Fotoconversión purificada de proteínas fluorescentes y de doble sonda óptica destacar en células vivas

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar las proteínas fluorescentes M orange dos y andron como marcadores ópticos duales para etiquetar selectivamente cuatro poblaciones celulares individuales o compartimentos celulares. Esto se logra primero iluminando las células con luz de excitación de baja intensidad a 488 nanómetros para apagar toda la fluorescencia verde generada por el per. Como segundo paso, las células se exponen a luz de excitación de alta intensidad a 488 nanómetros, que fotoconvierte la fluorescencia de M orange a rojo.

A continuación, las células se exponen a una excitación de dos fotones de 800 nanómetros con el fin de activar la fluorescencia de dral. Una vez más, los resultados obtenidos muestran que es posible etiquetar células en cuatro combinaciones distintas basadas en el resaltado óptico dual con M Orange dos y drawn ppa. La principal ventaja de este procedimiento frente a experimentos existentes, como la fraccionación subcelular, es que se realiza en células vivas.

Este procedimiento puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de las células beta, como por qué solo una pequeña fracción de las vesículas de insulina son secretadas. Aunque este procedimiento puede proporcionar información sobre la función de las células beta, también puede aplicarse a otros sistemas. Por ejemplo, el seguimiento de células cancerosas in vivo; una muestra de gotas de proteína fluorescente consiste en una emulsión octal de agua con una proteína fluorescente ubicada en la fase acuosa.

Esta emulsión se coloca entre una lámina de microscopio y una cubreobjetos cuadrada de 22 milímetros para aplicaciones de microscopía. Al inicio de este procedimiento, las láminas y las cubreobjetos deben limpiarse y recubrirse con un agente hidrofóbico. Limpie el material de vidrio lavándolo durante cinco minutos con acetona.

Después del lavado, deje que el material de vidrio se seque al aire. A continuación, prepare una solución al 2% de metil trimetoxisilano en acetona y recubra el material de vidrio con la solución durante dos minutos. Después del recubrimiento, retire el material de vidrio de la solución y deje que se seque.

Luego enjuague el material de vidrio con etanol al 70 % de un frasco rociador. Después del enjuague, deje secar al aire el material de vidrio nuevamente y elimine cualquier líquido residual. Utilizando aire presurizado, el material de vidrio recubierto puede almacenarse durante al menos un mes.

Una vez que el material de vidrio haya sido preparado, obtenga las proteínas fluorescentes que previamente han sido purificadas como proteínas con marcaje de his provenientes de e coli. Mida el espectro de absorbancia de la proteína purificada. Prepare una dilución stock con una densidad óptica de aproximadamente 0,1 en solución de salina tamponada con tris con pH ocho que contenga albúmina sérica bovina al 0,1 %.

Además, prepare 10 mililitros de una mezcla uno a uno de octal y solución salina tamponada con tris en un tubo cónico de 15 mililitros y mezcle enérgicamente. Después de mezclar, deje reposar la mezcla hasta que la separación de fases esté completa. La fase superior es el octal; para preparar la emulsión, pipete 45 microlitros de octal y 5 microlitros de proteína fluorescente en un tubo epi oph.

Toque el tubo varias veces para iniciar la formación de la emulsión, luego someta el tubo a sonicación durante 30 segundos en un baño de sonicación. Mientras tanto, prepare un portaobjetos recubierto y un cubreobjetos tras la sonicación. La emulsión debe quedar completamente turbia.

Pipetee inmediatamente cuatro microlitros de la emulsión desde el centro del tubo sobre un portaobjetos de microscopio recubierto y cúbralo con un cubreobjetos recubierto. La emulsión debe extenderse uniformemente entre el portaobjetos y el cubreobjetos. En cuestión de minutos, la muestra debería estabilizarse.

El siguiente procedimiento es una estrategia general para configurar un experimento de fotoconversión de proteínas fluorescentes en un microscopio confocal de barrido láser. Este procedimiento puede aplicarse tanto a proteínas purificadas como a células vivas. En este experimento, se utiliza una muestra en gota que contiene la proteína purificada m orange two como punto de partida general para el experimento de fotoconversión.

Configure el microscopio confocal de barrido láser como sigue. Utilice un objetivo de inmersión en aceite de 40 x 1,3 de apertura numérica y un tamaño de imagen de 512 por 512 píxeles. Establezca el tiempo de permanencia del píxel en seis microsegundos, el zoom en cuatro y aumente el tamaño del diafragma para que coincida con una resolución Z de tres micrones.

Configure dos canales de detección para la fluorescencia inicial y la convertida por fotoconversión, así como un canal de fotoconversión. Observe las especies naranjas utilizando luz de excitación de 561 nanómetros y recoja la fluorescencia entre 570 y 630 nanómetros. Detecte las especies rojas convertidas por fotoconversión utilizando luz de excitación de 633 nanómetros y recoja la fluorescencia entre 640 y 700 nanómetros.

Para el canal de conversión fotónica, seleccione la línea láser de 488 nanómetros y recoja la fluorescencia entre 490 y 540 nanómetros. La imagen del canal de conversión fotónica no es estrictamente necesaria, pero puede ser útil. Para comenzar el experimento, utilice el canal del detector para obtener imágenes de la fluorescencia inicial mediante escaneo continuo, ajustando la potencia del láser y la ganancia del detector para lograr una calidad óptima de la imagen.

