Name: Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a preparar células S2 de Drosophila para microscopía de luz usando lectina ConA y platos de fondo de vidrio. Este protocolo mejora la adherencia celular y permite visualizar proteínas marcadas con fluorescencia.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del Cáncer P30 CA23074, la Sociedad Americana del Cáncer Investigación Institucional subvención 74-001-31, y la Universidad del. de Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Para el campo de la biología celular, un sistema ideal sería barato de mantener, fácil de manipular, y es susceptible de una variedad de técnicas. Células S2 de Drosophila satisfacer estos requisitos, por lo que han convertido rápidamente en el sistema de elección para un creciente número de celular biología de los laboratorios. Hemos presentado un breve resumen de los métodos para preparar las células S2 para microscopía. Una virtud notable de las células S2 es el hecho de que crec...

<table><tbody><tr><td>Células S2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Células S2</td><td>DGRC</td><td>número de stock 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Células S2</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>medio sin suero</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>medio sin suero</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>medio sin suero</td></tr><tr><td>Medio S2 de Schneider&amp;rsquo;s</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Añadir 10% (final) de SFB inactivado por calor para obtener el medio completo.</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>inactivado por calor</td></tr><tr><td>Solución de antibiótico 100x</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>contiene penicilina (10000 U/mL),&lt;br/&gt;estreptomicina (10000 &amp;#x03BC;g/mL) y&lt;br/&gt;anfotericina B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>solución al 32%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anhidro, grado ACS</td></tr><tr><td>Cribas moleculares</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>tipo 3A</td></tr></tbody></table>

preparación de drosophila células s2 para microscopía de luz

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

El sistema experimental ideal sería barato y fácil de mantener, susceptibles de una variedad de técnicas, y sería apoyado por una extensa bibliografía y base de datos de secuencia del genoma. Cultivos de células S2 de Drosophila, el producto de desvincularse 20-24 embriones horas de edad 1, posee todas estas propiedades. En consecuencia, las células S2 son extremadamente bien adaptado para el análisis de los procesos celulares, incluyendo el descubrimiento de los genes que codifican los componentes moleculares del proceso o mecanismo de interés. Las características de las células S2 que son más responsables de su utilidad son la facilidad con que se mantienen, su exquisita sensibilidad a doble cadena (ds) mediada por RNA de interferencia (RNAi), y su docilidad a la microscopía de fluorescencia, ya sea en vivo o fija las células. S2 células pueden ser cultivadas en una variedad de medios, incluyendo un número de bajo costo, disponibles en el mercado, completamente definido, medio libre de suero 2. Además, crecen de manera óptima y rápida a 21-24 ° C y se pueden cultivar en una variedad de recipientes. A diferencia de las células de mamíferos, las células S2 no requieren de un ambiente regulado, sino hacer bien con el aire normal, e incluso se puede mantener en frascos sellados. Como complemento a la facilidad de ARNi en las células S2 es la capacidad de analizar rápidamente fenotipos inducidos experimentalmente por fase o microscopía de fluorescencia de células fijas o en vivo. S2 células crecen en la cultura como una sola monocapa, pero no muestran inhibición por contacto. En cambio, las células tienden a crecer en colonias en cultivos densos. A baja densidad, las culturas S2 crecido en el vidrio o el plástico de cultivo de tejidos tratados son redondos y poco adheridas. Sin embargo, la citología de las células S2 puede ser mejorado mediante la inducción de ellos para aplanar ampliamente cultivando brevemente sobre una superficie recubierta con la lectina, concanavalina A (ConA) 3. S2 células también pueden ser transfectadas establemente con marcadores de fluorescencia con etiquetas a las estructuras de la etiqueta u orgánulos de interés en las células vivas o fijas. Por lo tanto, el escenario habitual para el análisis microscópico de las células es la siguiente: las primeras células, S2 (que puede tener para expresar transgenes marcadores etiquetados) son tratados por RNAi para eliminar una proteína diana (s). Tiempo de tratamiento RNAi puede ser ajustado para permitir que las diferencias en las proteínas a su vez-sobre la cinética y para minimizar el trauma de células / la muerte si la proteína diana es importante para la viabilidad. A continuación, las células tratadas se transfirió a una placa que contiene un cubreobjetos pre-recubiertos con ConA inducir a las células para difundir y se adhieren firmemente al vidrio. Finalmente, las células son expuestas con la elección del investigador de los modos de microscopía. S2 células son particularmente buenos para los estudios que requieren la visualización ampliada de células vivas ya que estas células mantenerse saludable a temperatura ambiente y la atmósfera normal.

Drosophila Schneider (S2), las células son un sistema cada vez más popular para el descubrimiento y el análisis funcional de los genes. Nuestro objetivo es describir algunas de las técnicas microscópicas que hacen que las células S2 como un sistema experimental cada vez más importante.

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

El sistema experimental ideal sería económico y fácil de mantener, adaptable a una variedad de técnicas y estaría respaldado por una bibliografía extensa...

