Flash de congelación y muestras criostáticas E12.5 cerebro de ratón

Hola, soy Spencer Curley del Laboratorio de Ed Maki en la Universidad de California en Irvine, y voy a demostrar cómo realizar la criosección. Para ello, primero utilizo estos reactivos comúnmente empleados. El compuesto de inclusión o medio de inclusión que uso se llama OCT, por temperatura óptima para corte.

Es una solución clara, muy espesa y viscosa, que sujeta bien el tejido mientras se orienta, y luego se congela; además, es soluble en agua, por lo que puede eliminarse durante cualquier procedimiento de tinción. Así que incrusto el tejido en un molde. Estos recipientes para biopsias en moldes criogénicos están disponibles en varios tamaños.

Utilizaré este molde más pequeño porque trabajo con tejido embrionario de ratón. Congelamos rápidamente nuestro tejido en nitrógeno líquido. Así que primero voy a llenar este frasco de vacío protector con nitrógeno líquido de nuestro tanque aquí.

Antes de congelar rápidamente el tejido, debe realizar lo que se denomina crioprotección del tejido; de lo contrario, la congelación misma destruirá el tejido. Para ello, sumerja el tejido en una solución de sacarosa al 30 % durante toda la noche. Si esto lleva más tiempo, no hay problema, siempre y cuando el tejido se hunda.

Y como puede verse, las cabezas de embriones de ratón de día 12.5 han hundido en la solución de sacarosa, por lo que ya están listas para ser congeladas. Ahora voy a verter simplemente el tejido que está en la solución de sacarosa en un recipiente más grande, para poder manipular el tejido. Voy a tomar algo de OCT y verterlo en este recipiente de 35 milímetros que en realidad está apoyado sobre su tapa, para poder colocarlo en un ángulo.

Entonces, el OCT se acumula a lo largo del borde según la profundidad. Por eso estoy usando un par de pinzas más antiguas y romas simplemente porque no necesitas que sean afiladas y no quieres estropear otro par de pinzas. Así que las tomo y levanto una de estas cabezas muy suavemente, y la coloco en este primer baño de OCT.

Solo quiero recubrir el embrión con OCT. Esto permite una congelación del tejido mejor y más uniforme. No desea tener sacarosa residual alrededor del tejido ni burbujas de aire.

Evite definitivamente las burbujas de aire. Así que estoy agitando suavemente el OCT alrededor y debajo de la cabeza, moviendo la cabeza a través del OCT y dejándola reposar durante unos segundos mientras lleno mi molde criogénico. Ahora voy a llenar el molde criogénico con el OCT, nuevamente evitando las burbujas.

Y simplemente voy a llenarlo hasta la parte superior del molde. Y como notarán, he etiquetado el molde, de modo que podré ver su orientación una vez que esté congelado.

Cuando el OCT se congela, se vuelve blanco y ya no puede ver el tejido. Por lo tanto, definitivamente desea etiquetar con un marcador permanente. El molde de criomicrotomía.

En realidad, se me formó una burbuja en el OCT, así que voy a usar la pinza para empujarla hacia el borde y sacarla. No desea que eso interfiera con, con la congelación de su tejido. Ahora voy a transferir la cabeza de este recipiente al OCT que está en mi molde.

Voy a sacarla del recipiente y colocarla en el molde muy suavemente. Luego voy a ir al microscopio donde voy a orientar el tejido. Tengo el tejido en mi molde para criosección aquí, y voy a mirar a través del microscopio para poder orientarlo.

Voy a realizar cortes coronales a través de esta cabeza de ratón. Por lo tanto, necesito orientarla para poder colocarla en el criostato y obtener cortes coronales. Nuevamente, estoy utilizando estas pinzas viejas y romas, y como pueden ver, hay algunas burbujas aquí; haré todo lo posible por eliminarlas.

Pero estas burbujas más pequeñas no son, no son malas. No he notado ningún problema con estas burbujas más pequeñas. Simplemente no se desean burbujas grandes.

Así que voy a desplazarlos lo mejor posible y, definitivamente, limpiaré las pinzas con frecuencia, ya que de este modo se pueden evitar mejor las burbujas. Ahora, si pueden ver mi etiquetado, tengo una T arriba, en la parte superior, y una F a mi izquierda aquí. Esto simplemente me indica que la cabeza, la parte superior de la cabeza, irá hacia arriba y que la parte delantera o la cara quedará a mi izquierda.

