Name: A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Aprende a inocular colonias de bibliotecas metagenómicas en filtros de membrana usando robótica de alta precisión. Este método permite analizar 10,000 colonias por filtro con eficiencia y reproducibilidad en estudios genómicos.

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1. Hibridación procedimiento Un tubo de hibridación tomar 1 o 2 membranas (tamaño 22 por 22 cm). Utilice 50 ml de mezcla de hibridación y 0,5 mg de sondas de ADN (10 ng / ml concentración final) por tubo de hibridación. Para obtener los mejores resultados, utilice gel purificado de ADN como sonda. Si la ampliación de la preparación de la sonda, aumentar el número de tubos en lugar de aumentar la cantidad de reactivos por tubo. Preparación de la sonda (0,5 mg de ADN): <ol><li> Diluir 15 l de solución de reticulación con 60 l de agua. </li><li> Diluir el ADN a 10 ng / ml con agua a 50 l de volumen total en un microtubo con tapón de rosca. </li><li> Desnaturalizar el ADN durante 5 minutos en agua hirviendo. </li><li> Rápida transferencia de hielo y deje enfriar por 5 minutos. Girar brevemente. </li><li> Añadir 50 l de tampón de reacción y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 10 l de etiquetado reactivo y mezcle suavemente. </li><li> Añadir 50 l de la diluido reticulante solución del paso 1 y mezclar suavemente. Vortex suavemente y girar brevemente. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Mantener en hielo durante 2 h, o añadir un volumen equivalente de 100% de glicerol y almacenar a -20 ° C. Nota: El uso del agua suministrada con el kit. Mantenga todos los reactivos en hielo a menos que se indique lo contrario. </li></ol> Membrana de la preparación y la hibridación <ol><li> Precaliente 50 ml de buffer de hibridación y el tubo de hibridación a 60 ° C. </li><li> Añadir el tampón de hibridación de la sonda de hibridación. Enrollar la membrana (s) y añadir al tubo de hibridación. (Si la adición de dos membranas por tubo, rodar por primera vez una membrana completamente, y luego enrollar la membrana de otras en la parte superior en la misma dirección.) </li><li> Incubar el tubo en hibridación a 60 ° C durante por lo menos ½ h. (Asegúrese de que la membrana (s) empaparse a fondo.) </li><li> Transferencia de aproximadamente 1 ml de tampón de hibridación con una pipeta largo del tubo de hibridación con el tubo que contiene la sonda marcada. Vortex suavemente y girar brevemente. Transfiera la mezcla de nuevo al tubo de hibridación. </li><li> Se incuba a 60 ° C durante la noche. Nota: Use pinzas y guantes para manipular las membranas. Que permite combinar contenido de los tubos de hibridación con cuidado, porque demasiada agitación provocará la formación permanente de espuma indeseable. Las membranas se debe agregar en condiciones húmedas; remojo en una solución tampón de hibridación o agua si es necesario y escurra el exceso de líquido antes de añadir. </li></ol> 2. Procedimiento de detección de Membranas de lavado <ol><li> Precaliente el tampón de lavado principal a 60 ° C. (Use el horno microondas y / o placa de calentamiento). </li><li> Si hay dos membranas en el tubo de hibridación de una, la transferencia de una membrana de un lugar limpio, tubo de precalentado, hibridación vacío. </li><li> En pocas palabras Enjuague el tubo de hibridación con 50 ml de tampón de lavado principal. </li><li> Añadir unos 100 ml de tampón de lavado principal al tubo de hibridación y se incuba a 60 ° C durante 10 min. </li><li> Repita los pasos 3 y 4. </li><li> Transferencia de membrana para el lavado de contenedores y se incuban con al menos 250 ml de tampón de lavado secundario a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Repita el paso 6. Nota: Las membranas se pueden mantener en el tampón de lavado secundario a temperatura ambiente durante un máximo de hora y media antes de la generación de la señal. </li></ol> Generación de señal y detección (procedimiento de una membrana) <ol><li> Cinta de dos piezas de SaranWrap plano sobre la mesa (una para el paso 2 y otro para el paso 4). </li><li> Con cuidado, escurrir el exceso de tampón de la membrana por tocar las esquinas de la membrana contra el lado del contenedor y la transferencia de la membrana en el SaranWrap (lado de la muestra hacia arriba). </li><li> Vierta 6-7 ml de reactivo ECF sobre la membrana y el abrigo veces Saran sobre la membrana. Distribuir cuidadosamente reactivo ECF sobre la membrana moviendo suavemente una Kimwipe el SaranWrap. Incubar durante 5 min. </li><li> Escurrir el exceso de reactivo ECF de la membrana y transferirlo a nuevas SaranWrap, envuelva veces sobre la membrana, y sellar los bordes con cinta adhesiva. Cubrir la membrana con papel de aluminio. Incubar durante 1-2 horas. </li><li> Prepare la placa de cristal del escáner mediante la distribución de 2.1 ml de reactivo ECF sobre la placa de vidrio. A continuación, traslado de la membrana en la placa de vidrio (lado de la muestra hacia abajo) y distribuir otro 1-2 ml de reactivo ECF sobre la membrana. Superposición con SaranWrap y empuje con cuidado todas las burbujas de aire fuera de la membrana. (Usted puede colocar una placa rígida en la parte superior de la SaranWrap para mantener la membrana presiona contra la placa de vidrio.) </li><li> Utilice el Fuji FLA-5100 escáner de fluorescencia (&quot;un láser de una imagen de&quot; modo) con los siguientes valores: excitación 473 nm, los filtros de detección LPB (510 nm), la resolución de 50 micras, la graduación de la señal de 16 bits, CH1 400 V. (Scan tarda unos 15-20 minutos por membrana con un tamaño 22 por 22 cm.) Opcional: </li><li> Deje reposar durante 2-4 horas (o más). </li><li> Repita el análisis como en el paso 6. </li></ol> 3. Extracción y almacenamiento de procedimiento (NUF versión) <ol><li> La transferencia de la membrana y el 100% ethanol e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave. </li><li> Reemplazar con etanol fresca 100% e incubar durante la noche a temperatura ambiente. (Membrana puede permanecer en etanol durante varios días.) </li><li> Vuelva a colocar el etanol con agua destilada y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Añadir 100 ml de agua y 5 ml de SDS al 10% (final de 0,5% SDS) a un tubo de hibridación y mezclar suavemente. Añadir membrana. </li><li> Se incuba a 80 ° C durante 1 h. </li><li> La transferencia de la membrana en un recipiente limpio y vacío. </li><li> Añadir 500 ml de agua y 5 ml de SDS al 10% (final de 0,1% SDS) un vaso de precipitados y calentar a ebullición vigorosa en el horno de microondas. </li><li> Vierta el punto de ebullición cerca de 0.1% de solución de SDS sobre la membrana y agitar suavemente durante unos minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague por lo menos en 250 ml de agua estéril 100 mM Tris pH 8 durante al menos 10 min. </li><li> Envuelva la membrana en SaranWrap y los bordes de cerrar cuidadosamente con cintas. Almacenar a 4 ° C. (Membranas nunca debe secarse.) </li></ol>