Luego active el canal de conversión fotónica y seleccione la baja potencia del láser. Comience a obtener una serie de imágenes de lapso de tiempo y aumente gradualmente el láser de conversión fotónica hasta observar un blanqueo significativo de la fluorescencia inicial. Continúe escaneando hasta que la fluorescencia inicial se haya blanqueado aproximadamente en un 75 %.

A continuación, desactive el canal de fotoconversión y active el canal de detección para la fluorescencia fotoconvertida. Comience la adquisición de imágenes con una ganancia del detector alta y una potencia baja del láser. Luego aumente gradualmente la potencia del láser hasta detectar la fluorescencia fotoconvertida.

Una vez detectado, ajuste la potencia del láser y la detección o la ganancia para obtener una calidad óptima de la imagen. Finalmente, optimice la potencia del láser utilizada para la fotoconversión, así como su duración. Aumentar la potencia del láser acelerará la tasa de fotoconversión.

Sin embargo, una potencia láser excesiva provocará fotoblanqueo de la proteína. Una vez que se hayan determinado la conversión fotoquímica óptima, la potencia y la duración del láser, estos parámetros pueden utilizarse para configurar un módulo estándar de fotoblanqueo o un módulo de recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo. Entonces, el canal de conversión fotoquímica ya no será necesario debido a las propiedades espectrales de desplazamiento al rojo de M naranja dos.

Se puede utilizar en combinación con la proteína fluorescente fotoswitchable verde denominada PU para resaltar ópticamente con doble sonda. Para comenzar el resaltado óptico con doble sonda, cultive células HeLa en placas con fondo de vidrio. Transfecte las células con plásmidos que codifiquen las proteínas fluorescentes 24 horas antes de la adquisición de imágenes, utilizando una transfección estándar con LIPECTOMY 2000.

Coloque las células vivas en un microscopio confocal de barrido láser y configure el microscopio para la conversión con dos fotones de M orange según se describió anteriormente. Luego, configure el microscopio para el cambio fotoinducido de DPA. DPA se excita con luz de 488 nanómetros y su fluorescencia puede visualizarse utilizando el canal de conversión con dos fotones de M orange.

Asegúrese de minimizar la potencia del láser utilizada para la imagen de MPA, ya que una potencia excesiva provocará la inactivación de mpa. Añada un canal para la fotoactivación de MPA utilizando una excitación de dos fotones a 800 nanómetros; posteriormente, determine la potencia del láser necesaria para la imagen de la fotoactivación y la foto-inactivación de la fluorescencia OFA.

Uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento consiste en inactivar la RPA sin fotoconvertir M naranja, ya que ambos eventos ocurren a la misma longitud de onda. Para evitar esto, es muy importante optimizar cuidadosamente la fotoconversión.

Potencia y duración del láser Tenga precaución con la fotoconversión de M orange dos. Una inactivación de PU ambos ocurre tras la excitación con luz de 488 nanómetros para inactivar PU sin una fotoconversión significativa de M orange dos. Utilice una potencia de láser más baja una vez establecidos los parámetros para la fotoconversión de M orange dos y el conmutado fotoinducido de DPA.

Se puede lograr un resaltado óptico con doble sonda. Primero, desactive la fluorescencia de DPA en todo el campo de visión mediante excitación de baja potencia a 488 nanómetros. Luego, seleccione una región de interés y convierta m orange dos con excitación de alta potencia a 488 nanómetros.

Finalmente, seleccione una región de interés y active la fluorescencia de DPA mediante excitación de dos fotones a 800 nanómetros. Las muestras de gotas de proteína fluorescente son particularmente adecuadas para configurar aplicaciones de fotoconversión en microscopía confocal. Cuando la muestra de gotas se prepara correctamente, las gotas aparecen muy homogéneas.

Sin embargo, cuando la muestra se prepara sin recubrir la portaobjetos del microscopio con un cubreobjetos, las gotas tienden a aplastarse contra una de las superficies de vidrio en las muestras preparadas. En ausencia de BSA al 0,1 %, la proteína fluorescente tiende a acumularse en una de las interfaces agua-aceite. La creación de un halo de fluorescencia por conversión fotónica depende críticamente de la potencia del láser y de la duración de la exposición.

Demasiada potencia láser o una exposición demasiado prolongada causará fotoblanqueo y dará como resultado una reducción de la fluorescencia roja fotoconvertida. Las propiedades espectrales distintas de M naranja dos y PHO permiten el resaltado óptico dual con dos sondas antes de la fotoconversión. Las células que expresan M naranja dos, histona H dos B y DPA mito muestran fluorescencia naranja en el núcleo y fluorescencia verde en las mitocondrias. Cuando toda la fluorescencia se apaga con excitación de baja potencia a 488 nanómetros, ocurre una fotoconversión mínima de M naranja.

Dos M naranja dos pueden convertirse luego fotoquímicamente a rojo con excitación de 488 nanómetros de alta potencia. Una vez que M naranja dos se ha convertido fotoquímicamente, la fluorescencia del bulto marcado puede reactivarse mediante excitación bifotónica de 800 nanómetros. Con resaltado óptico de doble sonda, las células pueden etiquetarse de cuatro maneras distintas.

Mediante esta técnica, es posible etiquetar específicamente cuatro poblaciones celulares diferentes. Como se ha observado, uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento consiste en inactivar MPA sin fotoconvertir mOrange. Una vez dominado, se pueden realizar experimentos adicionales utilizando este sistema, por ejemplo, el seguimiento de múltiples poblaciones en células beta pancreáticas.

Así que eso es todo. Espero que esta presentación les haya resultado útil y les deseo suerte con sus experimentos.