0 visualizaciones • 4:49 min. • April 30th, 2023
- Comience montando una larva limpia y anestesiada debajo de una cubierta de vidrio con la cabeza hacia arriba. A continuación, exponga el área de interés empujando suavemente el cubreobjetos para enrollar la larva y ajustar su posición. Utilice imágenes confocales para localizar las células neurales de las larvas. Identifique un axón específico en una de las células neurales objetivo como el sitio de la lesión.
A continuación, exponga el axón objetivo a un láser de dos fotones a una potencia superior a la utilizada para la obtención de imágenes para inducir el daño. Se utiliza un láser de dos fotones debido a su capacidad para penetrar y localizar con precisión el daño dentro del tejido vivo con un daño mínimo al tejido circundante.
Detenga la exposición al láser inmediatamente cuando haya daño en la neurona objetivo, lo que resulta en una axotomía o corte del axón. Por último, obtenga una imagen de la neurona lesionada para ver su degeneración y posterior regeneración en los puntos de tiempo deseados.
En el protocolo de ejemplo, montaremos una larva para microscopía, induciremos daño a las neuronas sensoriales de las larvas y rastrearemos la regeneración neuronal.
- Comenzar con una anestesia de las larvas. En una campana extractora, coloque un plato de vidrio de 60 milímetros en una placa de Petri de plástico de 15 centímetros. A continuación, dobla un trozo de papel de seda y colócalo en el plato de cristal. Coloque la placa de agar uva sobre el pañuelo después de agregar el éter dietílico.
A continuación, coloque una gota de aceite halocarbono 27 en el centro y una gota de grasa para aspiradoras en cada una de las cuatro esquinas. Luego use pinzas para transferir una larva a la placa de agar y cubra la placa de vidrio para anestesiar a la larva. Tan pronto como la lava deje de moverse, transfiérala con cuidado al aceite de halocarbono con la cabeza erguida. A continuación, coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos y presiónelo suavemente hasta que toque la larva.
A continuación, use una fuerza suave para deslizar el cubreobjetos para hacer rodar las células que se van a ablacionar hasta donde el láser de dos fotones las golpeará más fácilmente. La ubicación variará dependiendo de las neuronas a las que se dirija. Ahora asegure el ensamblaje en la platina del microscopio de dos fotones y concéntrese en las células de interés utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 40x.
En el software, cambie al modo de escaneo y cargue el protocolo guardado. Asegúrese de que el orificio esté completamente abierto. Luego, en el modo en vivo, obtenga una buena imagen de la región de interés.
A continuación, detenga el escaneo en vivo para que el botón de recorte esté disponible. Usando la función de recorte, ajuste la ventana de escaneo para enfocar el área objetivo solo en el sitio potencial de la lesión. A continuación, abra una nueva ventana de imágenes. Ahora reduzca la velocidad de escaneo y aumente la intensidad del láser. A continuación, mueva el botón continuo para iniciar y detener el escaneo. Observe atentamente. Tan pronto como haya un aumento drástico de la fluorescencia, finalice la exploración.
A continuación, vuelva a la ventana de imagen original y seleccione el modo en vivo, y busque la región que se acaba de seleccionar ajustando el enfoque.
- Un buen indicio de una lesión exitosa es la aparición de un pequeño cráter, una estructura en forma de anillo o escombros localizados justo en el sitio de la lesión. Si la potencia del láser fuera demasiado alta, se vería una gran área dañada, que puede ser letal.
- Ahora retire con cuidado el cubreobjetos y transfiera la larva lesionada a un nuevo plato con pasta de levadura. Coloque el plato en un plato de 60 milímetros junto con un pañuelo empapado en ácido propiónico. A continuación, vuelva a colocar la placa a la temperatura de cultivo.
Para obtener imágenes posteriores de la larva, utilice la configuración confocal guardada y recopile imágenes de pila z con un objetivo de 25x. Asegúrese de incluir el punto de normalización para que se pueda cuantificar la regeneración.