Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano
16 de junio de 2010
Estímulo evocado [Ca 2 +] I las señales de los espermatozoides humanos individuales se evalúan. Células móviles se cargan con Ca 2 + Sensibles tinte fluorescente (AM-éster método) e inmovilizados en una cámara de perfusable. Las células son fotografiadas por microscopía de fluorescencia time-lapse y estimulado por el medio de perfusión. Las respuestas de las células individuales (o regiones) se analizan en línea con Excel.
El objetivo general de este procedimiento es obtener series de imágenes de espermatozoides humanos inmovilizados marcados con un colorante fluorescente indicador de calcio. Primero, las células móviles se aíslan del plasma seminal mediante una ascensión activa hacia el medio de incubación. Después de la capacitación, las células se marcan con un indicador fluorescente de calcio y luego se transfieren a una cámara de imagen fundible, que se monta en un microscopio de fluorescencia invertido.
Las respuestas de la concentración de iones de calcio se capturan como una serie de imágenes lapse de tiempo y se analizan para extraer las respuestas de células individuales. Hola, soy Edwin Andres Morales Garcia del laboratorio del Dr. Steven J. Public Cova en la Escuela de Ciencias Biosanitarias de la Universidad de Birmingham del Reino Unido. Soy Katherine Nash, también del Public Overlap.
Y soy Jennifer Morris del Public Overlap. Hoy mostraremos el procedimiento para obtener imágenes de las respuestas de calcio intracelular en células individuales de esperma humano. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la regulación de las actividades espermáticas mediante estímulos derivados del óvulo y del tracto femenino.
Así que comencemos. Almacene las muestras de semen a 37 grados Celsius durante no más de 30 minutos a partir del momento de la recolección para aislar las células móviles del plasma seminal. Añada un mililitro de solución salina balanceada L'S suplementada con 0,3 % de BSA, abreviada como S-E-B-S-S, en una serie de tubos de poliestireno de cinco mililitros con fondo redondo. Deposite suavemente el S-E-B-S-S en cada tubo debajo de 0,3 mililitros de semen y tape el tubo ligeramente.
Incube los tubos en un ángulo de 45 grados durante una hora a 37 grados Celsius y 6% de dióxido de carbono. Para permitir que las células móviles naden hacia el S-E-B-S-S, retire cuidadosamente por pipeteo los primeros 0,7 mililitros de la solución y reúna la solución de todos los tubos en un tubo cónico limpio de 15 mililitros de poliestireno. Agite suavemente para mezclar y cuente las células que han sido inmovilizadas con formalina en una nueva cámara de recuento.
Lleve la concentración a 6 millones de células por mililitro en S-E-B-S-S y divida el esperma en alícuotas de 200 microlitros en tubos de poliestireno de cinco mililitros con fondo redondo. Tape de forma suelta. Si se está estudiando la respuesta de células capacitadas, incube los tubos durante cinco a seis horas a 37 grados Celsius y 6% de dióxido de carbono para permitir la capacitación. Aplique 10 microlitros de polilisina al 10% en forma de varias gotas pequeñas al centro de un portaobjetos de 22 por 50 milímetros.
Cubra con el portaobjetos número uno y deje secar completamente. Utilice grasa de vacío para fijar el portaobjetos con el lado tratado hacia arriba a una cámara de imagen fusible construida. Para este fin.
Para cada experimento de obtención de imágenes, seleccione un solo tubo de células capacitadas y agregue 1,2 microlitros de 2,5 miligramos por mililitro. Órgano verde dependiente del calcio disuelto en DMSO para una concentración final de 10 micromoles. Incube el tubo durante 40 minutos a 37 grados Celsius y 6% de dióxido de carbono.
Utilizando un Pepto de 200 microlitros con una punta P 200, retire por completo toda la solución del tubo. Llene la cámara inyectando suavemente por el puerto de entrada. Incline la cámara para que las burbujas salgan a través del puerto de salida.
Coloque toda la cámara en el incubador e incube durante otros 20 minutos a 37 grados Celsius y 6% de dióxido de carbono. Para permitir que los espermatozoides se adhieran a la poli-D-lisina. Monte la cámara en el microscopio fluorescente invertido y conéctela al aparato de perfusión.
