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- Para empezar, comience por deshidratar y secar una muestra fija para reducir la distorsión de la muestra causada por la eliminación de gases y agua líquida a la presión de funcionamiento reducida de los microscopios electrónicos de barrido convencionales, SEM.
Para deshidratar la muestra, lávela con concentraciones crecientes de etanol en agua hasta alcanzar el 100% de etanol. A continuación, repita este proceso con un agente secante químico en etanol hasta que la muestra se lave con un agente secante puro. Transfiera la muestra y el agente secante a un plato de evaporación. Cúbralo con un mínimo de agente de secado adicional y déjelo secar en una campana extractora durante la noche.
A continuación, monte la muestra preparada en la parte superior de un trozo de microscopio con cinta adhesiva de carbón. Por último, aplique pintura plateada a los bordes del fragmento, y luego desde el borde del talón a cada una de las muestras, para reducir la acumulación de electrones en exceso, lo que podría dar lugar a artefactos de imagen no deseados.
En este experimento, las moscas de la fruta, Drosophila melanogaster, se preparan para el análisis SEM utilizando el agente secante HMDS.
- Para preparar Drosophila melanogaster, sumergir las moscas anestesiadas en 1 mililitro de fijador durante 2 horas a 4 grados centígrados, asegurándose de que estén completamente sumergidas.
Utilice una pipeta de vidrio para retirar el fijador. Lavar la muestra fija de Drosophila en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros tres veces con 1 mililitro de tampón de fosfato 0,1 molar pH 7,2 a temperatura ambiente durante 10 minutos. Utilice una pipeta de vidrio para eliminar cada lavado, teniendo cuidado de no extraer la muestra.
A continuación, deshidratar la muestra en un tubo de microfuga, en un volumen de 1 mililitro, utilizando una serie de etanol graduada durante 10 minutos cada una. Utilice una pipeta de vidrio para eliminar cada lavado, teniendo cuidado de no extraer la muestra. Mantenga la muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con suficiente etanol al 100% para cubrirla.
Para realizar el secado químico de las moscas con HMDS, primero, reemplace la solución de etanol al 100% con una solución 1 a 2 de HMDS y etanol al 100% durante 20 minutos. A continuación, sustituya la solución por una solución 2 a 1 de HMDS y etanol al 100% durante 20 minutos. Finalmente, reemplace esta solución con HMDS 100% durante 20 minutos y luego repita el proceso una vez.
Transfiera la muestra, que se encuentra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y HMDS, a un plato de pesaje de aluminio desechable. Reemplace el 100% HMDS con el 100% HMDS fresco suficiente para cubrir la muestra. Coloque la muestra dentro del plato de aluminio directamente en una campana de gases químicos para que se seque con una tapa suelta, como una caja, para evitar que caigan residuos sobre la muestra, y deje que se seque durante 12 a 24 horas.
Para montar Drosophila, etiquete la parte inferior de un trozo de montaje de aluminio. Use pinzas de precisión para colocar las moscas secas en la posición deseada en una lengüeta adhesiva de carbono asegurada a la parte superior de un trozo bajo un microscopio de disección. Aplique adhesivo conductor de plata alrededor de los bordes exteriores de los stubbs.
Use un palillo de dientes para conectar la pintura plateada a las moscas, asegurando la conductividad, asegurándose de que la pintura no toque el área de imagen deseada. Coloque los talones en una caja de soporte de talones. Y luego coloque la caja de soporte de talón abierta en un desecador y deje que la pintura plateada se seque durante al menos tres horas.