Name: Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a preparar células S2 de Drosophila para microscopía de luz usando lectina ConA y platos de fondo de vidrio. Este protocolo mejora la adherencia celular y permite visualizar proteínas marcadas con fluorescencia.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del Cáncer P30 CA23074, la Sociedad Americana del Cáncer Investigación Institucional subvención 74-001-31, y la Universidad del. de Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Para el campo de la biología celular, un sistema ideal sería barato de mantener, fácil de manipular, y es susceptible de una variedad de técnicas. Células S2 de Drosophila satisfacer estos requisitos, por lo que han convertido rápidamente en el sistema de elección para un creciente número de celular biología de los laboratorios. Hemos presentado un breve resumen de los métodos para preparar las células S2 para microscopía. Una virtud notable de las células S2 es el hecho de que crec...

<table><tbody><tr><td>Células S2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Células S2</td><td>DGRC</td><td>número de stock 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Células S2</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>medio sin suero</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>medio sin suero</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>medio sin suero</td></tr><tr><td>Medio S2 de Schneider&amp;rsquo;s</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Añadir 10% (final) de SFB inactivado por calor para obtener el medio completo.</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>inactivado por calor</td></tr><tr><td>Solución de antibiótico 100x</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>contiene penicilina (10000 U/mL),&lt;br/&gt;estreptomicina (10000 &amp;#x03BC;g/mL) y&lt;br/&gt;anfotericina B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>solución al 32%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anhidro, grado ACS</td></tr><tr><td>Cribas moleculares</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>tipo 3A</td></tr></tbody></table>

preparación de drosophila células s2 para microscopía de luz

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

El sistema experimental ideal sería barato y fácil de mantener, susceptibles de una variedad de técnicas, y sería apoyado por una extensa bibliografía y base de datos de secuencia del genoma. Cultivos de células S2 de Drosophila, el producto de desvincularse 20-24 embriones horas de edad 1, posee todas estas propiedades. En consecuencia, las células S2 son extremadamente bien adaptado para el análisis de los procesos celulares, incluyendo el descubrimiento de los genes que codifican los componentes moleculares del proceso o mecanismo de interés. Las características de las células S2 que son más responsables de su utilidad son la facilidad con que se mantienen, su exquisita sensibilidad a doble cadena (ds) mediada por RNA de interferencia (RNAi), y su docilidad a la microscopía de fluorescencia, ya sea en vivo o fija las células. S2 células pueden ser cultivadas en una variedad de medios, incluyendo un número de bajo costo, disponibles en el mercado, completamente definido, medio libre de suero 2. Además, crecen de manera óptima y rápida a 21-24 ° C y se pueden cultivar en una variedad de recipientes. A diferencia de las células de mamíferos, las células S2 no requieren de un ambiente regulado, sino hacer bien con el aire normal, e incluso se puede mantener en frascos sellados. Como complemento a la facilidad de ARNi en las células S2 es la capacidad de analizar rápidamente fenotipos inducidos experimentalmente por fase o microscopía de fluorescencia de células fijas o en vivo. S2 células crecen en la cultura como una sola monocapa, pero no muestran inhibición por contacto. En cambio, las células tienden a crecer en colonias en cultivos densos. A baja densidad, las culturas S2 crecido en el vidrio o el plástico de cultivo de tejidos tratados son redondos y poco adheridas. Sin embargo, la citología de las células S2 puede ser mejorado mediante la inducción de ellos para aplanar ampliamente cultivando brevemente sobre una superficie recubierta con la lectina, concanavalina A (ConA) 3. S2 células también pueden ser transfectadas establemente con marcadores de fluorescencia con etiquetas a las estructuras de la etiqueta u orgánulos de interés en las células vivas o fijas. Por lo tanto, el escenario habitual para el análisis microscópico de las células es la siguiente: las primeras células, S2 (que puede tener para expresar transgenes marcadores etiquetados) son tratados por RNAi para eliminar una proteína diana (s). Tiempo de tratamiento RNAi puede ser ajustado para permitir que las diferencias en las proteínas a su vez-sobre la cinética y para minimizar el trauma de células / la muerte si la proteína diana es importante para la viabilidad. A continuación, las células tratadas se transfirió a una placa que contiene un cubreobjetos pre-recubiertos con ConA inducir a las células para difundir y se adhieren firmemente al vidrio. Finalmente, las células son expuestas con la elección del investigador de los modos de microscopía. S2 células son particularmente buenos para los estudios que requieren la visualización ampliada de células vivas ya que estas células mantenerse saludable a temperatura ambiente y la atmósfera normal.