De esta manera sé qué superficie seccionar para obtener cortes coronales y solo estoy moviendo ligeramente el tejido. Y nuevamente, a veces esto introduce burbujas y simplemente se desea expulsarlas para que no se congelen junto con el tejido. Por lo tanto, es perjudicial tener burbujas, principalmente porque al congelar, las burbujas en el tejido pueden provocar una congelación inconsistente.

El propósito de la congelación rápida es lograr que todo se congele de inmediato. Además, cuando se está cortando el tejido en el criostato, si la hoja atraviesa una burbuja en lugar del OCT o del tejido, puede provocar un enganche o un desgarro y, así, destruir o romper el tejido. Por lo tanto, es fundamental evitar estas burbujas a toda costa.

Los más grandes especialmente. Así que todavía estoy orientándolo aquí. Este tejido ha sido fijado durante 24 horas, por lo que es bastante resistente a mis manipulaciones.

Otro tejido podría ser un poco más blando, así que simplemente desea ser muy cuidadoso. Una vez que lo tengo posicionado bajo el microscopio con la cara hacia la izquierda y la parte superior de la cabeza hacia arriba, necesitaré asegurarme de que también esté correcto en otros planos de orientación. Así que voy a levantarlo y mirar a través de todas las caras del cubo para verificar que esté bien colocado.

Y veo que está ligeramente inclinado hacia abajo, así que debo levantarlo solo con la pinza. ¿De acuerdo? Y esto definitivamente requiere mucha práctica. Bien, se ve bien.

Ahora voy a acercarme aquí y congelarlo en nitrógeno líquido. Bien, ahora que el tejido está orientado correctamente en el molde criogénico, voy a verter mi nitrógeno líquido en este recipiente. Esto es simplemente un plato de Petri de plástico normal para cultivo de tejidos, hasta el borde superior.

Se evapora bastante rápido. Voy a tomar mis pinzas y bajar el molde criogénico. Y como pueden ver, en realidad he doblado el labio inferior.

Esto definitivamente permite un manejo mejor y más adecuado. Voy a congelarlo. Y a medida que el tejido y el OCT se congelan, adquieren un color blanco sólido.

Y una vez que esté completo, todo estará blanco. Luego debo colocar rápidamente el tejido congelado en el congelador a menos 80 para su almacenamiento. Debe sostenerlo de manera que el tejido no se sumerja.

Por lo tanto, debe tener mucho cuidado para sostenerlo solo en la superficie superior del nitrógeno líquido. Bien, ahora está congelado. Sosténgalo allí durante unos segundos adicionales antes de pasar al menos 80.

Vale, ahora lo voy a llevar al congelador de menos 80. He tomado mi tejido del congelador de menos 80 y lo he colocado en este criostato aquí. La cámara en realidad está a menos 24 grados Celsius.

En este momento, debe dejar que el tejido se equilibre durante aproximadamente media hora a una hora antes de poder comenzar a seccionar. De lo contrario, es demasiado frágil. Dado que todos los criostatos son diferentes, simplemente voy a señalar algunos aspectos básicos sobre esta máquina en particular.

Así que utilizamos el Leica CM 30 50 s. Es una buena máquina porque tiene una unidad de enfriamiento separada para la muestra misma, lo cual es una ventaja adicional interesante. Puedes establecer la temperatura de la muestra y diferentes tejidos requieren distintas temperaturas para el corte.

Por lo tanto, cuando cargue por primera vez su tejido, deberá realizar varios ajustes. Estos son similares en todos los criostatos. Estos componentes son electrónicos, y algunos de ellos se operan manualmente.

Por ejemplo, necesitará retraer el brazo del criostato o avanzarlo para colocarlo más lejos o más cerca de la cuchilla. Puede hacerlo rápido o lento. Puede ajustar el grosor de su corte con este más o menos aquí.

