave. Entonces, una vez que lo tenga colocado debajo del visor con la cara a la izquierda y la parte superior de la cabeza hacia arriba, tendré que asegurarme de que también sea correcto en otros planos de orientación. Así que voy a levantar y mirar a través de todas las caras del cubo para asegurarme de que está bien.

Y veo que está ligeramente inclinado hacia abajo, así que tengo que levantarlo con mis pinzas. ¿Bien? Y esto definitivamente requiere mucha práctica. Está bien, se ve bien.

Ahora voy a caminar por aquí y lo voy a congelar en nitrógeno líquido. Bien, ahora que el tejido está orientado correctamente en el molde criogénico, voy a verter mi nitrógeno líquido en este plato aquí. Se trata de una placa de Petri de plástico normal para el cultivo de tejidos hasta la parte superior.

Se evapora bastante rápido. Voy a tomar mis pinzas y bajar el molde criogénico. Y como puedes ver, en realidad he doblado el labio inferior.

Eso definitivamente permite un mejor manejo. Voy a congelarlo. Y a medida que el tejido y la OCT se congelan, se vuelven de un blanco sólido.

Y una vez que esté completo, será todo blanco. Y luego tengo que colocar rápidamente el pañuelo congelado en el congelador de menos 80 para su almacenamiento. Debes sostenerlo de manera que el tejido no se sumerja.

Por lo tanto, debe tener mucho cuidado de sostenerlo en la superficie superior del nitrógeno líquido. Está bien, ahora está congelado. Manténgalo allí durante unos segundos adicionales antes de que llegue a menos 80.

Bien, ahora voy a llevarlo a menos 80. Así que tomé mi tejido de los 80 menos y lo coloqué en este criostato aquí. De hecho, la cámara ha bajado a 24 grados centígrados negativos.

En este momento, debe dejar que el tejido se equilibre durante aproximadamente media hora a una hora antes de poder comenzar a seccionar. De lo contrario, es demasiado frágil. Entonces, si bien todas las estadísticas de crioterapia son diferentes, solo voy a señalar algunas de las cosas básicas sobre esta máquina aquí.

Así que usamos la Leica CM 30 50 s. Es una buena máquina porque tiene una unidad de enfriamiento separada para el espécimen en sí, lo cual es un buen beneficio adicional. Puede establecer la temperatura de la muestra y los diferentes tejidos requieren diferentes temperaturas para cortar.

Por lo tanto, cuando cargue el pañuelo por primera vez, debe hacer varios ajustes. Y estos son similares en todas las estadísticas de crio. Estos son electrónicos, algunos de ellos son manuales.

Por ejemplo, tendrás que retraer el brazo del criostato o avanzarlo para colocarlo más lejos o más cerca de la cuchilla. Puedes hacerlo rápido o lento. Puede establecer el grosor de su corte con, con este más o menos aquí.

Y seleccionará entre el recorte o el grosor de la sección, que se indica en el botón central aquí. Establecerá la temperatura de la cámara o de la muestra en sí junto a esta pantalla digital simplemente presionando esto y usando estas flechas hacia arriba o hacia abajo para ajustar la temperatura. Entonces, para nosotros, cuando hacemos crioseccionamiento, usamos estos portaobjetos de microscopio Super frosts plus de la marca fish fisher.

Están recubiertos con algún adhesivo para que el tejido durante el procesamiento no se desprenda. A veces, durante el corte, notará que el tejido parece un poco blando y algunas indicaciones de eso serán si golpea la hoja y se agrupa. Y lo que puedes usar para arreglar eso es este congelador súper amigable de la marca Fisher.

Congela el tejido y solo tienes que apuntarlo a tu tejido y presionar el gatillo y rápidamente volverá a congelar el tejido si es demasiado blando. Antes de montar el tejido en un mandril para seccionarlo, me gustaría hacer un recorrido rápido por algunas de las cosas de la máquina aquí. Así que aquí es donde realmente se carga la cuchilla, que está asegurada con esta placa de metal.

