Cribado de modificaciones genómicas: un método para identificar mutantes generados por CRISPR en Drosophila

- Cuando los embriones inyectados se convierten en adultos G0, se cruzan todas las moscas individuales con existencias de equilibrio adecuadas para ampliar las posibles líneas editadas con F1 CRISPR y poder rastrear la herencia de la modificación genómica. A continuación, se cruzan machos solteros F1 elegidos al azar con hembras equilibradoras adecuadas para poder recuperar la descendencia si un macho F1 es positivo para la mutación. Una vez que se haya tomado el cruce, transfiera el macho F1 a un tubo para su detección.

Para extraer el ADN genómico, aplaste la mosca con una punta de pipeta que contenga tampón de extracción. Una vez que el tejido se descompone, expulse el líquido. El tampón de extracción contiene proteinasa K, una enzima que digiere las proteínas de la muestra y se inactiva a altas temperaturas.

Ahora que el ADN es accesible, proceda a la detección por PCR. Por ejemplo, utilice cebadores diseñados para amplificar una región que incluya la nueva secuencia. Solo en presencia de la modificación se unirá el segundo cebador y se amplificará un producto de PCR. En el ejemplo, veremos moscas criadas y examinadas por PCR para la inserción de una secuencia de transactivació