Y seleccionará entre el grosor del corte o del segmento, que se indica en el botón central aquí. A continuación, ajustará la temperatura de la cámara o del espécimen mismo junto a esta pantalla digital simplemente presionando esto y utilizando estas flechas hacia arriba o hacia abajo para modificar la temperatura. Entonces, para nosotros, cuando realizamos crioseccionado, utilizamos estas láminas microscópicas Super frosts plus de la marca fish fisher.

Están recubiertas con un adhesivo para que el tejido no se desprenda durante el procesamiento. A veces, durante el corte, notará que el tejido parece un poco blando, y algunos indicios de esto serán si al tocar la cuchilla se arruga. Para solucionar esto, puede utilizar el congelante súper amigable de la marca Fisher.

Este aparato congela rápidamente el tejido; simplemente apúntelo hacia su tejido y presione el gatillo para volver a congelar rápidamente el tejido si está demasiado blando. Antes de montar el tejido sobre un portamuestras para su corte, me gustaría mostrarle brevemente algunas partes de esta máquina. Aquí es donde se coloca realmente la cuchilla, la cual se asegura con esta placa metálica.

Al levantar este brazo, puede retirar y reemplazar la cuchilla según sea necesario. Asegúrese de que quede bien fija. No debe apretar demasiado la cuchilla, ya que de lo contrario se deformaría.

Y observará en su corte que el grosor del tejido no es uniforme. Por lo tanto, no debe presionar completamente este brazo hacia abajo; solo debe bajarlo hasta que quede aproximadamente a la altura de la hoja misma.

Esto es otra cosa que quizás tenga que ajustar durante el corte. Se llama placa anti-oscilación. Es un trozo de vidrio que se coloca en este soporte y se puede ajustar mediante este tornillo con resorte.

Y básicamente lo mueve hacia adelante o hacia atrás. Esto mantendrá su tejido o sus secciones planas para que pueda montarlas sobre un portaobjetos. Otra cosa que podría desear ajustar durante el corte es el lugar del filo que realiza el corte propiamente dicho.

Entonces, ¿cómo se realiza ese ajuste? Simplemente levante esta palanca y podrá deslizar todo el aparato hacia la izquierda o la derecha. Solo debe usar este ajuste si nota que el tejido se está enganchando en una parte específica de la cuchilla o si desea conservar las cuchillas, ya que son bastante costosas. Así, puede encontrar un área limpia y adecuada moviendo el aparato de un lado a otro.

Otra cosa que puede ajustar es el ángulo de corte. Ahora, en el lateral aquí, que no podrá ver, hay tres posiciones diferentes. Simplemente usamos la posición central y se ajusta levantando esta otra palanca.

Y, y eso puede, pueden hacer que este dispositivo suba y baje. Siempre lo mantenemos en el centro. Así que por ahora simplemente lo dejaré así.

Este de aquí atrás es la cabeza del criostato. En realidad sostiene la muestra de tejido congelado mientras se secciona. Se mueve hacia arriba y hacia abajo y avanza hacia la cuchilla.

Y básicamente usted monta el tejido sobre este portamuestras aquí y colocaremos el portamuestras en la cabeza, lo ajustaremos firmemente y luego usaremos estos controles en la parte trasera para ajustar el ángulo y lograr un corte más recto. Ahora voy a montar el tejido sobre el portamuestras. Desea mantener los portamuestras a temperatura ambiente porque primero agregará una capa de OCT y no quiere que se congele inmediatamente, ya que necesita que sea una capa uniforme y plana.

Y usaremos este dispositivo aquí para, se llama extractor de calor. En realidad, se utilizará para alisar el OCT mientras se congela. Lo primero que hago es tomar la muestra a temperatura ambiente y colocarla en este soporte aquí.

Tome algunas de mis burbujas de OCT. No importa aquí porque serán expulsadas. Simplemente agregue, un poco, no hace falta mucho.

Tome el extractor de calor y colóquelo justo allí abajo. Espere unos segundos. Y entonces podrá ver que el OCT está bien plano.

Entonces, ahora tengo mi tejido y necesito marcar el OCT real. Bien, marcaré un punto en el OCT para indicar su posición. Ahí, acabo de marcar la parte superior con un punto azul.

Ahora voy a sacar el bloque de tejido del molde, y lo hago simplemente presionando desde la parte posterior. Así que voy a empujar suavemente por detrás y hacer que caiga en mi mano, pero nuevamente, no quiero que se descongele. Por lo tanto, lo vuelvo a colocar inmediatamente dentro.