Al tirar de este brazo hacia arriba, puede quitar y reemplazar la cuchilla según sea necesario. Asegúrate de que sea agradable y seguro. No querrás asegurar demasiado la hoja, de lo contrario, se deformará.

Y notarás en tu corte que el grosor del tejido no es, no es consistente. Así que Uds. quieren, Uds. no quieren empujar este brazo todo el camino hacia abajo. Lo que quieres es llevarlo a donde se trata, incluso con la hoja misma.

Esta es otra cosa que podrías tener que ajustar durante el seccionamiento. Se llama placa estabilizadora. Es una pieza de vidrio que encaja en este soporte aquí y puede ajustarla con este tornillo con resorte aquí.

Y básicamente lo mueves hacia adelante o hacia atrás. Y eso mantendrá tu pañuelo o tus secciones planas para que puedas montarlas en un portaobjetos. Otra cosa que puede querer ajustar durante el corte es el lugar de la hoja que realiza el corte real.

Entonces, ¿cómo se ajusta eso?, simplemente levanta esta palanca y puedes deslizar todo este artilugio hacia la izquierda o hacia la derecha. Y solo lo usas realmente si notas que tu tejido se engancha en cierta parte de la cuchilla o si quieres guardar las cuchillas porque son bastante caras. Por lo tanto, puede encontrar un área limpia y agradable con solo moverla hacia adelante y hacia atrás.

Otra cosa que puedes ajustar es el ángulo de corte. Ahora, en el lado de aquí, que no podrás ver, hay tres posiciones diferentes. Solo usamos la posición central y la ajustamos levantando esta otra palanca.

Y eso puede, puedes hacer que este artilugio suba y baje. Siempre lo mantenemos en el medio. Así que voy a mantenerlo así ahora.

Así que esta parte de aquí atrás es la cabeza del criostato. De hecho, sostendrá la muestra de tejido congelado mientras se secciona. Se balancea hacia arriba y hacia abajo y avanza hacia la hoja.

Y básicamente, montas el tejido en este mandril aquí y colocamos el mandril en la cabeza, lo aprietas y luego usas estas perillas en la parte posterior para ajustar el ángulo y hacer un corte más recto. Así que ahora voy a montar el pañuelo en el mandril. Debes mantener los mandriles a temperatura ambiente porque primero agregarás una capa de OCT y no quieres que se congele inmediatamente porque quieres que sea una capa plana y agradable.

Y usaremos este artilugio aquí para un, se llama extractor de calor. De hecho, se usará para aplanar la OCT a medida que se congela. Entonces, lo primero que hago es tomar el control de temperatura ambiente y lo coloco en este soporte aquí.

Toma algunas de mis burbujas OCT. No importa aquí porque serán exprimidos. Solo agrega un, un poco, no necesitas mucho.

Tome el extractor de calor y siéntelo allí abajo. Espere unos segundos. Y luego se puede ver que el OCT es bonito y plano.

Así que ahora tengo mi pañuelo y necesito marcar la OCT real. Bien, entonces marcaré un punto en la OCT para, para indicar su posición. Así que ahí, acabo de marcar la parte superior con un punto azul.

Así que ahora voy a sacar el bloque de tejido del molde y lo hago simplemente empujando contra la parte posterior del mismo. Así que voy a empujar la espalda suavemente y simplemente empujarla en mi mano, pero nuevamente, no quiero que se descongele. Así que lo volví a poner.

Así que ahora pueden ver el bloque de pañuelo con la marca azul que le puse. Así que sé que esa es la parte superior de la cabeza del embrión. Y quiero seccionar a través de la cara porque estas son secciones coronales.

Así que ahora lo que voy a hacer es añadir otra gota de OCTA gota grande, y tengo que actuar rápido ahora porque todo está frío. Y tomaré mi pañuelo y lo colocaré justo en el medio, asegurándome de que esté plano contra la cama de OCT ya hecha. Ahora dejaré que se congele y eso tomará alrededor de un minuto o dos.