Drosophila Schneider (S2), las células son un sistema cada vez más popular para el descubrimiento y el análisis funcional de los genes. Nuestro objetivo es describir algunas de las técnicas microscópicas que hacen que las células S2 como un sistema experimental cada vez más importante.

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

El sistema experimental ideal sería económico y fácil de mantener, adaptable a una variedad de técnicas y estaría respaldado por una bibliografía extensa...

El objetivo general de este procedimiento es describir la preparación de células S de Drosophila para microscopía óptica. Esto se logra primero preparando placas de cultivo con fondo de vidrio. El segundo paso del procedimiento consiste en recubrir el fondo de vidrio con la lectina conval.Un para promover la adhesión y aplanamiento de las células S dos. El tercer paso del procedimiento consiste en agregar medio de cultivo y células S dos al recipiente de cultivo. El paso final del procedimiento es fijar y realizar inmunotinción en las células S dos dentro del recipiente de cultivo.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la localización de proteínas de interés marcadas con fluoro cuatro o mediante inmunomarcaje, a través de microscopía de fluorescencia de células S dos vivas o fijadas, respectivamente. Hola, soy Joey Club del laboratorio de Greg Rogers en el Departamento de Anatomía y Biología Celular de la Universidad de Arizona. Soy John Nye, también del Laboratorio Rogers.Y yo también soy Dan Buster. Estoy en el laboratorio de Greg Rogers. Hoy les mostraremos un procedimiento para preparar células S2 de Drosophila para microscopía óptica.Utilizamos este procedimient

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Investigación

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Biología

Un método simple, barato y eficaz de la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis se presenta. El protocolo proporciona la humedad y el intercambio de gases y no comprime el embrión de Drosophila. Este método es adecuado para las buenas prácticas agrarias basadas en imágenes en vivo de embriones de Drosophila utilizando un microscopio estereoscópico o el microscopio compuesto en posición vertical.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

Se describe un proceso para la fijación, inclusión, corte, y las imágenes de la etapa...

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Preparación de los adultos Drosophila Ojos de seccionamiento fino y análisis microscópico

Células S2 de Drosophila y neuronas cultivadas son grandes sistemas de obtención de imágenes de orgánulos de transporte con motor in vivo. Aquí se describen los protocolos detallados para el cultivo de ambos tipos de células, su imagen y el análisis de los transportes.

Orgánulos Transporte en Cultivadas Drosophila Celdas: S2 Línea Celular y neuronas primarias.

Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

Análisis de SEM es un método eficaz para ayudar en la identificación de las especies o la discriminación fenotípica. Este protocolo describe los métodos para examinar los detalles morfológicos específicos de tres tipos representativos de organismos y sería ampliamente aplicable a examinar características de muchos organismos y tipos de tejidos.

Preparación de los organismos procarióticos y eucarióticos con secado químico para análisis morfológico en microscopía electrónica de barrido (SEM)

Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz es la herramienta más valiosa en biología del desarrollo. Un problema importante en los estudios comparativos es la varianza ambiental. Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea de especímenes múltiples y, por lo tanto, trata este problema favorablemente activamente.

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Aquí, se presenta un protocolo para la implementación de microscopía de expansión en embriones tempranos de Drosophila para lograr imágenes de superresolución utilizando un microscopio confocal convencional de barrido láser.

Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución

Aprende a preparar células S2 de Drosophila para microscopía de luz usando lectina ConA y platos de fondo de vidrio. Este protocolo mejora la adherencia celular y permite visualizar proteínas marcadas con fluorescencia.

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

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