Inyección de moscas Drosophila adultas: un método de administración de compuestos o etiquetas
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biología
0 vistas • 3:23 min • April 30th, 2023
- Prepare agujas de inyección cónicas tirando de capilares de vidrio de paredes delgadas con un extractor de agujas. Sostenga una aguja bajo un microscopio y rompa la punta, asegurándose de que la abertura sea lo suficientemente grande como para perforar la cutícula de la mosca adulta sin lastimarla más de lo necesario. Mida el volumen de inyección cargando su aguja con una solución tampón estéril de tinte y sal y luego expulsándola sobre una gota de aceite mineral en un micrómetro de etapa. Utilice la escala del micrómetro para medir el diámetro de la gota expulsada, que puede utilizarse para calcular el volumen dispensado, y calibrar la configuración de su inyector en consecuencia.
Cargue la aguja con la solución inyectable y móntela en una boquilla de inyección. Anestesia a tus moscas con CO2 y colócalas en una almohadilla de CO2 que las mantendrá anestesiadas. Una vez que las moscas estén en la orientación correcta para su experimento, proceda con las inyecciones. En el protocolo de ejemplo, inyectaremos moscas adultas con partículas marcadas con fluoresceína para obtener imágenes in vivo.
- Después de extraer capilares de vidrio de pared delgada con un extractor de agujas, use un micrómetro para sostener la aguja bajo un microscopio y use pinzas de acero inoxidable de punta fina número cinco para romper la punta a un diámetro de punta de 100 micrómetros. Para medir el volumen de líquido que se inyectará en cada mosca, cargue una aguja capilar con colorante alimentario estéril al 5% en PBS y expulse el líquido sobre una gota de aceite mineral en un micrómetro de etapa de 0,01 milímetros.
Dispense 10 microlitros de partículas de 1,6 miligramos por mililitro en un pequeño cuadrado de parafilm y tire del líquido hacia la aguja. Monte la aguja en la boquilla del inyector y alinee las moscas anestesiadas a lo largo de su área designada en la almohadilla para moscas, con el lado ventral hacia arriba, con las cabezas orientadas hacia el frente de la almohadilla. Coloque los viales en las áreas correspondientes en el banco e inyecte las moscas en la esquina superior del abdomen con cinco bombas de líquido de 100 milisegundos para entregar aproximadamente 10 nanolitros de partículas en total. Transfiera cada mosca al vial apropiado a medida que se inyecta, anotando el tiempo en el vial.
A continuación, cargue una nueva aguja con una solución de Trypan Blue al 0,4% y configure el inyector neumático en "compuerta" para permitir un flujo constante de aire que empuje el líquido fuera de la aguja. 30 minutos después de la inyección inicial, inyecte el abdomen de cada mosca con Trypan Blue hasta que el abdomen esté lleno y distendido. Monta las moscas en portaobjetos de microscopio con cinta aislante con el lado ventral hacia abajo, empujando las alas hacia el lado de la mosca para asegurarlas a la cinta. Luego, empuje suavemente la cabeza en la cinta para asegurarse de que la mosca no se mueva.
Descripción general
Este artículo describe un protocolo para inyectar moscas adultas con partículas marcadas con fluoresceína para imágenes in vivo. El método consiste en preparar agujas de inyección cónicas y anestesiar las moscas para facilitar inyecciones precisas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Imagen in vivo
Antecedentes
- Las técnicas de inyección son fundamentales para estudiar procesos biológicos en organismos modelo.
- Las partículas marcadas con fluoresceína permiten la visualización de los materiales inyectados.
- La preparación y calibración adecuadas de las agujas son esenciales para una dosificación precisa.
- La anestesia con CO2 se utiliza comúnmente para inmovilizar a las moscas durante los procedimientos.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método confiable para inyectar sustancias en moscas adultas.
- Facilitar la obtención de imágenes in vivo de procesos biológicos mediante marcadores fluorescentes.