Así que ahora pueden ver el bloque de tejido con la marca azul que puse en él. Sé que esa es la parte superior de la cabeza del embrión. Y quiero realizar cortes a través de la cara porque se trata de secciones coronales.

Ahora añadiré otra gota grande de OCT, y debo actuar rápidamente porque todo está frío. Tomaré mi tejido y lo colocaré justo en el centro, asegurándome de que quede plano contra el lecho de OCT ya formado. Ahora dejaré que se congele, lo cual tomará aproximadamente uno o dos minutos.

Así que ahora ha terminado la congelación. Voy a tomar el tejido que está montado en el porta, colocarlo en la cabeza, colocarlo lo más recto posible y luego apretarlo. Puede, está bien apretado.

Voy a colocarlo justo delante de la hoja y luego avanzaré, lo cual podría tardar varios segundos. Bien, ahora voy a usar el borde plano de la hoja para realizar un posicionamiento preciso del tejido. Simplemente observaré el borde y moveré el tejido hacia arriba y hacia abajo para asegurarme de que los bordes queden alineados.

Si no lo hicieran, ya sabe, podría parecer algo así. Obviamente estoy exagerando, pero puede ver aquí que no está recto contra la cuchilla. Así que simplemente sigo haciendo ajustes hasta que sienta que está tan recto como pueda lograrlo.

Creo que eso está bastante bien. Así que miro desde todos los ángulos para asegurarme de que el tejido va a cortar recto contra la hoja, y uso el borde de la hoja para indicarlo. Así que estoy mirando desde arriba y desde el lado, y el tejido en realidad se ve bastante bien.

No tengo que hacer muchos ajustes, pero si los necesitara, simplemente usaría los controles que están en la parte trasera de la cabeza. Y al girarlos hacia la izquierda o hacia la derecha, se puede ver que es posible realizar ajustes finos de esa manera. Pero se ve bastante bien.

Ahora, estoy avanzando el tejido. Aún no está cortando porque no está en contacto con la cuchilla. El tejido está embebido profundamente dentro del OCT.

Por lo tanto, puede llevar varios minutos llegar al tejido. No desea avanzar demasiado rápido porque podría engancharse y agrietar el OCT y su tejido, pero tampoco desea ir demasiado lento porque podría llevar una eternidad. Hay una función útil en esta máquina que permite realizar un corte de recorte con una sección más gruesa, lo que le permitirá avanzar más rápidamente.

Ahora mismo estoy cortando realmente a través del OCT, así que estoy reduciendo un poco la velocidad. Aún no he llegado al tejido, pero este es el momento en que evalúo cómo va a desarrollarse el corte. Muchas variables pueden hacer que el corte de tu tejido salga muy bien o muy mal.

Lo que más a menudo sucede con este criostato es que el tejido está en realidad un poco demasiado frío. He reducido la temperatura, pero aún así parece que está un poco demasiado frío. Y lo que ocurre es que la cuchilla vibra al atravesar el tejido o el OCT.

Así obtendrá estas pequeñas líneas, estas líneas horizontales a través del OCT. Lo que hago es tomar mi pulgar y simplemente calentar el borde, calentar el OCT, tocándolo suavemente y deslizando mi pulgar, pero no por mucho tiempo. Luego, cuando realizo el corte, noto que los cortes salen mucho mejor y que el temblor ha desaparecido.

Entonces, esos son los tipos de aspectos que evaluaré antes de llegar al tejido. He notado que, a medida que la hoja avanza a través del tejido, se produce un enganche o, en realidad, una grieta en el OCT. Por lo tanto, una de las primeras cosas que hago es cambiar la hoja.

No estoy seguro de cuánto tiempo ha estado esta cuchilla aquí ni quién la usó antes que yo, así que voy a tomar una cuchilla nueva. Estas son muy afiladas, obviamente, así que hay que tener cuidado. Voy a ajustar la placa antideslizamiento y hay un tornillo con resorte en la parte inferior aquí que simplemente debes alcanzar por debajo para moverlo hacia adentro o hacia afuera.