El procedimiento de extracción no ha sido optimizado. Sin embargo, el procedimiento de agotamiento dado en las instrucciones del fabricante (2 lavados cada 10 min en etanol al 100%, un lavado de 1 hora a 60 ° C en el 0,5% SDS) es insuficiente. Por lo menos una noche de incubación en el 100% de etanol es necesario para disolver el producto de reacción ECF; de incubación de varios días en el 100% de etanol no parece tener efectos adversos sobre la capacidad de sondear la membrana. Tratamiento del fabricante SDS también parece ser insuficiente...

Combinación pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

a gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenómica bibliotecas fragmentos contiguos gran archivo de secuencias genómicas de los microorganismos sin necesidad de cultivo previo. Generación de un procedimiento simplificado para la creación y la selección de bibliotecas de metagenómica tanto, es útil para una eficiente investigación de alto rendimiento en las propiedades genéticas y metabólicas de los ensambles microbianos inculto. En este caso, los protocolos claves se presentan en el vídeo, que nos proponemos es el formato más útil para describir con precisión un largo proceso que, alternativamente, depende de la instrumentación robótica y (humanos) de intervenciones manuales. En primer lugar, la robótica empleada para detectar clones de la biblioteca en las membranas de macrochips de alta densidad, cada uno de los cuales puede contener colonias de duplicados de veinticuatro planchas biblioteca de 384 pocillos. La automatización es esencial para este procedimiento no sólo por la precisión y velocidad, pero también debido a la miniaturización de la escala necesaria para adaptarse a la gran cantidad de clones de la biblioteca en la organización espacial de alta densidad. Una vez generado, el próximo demostró cómo las membranas macrochips pueden ser examinados por los genes de interés usando versiones modificadas de los protocolos estándar para el etiquetado de la sonda, la hibridación de membrana, y la detección de la señal. Hemos complementado la demostración visual de estos procedimientos, con descripciones detalladas por escrito de los pasos a seguir y los materiales requeridos, todos los cuales están disponibles en línea junto con el vídeo.

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

Las bibliotecas metagenómicas archivan fragmentos extensos de secuencias genómicas contiguas de microorganismos sin requerir un cultivo previo. La generación de una...