- Proporcionar un protocolo detallado para investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Preparación de agujas de inyección afiladas utilizando un tirador de agujas.
- Calibración del volumen de inyección usando un micrómetro y un colorante estéril.
- Anestesia de moscas con CO2 y colocación sobre una almohadilla para moscas.
- Inyección de partículas marcadas con fluoresceína e imagen posterior.
Resultados principales
- Inyección exitosa de partículas en el abdomen de moscas adultas.
- Visualización de los materiales inyectados mediante técnicas de imagen in vivo.
- Demostración de la eficacia del protocolo de inyección.
- Establecimiento de un método para estudios futuros que involucren técnicas similares.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para inyectar sustancias en moscas.
- La obtención de imágenes in vivo puede lograrse eficazmente con partículas marcadas con fluoresceína.
- Esta técnica puede adaptarse a diversas necesidades experimentales en neurociencia y biología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La administración precisa de compuestos en organismos modelo permite la eliminación mecanicista de riesgos de dianas terapéuticas y apoya el desarrollo temprano de ensayos. Este método proporciona un enfoque escalable para introducir compuestos marcados o biológicos en Drosophila adulta, facilitando los procesos de cribado fenotípico y validación de dianas. Al estandarizar el volumen de inyección y minimizar el daño tisular, mejora la reproducibilidad en las líneas de trabajo de biología de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la administración controlada de compuestos o marcadores a tejidos específicos.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas al permitir la evaluación directa de la absorción y distribución del compuesto in vivo.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en los datos de interacción con la diana al reducir la variabilidad derivada de dosificaciones inconsistentes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para lecturas basadas en fluorescencia y aplicaciones de imagen posteriores.
- Salida cuantitativa: Permite la administración estandarizada de compuestos, apoyando campañas de cribado reproducibles.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en múltiples blancos o series de compuestos mediante parámetros consistentes de calibración de aguja e inyección.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Apoya el uso de Drosophila como un sistema relevante para el estudio de vías conservadas y mecanismos diana relacionados con enfermedades.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos de descubrimiento con la validación preclínica al permitir modelos consistentes de exposición a compuestos.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Informa criterios de avance o interrupción mediante la medición confiable de la administración y biodisponibilidad de compuestos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se enmarca dentro del continuo de descubrimiento que va desde la comprobación de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos, especialmente cuando es necesario visualizar in vivo la localización del compuesto o la modulación de la diana.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al permitir la administración precisa de sondas o compuestos para evaluar la actividad de la vía diana.
- Selección: Mejora la reproducibilidad de los ensayos mediante volúmenes de inyección calibrados y protocolos de administración estandarizados.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas de imágenes que permiten comparar la distribución de compuestos y la interacción con el blanco en diferentes condiciones.
- Investigación Translacional: Conecta la validación temprana del blanco con la continuidad preclínica mediante la modelización de la exposición a compuestos en un contexto de organismo completo.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable para múltiples proyectos que requieren administración in vivo de compuestos en Drosophila.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco al reducir la ambigüedad mecanicista derivada de la exposición variable al compuesto.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad entre laboratorios mediante la calibración de agujas y el control de los parámetros de inyección.
- Valor estratégico: Apoya decisiones más sólidas de avance o interrupción al proporcionar datos fiables sobre la administración del compuesto, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en evidencia consistente de administración in vivo y modulación del blanco.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía y microscopía para la preparación de la aguja y el manejo de las moscas.
- Depende del acceso a un tirador de agujas, micrómetro e inyector neumático para la calibración del volumen.
- Necesita la estandarización de la anestesia y del momento de la inyección entre diferentes equipos para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicarse a diferentes cepas, edades de moscas o viscosidades de compuestos.
- Está limitado por las restricciones físicas del tamaño de la mosca y del volumen de inyección, lo que puede restringir la capacidad de carga del compuesto.
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Última actualización: 29 agosto 2026