Así que ahora ha terminado de congelarse. Y voy a tomar el tejido que está montado en el mandril, colocarlo en la cabeza, enderezarlo lo más que pueda y luego apretar. Puede, es bonito y apretado.

Voy a colocarlo justo delante de la hoja y luego avanzarlo, lo que podría tardar varios segundos. Bien, ahora voy a usar el borde plano de la cuchilla para hacer un posicionamiento fino del tejido. Así que simplemente, miraré el borde y balancearé el pañuelo hacia arriba y hacia abajo para asegurarme de que los bordes se alineen.

Si no lo hicieran, Uds. saben, podría verse algo como esto. Obviamente lo estoy exagerando, pero puedes ver aquí que no es directo contra la hoja. Así que sigo haciendo ajustes hasta que siento que es lo más recto que puedo conseguir.

Creo que eso es bastante bueno. Así que miro desde todos los ángulos para asegurarme de que el tejido va a cortar directamente contra la hoja y uso el borde de la hoja para indicarlo. Así que estoy mirando hacia arriba y estoy mirando desde un lado y el tejido en realidad se ve bastante bien.

No tengo que hacer muchos ajustes, pero si lo hiciera, solo usaría las perillas que están en la parte posterior de la cabeza. Y al girarlos a la izquierda o a la derecha, puede ver que puede hacer ajustes finos de esa manera. Pero se ve bastante bien.

Ahora, estoy, en realidad estoy avanzando en el tejido. Todavía no está cortando porque no está contra la hoja. El tejido está incrustado en el interior de la OCT.

Por lo tanto, podría tardar varios minutos en llegar al tejido. No querrás ir demasiado rápido porque podría atrapar y agrietar la OCT y tu tejido, pero tampoco querrás ir demasiado lento porque podría tardar una eternidad. Hay una buena función en esta máquina en la que puedes hacer un recorte en una sección más gruesa, lo que te permitirá ir más rápido.

Así que ahora estoy, en realidad, estoy atravesando la OCT ahora, así que estoy disminuyendo un poco la velocidad. Así que todavía no he llegado al tejido, pero este es el momento en el que evalúo cómo va a ser el corte. Muchas variables pueden, pueden hacer que la sección de su tejido salga muy bien o muy mal.

Lo que encuentro que sucede más a menudo con este criostato es que el tejido está en realidad un poco demasiado frío. He bajado la temperatura, pero aún así parece que hace demasiado frío. Y lo que sucede es que la hoja castañeteará a través del tejido o a través de la OCT.

Así que obtendrán estas líneas pequeñas, estas líneas horizontales a través de la OCT. Lo que hago es tomar mi pulgar y simplemente calentar el borde, calentar el OCT con solo tocarlo suavemente, deslizando mi pulgar, no por mucho tiempo. Y luego, cuando lo revisé, noté que salen mucho mejor y la charla se ha detenido.

Así que ese es el tipo de cosas que voy a evaluar antes de llegar al tejido. Así que me he dado cuenta de que a medida que la hoja atraviesa el tejido, hay un enganche o grieta en la OCT. Así que una de las cosas que hago primero es cambiar la cuchilla.

No estoy seguro de cuánto tiempo ha estado esta hoja aquí y quién la usó antes que yo, así que voy a seguir adelante y sacar una nueva hoja. Obviamente, estos son muy afilados, por lo que hay que tener cuidado. Así que voy a ajustar la placa estabilizadora y hay un tornillo con resorte en la parte inferior aquí que solo tienes que meter la mano y puedes moverlo hacia adentro o hacia afuera.

Así que he avanzado y seccionado lo suficiente como para que ahora esté en el tejido. Y desafortunadamente hay una grieta a través del bloque de OCT, que ocurre a menudo y desafortunadamente no se puede controlar realmente, pero hay cosas que se pueden hacer para solucionarlo. Si la grieta ha atravesado el tejido, entonces hay que desechar la muestra o tratar de salvar lo que se pueda.