Deje la preparación en la oscuridad durante al menos 10 minutos para permitir que la perfusión se disipe. Observe las células sueltas y el material extracelular muerto en contraste de fases a un aumento de 40x o 60x, y elija un campo de visión donde el espaciado celular sea suficiente para evaluar por separado la fluorescencia de cada célula. Las células deben estar adecuadamente adheridas, pero preferiblemente mostrando una actividad de fledger clara.
Cambie el microscopio al canal de fluorescencia verde. Mantenga los tiempos de exposición al mínimo necesario para obtener una imagen fluorescente clara. Para reducir el fotoblancamiento en el software IQ.
Active la adquisición de imágenes de series temporales. Adquiera imágenes a 0,1 hercios y utilice un obturador controlado por software para limitar la iluminación. Tras un período inicial de grabación de tres a cinco minutos como control, manipule la concentración de calcio en la solución salina y aplique fármacos cambiando la solución salina en la entrada del sistema de perfusión.
Tenga en cuenta el momento en que se añade cada estímulo al encabezado y calcule su tiempo de llegada a la cámara según se describe en la parte escrita de este protocolo. Para analizar las imágenes fuera de línea, utilice una de las herramientas de dibujo para delimitar una región de interés o ROI alrededor de cada célula o parte de una célula, en este caso la cabeza posterior del espermatozoide, ya que el calcio almacenado se moviliza en esta zona. Desplácese con la barra deslizante para revisar la serie de imágenes.
Identifique y elimine las células que no permanecen completamente dentro de la ROI, que se superponen con otras células o que han mostrado un aumento grande y rápido seguido de una caída pronunciada en la intensidad de fluorescencia, característica de la muerte celular. Utilice la función de análisis para generar una serie de intensidad de fluorescencia en función del tiempo para cada ROI. Los datos pueden luego exportarse y analizarse en una hoja de cálculo.
Estas imágenes provienen de una serie obtenida durante la estimulación con tres micromolares de progesterona. La fila inferior ha sido coloreada con pseudocolor. Para ilustrar mejor los cambios relativos de intensidad, aquí se introdujo la progesterona en la cámara. Aquí.
Estos resultados se animan en un video con lapso de tiempo. Observe el pico rápido en la intensidad de fluorescencia seguido de un aumento lento que indica cambios correspondientes en los niveles intracelulares de calcio. Estos datos se cuantifican aquí a partir de las intensidades promedio de la parte posterior de la cabeza de tres células.
Se añadieron tres micromolares de progesterona en el momento indicado por la flecha. La línea discontinua muestra la fluorescencia media del control. Hoy les hemos mostrado cómo aislar células de buena calidad, cargarlas con un colorante sensible al calcio y monitorear la respuesta de células individuales a la estimulación.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar la población celular más adecuada, minimizar la iluminación de las células para evitar daños por fototoxicidad y elegir el colorante que mejor se adapte a las respuestas que está analizando. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
Descripción general
Este estudio evalúa las señales de concentración de iones de calcio inducidas por estímulos en espermatozoides humanos individuales mediante microscopía de fluorescencia con captura temporal. Las células espermáticas móviles se cargan con un colorante fluorescente sensible al calcio y se inmovilizan para su imagen y análisis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Biología reproductiva
Antecedentes
- La señalización de calcio desempeña un papel fundamental en la función espermática y la fertilización.
- Comprender la dinámica del calcio puede proporcionar información sobre la regulación y actividad del espermatozoide.
- Los colorantes fluorescentes se utilizan comúnmente para visualizar los niveles intracelulares de calcio.
- La imagenología con intervalos de tiempo permite observar las respuestas celulares dinámicas.
Objetivo del estudio
- Aislar espermatozoides humanos móviles y evaluar sus respuestas de calcio a estímulos.
- Desarrollar un método para visualizar y analizar la dinámica del calcio en células espermáticas individuales.
- Mejorar la comprensión del comportamiento espermático en respuesta a estímulos derivados del óvulo.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de espermatozoides móviles del plasma seminal mediante la técnica de ascenso.
- Carga de espermatozoides con un colorante fluorescente sensible al calcio.
- Inmovilización de espermatozoides en una cámara de imagen perfusable.
- Microscopía de fluorescencia con intervalos de tiempo para registrar los cambios en la concentración de iones de calcio.
Resultados principales
- Se registraron con éxito respuestas de calcio en células espermáticas individuales.