El objetivo general de este procedimiento es describir la preparación de células S de Drosophila para microscopía óptica. Esto se logra primero preparando placas de cultivo con fondo de vidrio. El segundo paso del procedimiento consiste en recubrir el fondo de vidrio con la lectina conval.Un para promover la adhesión y aplanamiento de las células S dos. El tercer paso del procedimiento consiste en agregar medio de cultivo y células S dos al recipiente de cultivo. El paso final del procedimiento es fijar y realizar inmunotinción en las células S dos dentro del recipiente de cultivo.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la localización de proteínas de interés marcadas con fluoro cuatro o mediante inmunomarcaje, a través de microscopía de fluorescencia de células S dos vivas o fijadas, respectivamente. Hola, soy Joey Club del laboratorio de Greg Rogers en el Departamento de Anatomía y Biología Celular de la Universidad de Arizona. Soy John Nye, también del Laboratorio Rogers.Y yo también soy Dan Buster. Estoy en el laboratorio de Greg Rogers. Hoy les mostraremos un procedimiento para preparar células S2 de Drosophila para microscopía óptica.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la regulación de la duplicación centriolar en Drosophila mediante el análisis de los cambios en el número y la estructura de los centríolos tras la eliminación o sobreexpresión de proteínas reguladoras importantes. Comencemos. Utilizamos placas de Petri estándar de 35 milímetros para fabricar nuestros portaobjetos con fondo de vidrio.Estos platos con fondo de vidrio mantienen a las células en una condición muy similar a su condición normal de cultivo, y además permiten examinar células vivas mediante un microscopio a través de vidrio de calidad microscópica. Para el ensamblaje de los platos con fondo de vidrio, se utiliza como superficie de perforación una superficie cubierta con cinta adhesiva de una caja de poliestireno con paredes gruesas. Coloque la mitad inferior de un plato de Petri de 35 milímetros sobre la superficie de perforación, con la parte inferior del plato en contacto con la caja de poliestireno, y sujetando firmemente los lados del plato, use un taladro manual con una broca plana de tres cuartos de pulgada para perforar un orificio a través del plato.Después de perforar todos sus recipientes, utilice una broca cónica de molienda con grano grueso y un diámetro aproximadamente igual al de la broca plana para alisar el borde exterior de los orificios. Coloque el taladro eléctrico de lado, con la broca sobresaliendo por el borde de la encimera. Sujete el taladro en su lugar colocando un objeto pesado pero maleable encima, como una bolsa resistente de plástico que contenga 10 kilogramos de arena.Utilice el botón de bloqueo para mantener la taladradora en funcionamiento continuo. Alise el borde de su placa sosteniéndola y moviéndola contra la fresa para eliminar el borde irregular del nuevo orificio. Una vez que se hayan alisado los bordes externos de los orificios, coloque los fondos de las placas en un vaso precipitado grande y enjuáguelos varias veces con agua destilada.Esto eliminará los pequeños trozos sueltos de plástico o espuma de poliestireno, que luego flotarán. Coloque los fondos de los recipientes a secar. Cuando los recipientes estén secos, prepare el pegamento Sard 180 4.Mezcle la resina y el agente de curado en una proporción de 10 a 1 en peso y agite completamente. Aplique un pequeño círculo de pegamento alrededor del orificio perforado en la superficie exterior de cada placa. A continuación, coloque un cubreobjetos sobre el orificio en contacto con el pegamento.El cubreobjetos debe ser de al menos aproximadamente un milímetro más grande que el orificio que hay en la placa de Petri y más pequeño que el diámetro de la placa. El cubreobjetos debe ajustarse contra la placa de manera suave y uniforme. Ahora, deje las placas aparte.Lado inferior, hasta secar. Esto puede tardar un día o más a temperatura ambiente, pero se puede aumentar la velocidad de curado colocando las placas en una incubadora cálida. Una vez que las placas estén secas, se pueden recubrir con la lectina con A o con A. Utilizamos con A porque las dos células que se adhieren a cubreobjetos recubiertos con con A se aplanarán ampliamente y se convertirán en excelentes especímenes para microscopía.Para recubrir un portaobjetos, en un recipiente con fondo de vidrio, extienda 10 microlitros de solución conne sobre la cara superior del vidrio. Después de secar, esterilice el recipiente y su tapa con luz UV. En una cabina de cultivo celular, gire las piezas de modo que sus superficies internas queden directamente frente al bulbo UV y encienda la luz UV esterilizadora durante al menos 45 minutos.Las células S2 pueden cultivarse en diversos medios. Para nuestros fines, utilizamos el medio VITROGEN SF 902. Para preparar células S2 tratadas con ARNipara microscopía, suspenda suavemente las células y transfiéralas a un platillo con fondo de vidrio recubierto con conne que contenga dos mililitros de medio. Las células sanas que entren en contacto con la cubierta recubierta con conne se adherirán firmemente a ella y comenzarán a extenderse.Este proceso debería ser evidente alrededor de los 15 minutos y debe completarse entre los 45 minutos y una hora. Dado que las células S