En este caso, la grieta parece estar por encima del tejido. Así que lo que voy a hacer es tomar una hoja de afeitar que ha estado en el criostato. Es, es escalofriado.

Y voy a tratar de recortar la parte agrietada, que está en la parte superior del bloque OCT. Así que, de nuevo, lo haré, usaré mi pulgar para calentar la cara del bloque OCT. Y luego voy a seccionar, y si pueden verlo aquí, está agrietado.

Así que ahí quité la pieza con el pañuelo y luego el resto de la OCT que acabo de tirar, era la parte agrietada. Así que lo que voy a hacer es tratar de recortar esa parte agrietada con una cuchilla de afeitar fría. Tengo que entrar muy recto y tengo que usar las dos manos y aplicar presión uniformemente sobre la pala.

Y voy a mover la espada de un lado a otro en el PTU. Así que me balanceo hacia adelante y hacia atrás, cortando lentamente en el OCT. Espero estar quitando la parte agrietada.

Bien, voy a reducir eliminando este exceso de OCT. Está bien, se ve bien. A continuación, voy a retraer ligeramente la cabeza porque he creado bordes que pueden engancharse en la hoja, y si eso sucede, podría romper la OCT y el tejido, lo que arruinaría mi muestra.

Así que me he retraído, así que tendré que avanzar un poco más para volver al tejido y, con suerte, haber corregido la grieta. Bien, ahora voy a volver al pañuelo. Está bien, parece que yo, yo lo corregí.

Así que ya no hay ninguna grieta en el OCT que haga que la captura de las secciones sea mucho más fácil. Así que ahora voy a avanzar a la parte del tejido que me interesa. En este momento, estoy llegando a la superficie y me gustaría entrar en el cerebro de este embrión.

Son lo suficientemente grandes como para que pueda ver las estructuras que me interesan. Olvidé mencionar que uso estos pinceles para limpiar la hoja entre cada sección que voy a capturar. Este grande es solo para limpiar el área y eliminar el exceso de OCT ooc.

También utilizo estos pinceles más finos para manipular la sección contra esta placa fría aquí para posicionarla cuando la estoy capturando en la sección. Nuevamente, estos se mantienen fríos, para que el OCT no se derrita y se pegue a los cepillos. Entonces, para capturar el tejido, primero voy a calentar la OCT y el tejido con mi pulgar.

Y me llevaré una de estas diapositivas que ya he etiquetado. Lo sostengo al revés y cada uno lo hace de manera diferente. Pero la forma en que lo hago es que me gusta sostener esta esquina superior derecha cuando la corredera está hacia abajo con mi mano derecha.

Y luego usar mi pulgar izquierdo como punto de pivote para poder ir directamente hacia abajo contra la placa y capturar la sección. La OCT y el tejido se derretirán contra la corredera y se montarán por sí mismos. Así que primero calentaré el pañuelo con el pulgar, lo dividiré lentamente, agarraré mi portaobjetos, sostendré la esquina derecha con la mano derecha, moveré el plato, lo bajaré hacia abajo, dejaré que se derrita.

Miraré el pañuelo para asegurarme de que no haya pliegues ni burbujas y que se vea bien. Y seguiré haciendo esto hasta que corte todo el cerebro. Ahora estoy mirando las secciones a través del telescopio de disección para asegurarme de que se vean bien y lo hagan, se puede ver el prosencéfalo en la parte superior de la sección y todas se ven muy bien.

Puede utilizar estas secciones criogénicas para cosas como la hibridación in situ. A veces hacemos histología básica, tinciones h y e. También se puede hacer inmunofluorescencia y, ya sabes, una serie de ensayos como ese.

Para mí en particular, estas secciones fueron fijadas y procesadas para la hibridación in situ. Así que eso es lo que haré a continuación.