- La estimulación con progesterona produjo picos observables en la intensidad de fluorescencia.
- El análisis de datos reveló cambios significativos en los niveles intracelulares de calcio.
- Los resultados se visualizaron en formato de video con lapso de tiempo para mayor claridad.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque confiable para estudiar la señalización de calcio en espermatozoides humanos.
- Comprender la dinámica del calcio puede aportar conocimientos a la biología reproductiva y a la investigación de la fertilidad.
- Estudios futuros podrían explorar diferentes estímulos y sus efectos sobre la función espermática.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La obtención de imágenes de la señalización intracelular de calcio en espermatozoides humanos proporciona una lectura funcional para evaluar la motilidad espermática y el potencial de fertilización, que son parámetros críticos en el diagnóstico de la infertilidad masculina y en el desarrollo de anticonceptivos. Este método permite reducir los riesgos mecanicistas de compuestos dirigidos a canales iónicos o vías de señalización específicas del espermatozoide, mediante la medición directa de respuestas fisiológicas en un sistema relevante para la enfermedad. El enfoque apoya la validación de dianas y el desarrollo de ensayos para programas de salud reproductiva al proporcionar datos cuantitativos a nivel de célula individual sobre el flujo de calcio inducido por estímulos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con la modulación de canales iónicos en espermatozoides y las vías de señalización intracelular.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al confirmar la interacción funcional con el objetivo en espermatozoides humanos bajo condiciones de capacitación.
- Valor predictivo: Genera datos de respuesta frente a dosis que orientan la identificación y priorización de compuestos líderes basándose en la modulación del flujo de calcio.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Produce suspensiones de espermatozoides humanos validadas y cargadas con colorante, adecuadas para cribado de fluorescencia de alto contenido.
- Resultado cuantitativo: Proporciona mediciones de intensidad de fluorescencia en intervalos temporales que permiten calcular el porcentaje de cambio respecto a la línea base para la evaluación comparativa de compuestos.
- Reproducibilidad: Protocolos estandarizados de carga y perfusión favorecen la generación consistente de datos entre experimentos y laboratorios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Utiliza espermatozoides humanos como modelo directo de traslación para estudiar los mecanismos de infertilidad y la acción anticonceptiva.
- Reducción del riesgo mecanicista: Relaciona la exposición al compuesto con respuestas funcionales de calcio, reduciendo la ambigüedad en el mecanismo de acción.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos in vitro con resultados fisiológicos mediante la medición de señales en tiempo real en espermatozoides móviles y capacitados.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, especialmente para programas centrados en blancos del tracto reproductivo donde los ensayos funcionales de espermatozoides predicen la eficacia in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre dianas específicas del espermatozoide mediante la vinculación de la exposición a ligandos con la dinámica intracelular de calcio.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos mediante condiciones controladas de carga del colorante, perfusión e imagen que favorecen lecturas de fluorescencia reproducibles.
- Análisis: Proporciona datos de flujo de calcio con resolución temporal y a nivel de célula individual que permiten comparar condiciones de estimulación y efectos de compuestos.
- Investigación Traducional: Utiliza espermatozoides humanos para mantener la relevancia fisiológica, apoyando la continuidad desde la comprensión mecanicista hasta la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar los efectos de compuestos sobre la función espermática en múltiples proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la modulación del objetivo al proporcionar evidencia directa de cambios en la señalización de calcio en células humanas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante procedimientos estandarizados de aislamiento celular, carga del colorante y perfusión.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos funcionales que reducen la dependencia de biomarcadores sustitutos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en efectos demostrados sobre la señalización de calcio en espermatozoides.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de espermatozoides, microscopía de fluorescencia y análisis de imágenes para garantizar la calidad de los datos.
- Depende de sistemas de perfusión y microscopios invertidos capaces de adquisición de imágenes en intervalos de tiempo con mínima fototoxicidad.
- Necesita estandarización entre equipos en cuanto a la preparación de células, concentración de colorantes y temporización de la estimulación para asegurar la comparabilidad.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir la optimización de las condiciones de adhesión y los protocolos de carga con colorantes.
- Las limitaciones prácticas incluyen la eficiencia de carga del colorante y los riesgos de fotodegradación, que se reducen mediante el uso de colorantes de longitud de onda visible e iluminación controlada.