dos se mantienen fácilmente bajo condiciones normales de temperatura y atmósfera en el laboratorio, no se necesitan condiciones ni equipos especiales cuando las células están en el microscopio para prevenir la deshidratación; mantenga suficiente medio en la placa durante el uso del microscopio. Es posible realizar imágenes en vivo de células S dos durante períodos prolongados.La duración de estos experimentos está limitada únicamente por los problemas habituales de fotoblanqueo y fototoxicidad. Las dos células S pueden fijarse en un recipiente con fondo de vidrio o en un cubreobjetos común. Sin embargo, en este video demostraremos la fijación y la inmunotinción en un recipiente con fondo de vidrio.El metanol y el formaldehído son dos fijadores comunes para células S2. Para la fijación celular con metanol, primero enfríe aproximadamente 300 mililitros de metanol anhidro en un vaso de vidrio de un litro con tapa, dentro de un congelador a prueba de explosiones a menos 20 grados Celsius. Cuando el metanol esté frío, retírelo del congelador. Retire rápidamente el medio del recipiente de fondo de vidrio y luego sumerja rápidamente el recipiente en el metanol.Devuelva rápidamente el vaso que contiene la placa al congelador y fije las células durante 10 a 15 minutos. Después de 10 a 15 minutos, retire la placa del vaso, vierta todo el metanol restante y rehidrate las células. Al agregar PBST, las células ya están listas para los procedimientos estándar de tinción, como se demostrará más adelante para la fijación celular.Con formaldehído, utilizamos formaldehído al 10 % y tampón. Se utiliza esta concentración relativamente alta de formaldehído porque las células S2 carecen de filamentos intermedios citoplasmáticos, que de otro modo ayudarían a mantener la morfología y la organización celular durante el proceso de fijación. Fije las células en formaldehído al 10 % durante 10 a 15 minutos.Una vez que la fijación esté completa, vierta el formaldehído en un vaso de desecho y lave las células fijadas con tres lavados breves de PBST. Comience el procedimiento de inmunotinción añadiendo un mililitro de solución bloqueante a las células fijadas durante 15 minutos. Habitualmente utilizamos suero de cabra normal al 5 % en PBST.Vierta la solución de bloqueo y agregue el anticuerpo primario directamente sobre las células. Vuelva a colocar la tapa de la placa de Petri sobre el recipiente para evitar la evaporación de la solución de anticuerpo y deje que el anticuerpo incube con las células durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, retire la solución de anticuerpo primario.Utilice una pipeta de transferencia para agregar dos mililitros de PBST al recipiente y espere cinco minutos antes de reemplazar el PBST. Luego, lave tres veces con PBST. Después del lavado final, agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario directamente sobre las células.Coloque la tapa de la placa de Petri nuevamente sobre el recipiente y deje que el anticuerpo incube con las células durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando hayan transcurrido los 30 minutos, retire el anticuerpo secundario y realice tres lavados de cinco minutos con PBST.Finalmente, agregue unas gotas de medio de montaje directamente sobre las células. Vuelva a colocar la tapa de la placa de Petri y, si es necesario, almacene el recipiente a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Aquí se muestran imágenes representativas de contraste de fase de células S2 después del siembraje en una placa con fondo de vidrio recubierto, donde los números indican los minutos transcurridos tras el siembraje.El aplanamiento espontáneo es evidente a los 15 minutos y esencialmente completo a los 60 minutos. Observe que las células se vuelven oscuras en fase conforme se aplanan sobre la cubierta recubierta. En esta imagen ampliada de células adheridas, sus márgenes extendidos y aplanados, indicados por la punta de flecha, son claramente visibles.Pueden transfectarse dos células para expresar proteínas marcadas con fluorescencia que señalan estructuras de interés en células fijadas o vivas. En este ejemplo, se transfectaron transitoriamente dos células con un constructo de fusión que consiste en nucleofoina, un marcador para el núcleo fusionado al fluoróforo EGFP. Estas células se sembraron en un platillo con fondo de vidrio recubierto con cona y luego se observaron mediante contraste de interferencia diferencial (DIC) y fluorescencia epiescopia.Las células S2 tratadas con ARNip también pueden fijarse y analizarse mediante inmunofluorescencia. Estas imágenes muestran células S2 fijadas, inmunotincionadas para el marcador central PLP mostrado en verde y microtúbulos mostrados en rojo, así como tinción con DAPI para cromosomas mostrados en azul. Antes de la fijación y la inmunotinción, las células fueron sometidas a un tratamiento de cuatro días con ARNip de control o ARNip para silenciar la proteína NCDA KINESIN, que promueve la focalización del polo del huso.El tratamiento con ARNi de NCD produjo células con polos del huso separados y husos desorganizados. Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener mucha precaución al perforar agujeros en las placas de cultivo. Eso es todo.Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

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