Por lo tanto, nuestro objetivo aquí es inocular colonias de algunas de estas bibliotecas metagenómicas sobre filtros de membrana, y cada uno de estos filtros puede contener 10.000 colonias. Lo que está haciendo rums ahora es colocar este filtro de nailon sobre un bloque y alisarlo un poco. Está, está en un poco de líquido, es solo el medio de crecimiento caldo luria.Y lo que hará entonces es transferir esta membrana humedecida al robot, que va a inocular automáticamente la membrana con 10.000 colonias. La robótica es esencial para este tipo de procedimiento porque ninguna persona tiene realmente la paciencia ni la precisión necesarias para depositar 10.000 colonias sobre una de estas membranas. Los robots son uno de los avances que realmente han impulsado la ciencia genómica, al permitir realizar operaciones muy repetitivas y de pequeña escala espacial con alta precisión.En este momento, el robot se está preparando para sembrar estas 3 placas de 84 pocillos, donde cada pocillo en esas 3 placas de 84 pocillos contiene una colonia individual de la biblioteca metagenómica. Ahora mismo, el robot está esterilizando las agujas de inoculación que utilizará para sembrar sobre la membrana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe una pantalla de alto rendimiento para la actividad celulolítica de una biblioteca metagenómica expresado en Escherichia coli. La pantalla es la solución de base y altamente automatizado, y utiliza una olla de la química en microplacas de 384 y con la lectura final como una medida de la absorbancia.

Una pantalla de alto rendimiento para Biominería actividad de celulasa de bibliotecas metagenómicas

Hemos desarrollado completa e imparcial en todo el genoma para comprender las pantallas de genes de drogas y las interacciones genético-ambientales. Métodos para la detección de estas colecciones mutantes se presentan.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

Fuente: Kim, H. et al., Cribado Multienzimático usando un sistema de cribado enzimático genético de alto consumo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demuestra un método de cribado genético para detectar la expresión enzimática utilizando bibliotecas metagenómicas de fosmid y sustratos cromogénicos. La citometría de flujo identifica y aísla células individuales que producen productos coloreados, permitiendo la selección de alto rendimiento de células activas que expresan enzimas.

Detección de la expresión de enzimas objetivo en células bacterianas genéticamente modificadas

Este manuscrito describe un enfoque automatizado de selección del tamaño del gel para purificar fragmentos de ADN para la secuenciación de próxima generación. La tecnología Ranger proporciona una automatización completa de todo el proceso de carga de gel de agarosa, análisis electroforético y recuperación de fragmentos de ADN específicos, lo que permite bibliotecas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y alta calidad.

Automatizado Gel Tamaño Selección para mejorar la calidad de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación Preparado a partir de muestras de agua del medio ambiente

Este trabajo presenta un método de cribado de alto rendimiento utilizando un sistema universal de cribado genético de enzimas que teóricamente puede aplicarse a más de 200 enzimas. En este caso, el sistema de cribado único identifica tres enzimas diferentes (lipasa, celulasa y fosfatasa alcalina) simplemente cambiando el sustrato utilizado (acetato de p-nitrofenilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido y fosfato de fenilo).

Multienzimático de detección sistemática mediante un sistema de cribado genético de la enzima de alto rendimiento

Metagenómica se utilizó para investigar el microbioma de la alimentación del ganado ensilado. El análisis se realizó por secuenciación con escopeta. Este enfoque se utilizó para caracterizar la composición de la comunidad microbiana dentro de la alimentación del ganado.

Análisis metagenomic de ensilaje

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

La tecnología CRISPR-Cas9 proporciona un método eficiente para editar con precisión el genoma de mamíferos en cualquier tipo de célula y representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma. Aquí se proporciona un protocolo detallado que analiza los pasos necesarios para el buen rendimiento de las pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas para todo el genoma.

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

Este manuscrito describe un enfoque de cribado basado en células a escala del genoma para identificar interacciones extracelulares entre receptores y ligand.

Identificación del receptor de superficie celular mediante pantallas genéticas CRISPR/Cas9 de escala de genoma

Este estudio presenta un protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificación de barras espacial directa de una sección tisular con análisis multioma de célula única. Este enfoque permite simultáneamente un perfilado espacial de expresión génica en células individuales y la modificación de la histona H3K27ac, ofreciendo conocimientos mecanicistas sobre la regulación génica en el contexto de la microanatomía tisular.

Perfilado multiómico integrado de célula única y resuelto espacialmente del transcriptoma y objetivos epigenómicos en secciones de tejido congelado

Aprende a inocular colonias de bibliotecas metagenómicas en filtros de membrana usando robótica de alta precisión. Este método permite analizar 10,000 colonias por filtro con eficiencia y reproducibilidad en estudios genómicos.

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

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