Así que he avanzado y seccionado lo suficiente como para estar ahora en el tejido. Y desafortunadamente hay una grieta a través del bloque de OCT, lo cual ocurre a menudo y, lamentablemente, no se puede controlar realmente, pero hay cosas que se pueden hacer para solucionarlo. Si la grieta hubiera atravesado el tejido, entonces se debe descartar la muestra o intentar rescatar lo que se pueda.

En este caso, la grieta parece estar por encima del tejido. Entonces, lo que voy a hacer es tomar una cuchilla de afeitar que ha estado dentro del criostato. Está enfriada.

Y voy a intentar recortar solo la parte agrietada, que se encuentra en la parte superior del bloque de OCT. Así que nuevamente, usaré mi pulgar para calentar la superficie del bloque de OCT. Luego realizaré cortes, y si se puede ver aquí, está agrietado.

Entonces, retiré la pieza con el tejido y luego el resto del OCT que simplemente deseché; era la parte agrietada. Lo que voy a hacer es intentar recortar esa parte agrietada usando una cuchilla fría. Tengo que cortar en línea recta y debo usar ambas manos, aplicando presión uniforme sobre la cuchilla.

Y voy a mover la hoja hacia adelante y hacia atrás dentro del OCT. Así que estoy moviendo la hoja adelante y atrás, cortando lentamente en el OCT. Con suerte, estoy eliminando la parte agrietada.

Vale, voy a cortar eliminando este exceso de OCT. Bien, se ve adecuado. A continuación, voy a retraer ligeramente la cabeza porque he creado bordes que podrían engancharse en la cuchilla, y si eso ocurre, podría romperse el OCT y el tejido, lo cual arruinaría mi muestra.

Entonces he retraído, así que necesitaré avanzar un poco más para volver al tejido y espero haber corregido la fisura. Bien, ahora estoy volviendo al tejido. Bien, parece que sí la corregí.

Por lo tanto, ya no hay ninguna grieta en el OCT, lo que facilitará mucho la obtención de las secciones. Ahora voy a avanzar hasta la parte del tejido que me interesa. En este momento, acabo de alcanzar la superficie y me gustaría llegar al cerebro de este embrión.

Estos son lo suficientemente grandes como para que realmente pueda ver las estructuras en las que estoy interesado. No mencioné que uso estos pinceles para limpiar la cuchilla entre cada sección que voy a capturar. Este grande es solo para limpiar el área y eliminar el exceso de OCT.

También utilizo estos pinceles más finos para manipular el corte sobre esta placa fría para colocarlo correctamente cuando lo estoy capturando. Nuevamente, estos se mantienen fríos para que el OCT no se derrita y adhiera a los pinceles. Para capturar el tejido, primero voy a calentar el OCT y el tejido con mi pulgar.

Y tomaré uno de estos portaobjetos que ya he etiquetado. Lo sostengo boca abajo y cada persona lo hace de manera diferente. Pero la forma en que yo lo hago es sujetar esta esquina superior derecha cuando el portaobjetos está orientado hacia abajo, con la mano derecha.

Luego, uso mi pulgar izquierdo como punto de pivote para poder bajar directamente contra el portaobjetos y capturar la sección. El OCT y el tejido realmente se fundirán contra el portaobjetos y se montarán por sí solos. Primero caliento lentamente el tejido con mi pulgar, realizo el corte, tomo mi portaobjetos, sostengo la esquina derecha con mi mano derecha, muevo la placa, la bajo directamente y dejo que se funda.

Examinaré el tejido para asegurarme de que no haya pliegues ni burbujas y de que se vea bien. Y continuaré haciendo esto hasta seccionar completamente todo el cerebro. Ahora estoy observando las secciones mediante el microscopio estereoscópico para verificar que se vean adecuadas, y así es; se puede ver el prosencéfalo en la parte superior de la sección, y todas se ven muy bien.

Puede utilizar estas secciones criogénicas para aplicaciones como hibridación in situ. A veces realizamos histología básica, tinciones con hematoxilina y eosina. También puede realizarse inmunofluorescencia y, como sabe, una serie de ensayos similares.

Para mí en particular, estas secciones fueron fijadas y procesadas para hibridación in situ. Así que eso es lo que haré a continuación.