Disección de glándulas linfáticas larales: aislamiento del órgano productor de hemocitos de Drosophila

- La glándula linfática larvaria de Drosophila melanogaster es responsable de la producción de hemocitos, o células sanguíneas, que circulan en la hemolinfa de las larvas. Para identificar la glándula linfática, primero hay que encontrar el vaso dorsal, o corazón, que bombea la hemolinfa por todo el cuerpo. Sigue el vaso dorsal hacia la cabeza hasta que encuentres el cerebro. La glándula linfática es una pequeña estructura multilobulada junto al cerebro, que flanquea el vaso dorsal.

Para encontrar el lóbulo primario, identifique el lóbulo más grande de la glándula. Este lóbulo contiene tres zonas, definidas por diferentes etapas de desarrollo de los hemocitos. La zona medular más cercana al vaso dorsal contiene hemocitos inmaduros, mientras que la zona cortical contiene hemocitos maduros. En el extremo posterior del lóbulo primario, se encuentra el centro de señalización posterior, compuesto por hemocitos especializados. Los lóbulos secundario y terciario son más pequeños y no tienen zonas definidas.

Para diseccionar la glándula linfática, necesitarás un microscopio de disección, dos pinzas para manipular las larvas y una solución salina tamponada.

En este ejemplo, diseccionaremos los ganglios linfáticos para su uso en inmunohistoquímica.

- Para comenzar la disección de las glándulas linfáticas, agregue 1 mililitro de 1x PBS a 1 pocillo de una placa de 24 pocillos para cada entorno experimental que se va a diseccionar. A continuación, con una pipeta de transferencia desechable, añada 1 gota de PBST al 0,1% a cada pocillo. Coloque el plato plano sobre hielo. Coloque una almohadilla de disección limpia sobre una base de microscopio estereoscópico iluminada. Utilice una pipeta de transferencia desechable para colocar una gota de PBST al 0,01 % en la almohadilla.

Transfiera una larva a la gota de PBST para su disección. Sostenga la lava con un par de pinzas, con el lado dorsal hacia arriba, aproximadamente a 1/4 de distancia del extremo posterior. Con el segundo par de pinzas, agarre la cutícula inmediatamente anterior al primer par y tire suavemente de la cutícula larvaria hacia la parte anterior, hasta que los ganchos bucales queden expuestos.

Suelta la cutícula y usa ambas pinzas para dividir la larva. Retire el extremo posterior de la gota de PBST y deséchelo. Sujete la cutícula con alfileres para mayor estabilidad y luego use el segundo par de pinzas para agarrar los ganchos bucales expuestos y sacarlos suavemente. Esto separará la cutícula de las estructuras internas.

Manteniendo el agarre de los ganchos bucales, retire con cuidado las estructuras no deseadas, como las glándulas salivales, el cuerpo graso y el intestino. Recoja suavemente el complejo de tejido diseccionado por los ganchos bucales y transfiéralo a un pocillo de la placa con hielo. Repita la disección con tantas larvas como desee, pero no exceda un tiempo de disección de 30 minutos antes de continuar con el paso de fijación.

Para comenzar el montaje del tejido, coloque una gota de tampón de montaje en un portaobjetos de vidrio. Usando los ganchos bucales como mango, transfiera la glándula linfática a la gota tampón. Separe los tejidos de manera uniforme, extendiendo el tampón de montaje en el proceso.

Deslice con cuidado una pinza de las pinzas por debajo del vaso dorsal, tirando suavemente hacia la periferia del tampón de montaje para extraer y aplanar la glándula linfática. Con un movimiento de sierra, corte el vaso dorsal entre la glándula linfática y el cerebro. Aleje el resto de los tejidos de la glándula linfática y los lleve al borde más externo del tampón.

Tome un cubreobjetos limpio y bájelo con cuidado sobre el tope de montaje. Los portaobjetos ya están listos para la toma de imágenes o pueden almacenarse a 4 grados centígrados hasta que se necesiten.