La medición de la resistencia a la flexión de las células bacterianas usando una trampa óptica

Para determinar la rigidez a la flexión de las células coli individualmente, primero haga crecer las bacterias hasta la fase exponencial y luego adúntalas a una superficie de cubreobjetos tratada químicamente. Deje que las células que ya se adhieren a la superficie crezcan aún más para que desarrollen extremos flexibles. A continuación, fluya en perlas dieléctricas, atrape una perla y dóblela hasta la punta flexible de una celda.

El paso final del procedimiento es doblar la celda con la trampa óptica y medir los datos de desplazamiento forzado resultantes. La rigidez a flexión de la célula se puede calcular mediante un ajuste lineal a los datos de desplazamiento forzado. Hola, soy Steven Wong del laboratorio del profesor Joshua Shere en el Instituto Louis Sickler de Genómica Integrativa y el Departamento de Física de la Universidad de Princeton.

Hoy le mostraremos un procedimiento de flexión de celdas ecológicas individuales y la rigidez de la celda combinada. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las contribuciones de diferentes estructuras intracelulares a la integridad mecánica de las células bacterianas. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, cultive tres mililitros de cualquier célula de E. coli en una fase LB media a exponencial. Una vez que las células alcancen una densidad óptica a 600 nanómetros de entre 0,2 y 0,4, se suplementará el cultivo con 50 microgramos por mililitro de cefalexina durante 15 minutos para inducir el crecimiento filamentoso. Durante estos 15 minutos, haz una cámara de flujo.

Fije dos piezas de cinta adhesiva de doble cara con un espacio de tres milímetros entre las piezas a un portaobjetos de vidrio y pegue un cubreobjetos en la parte superior. El espacio entre los trozos de cinta crea un canal para que fluya el líquido. Cubra el cubreobjetos con PEI haciendo fluir 10 microlitros de polietalina al 1% diluido en agua en la cámara de flujo con una micropipeta e incube durante cinco minutos.

A continuación, lavar haciendo fluir 200 microlitros de agua en un extremo de la cámara y recogiendo en el otro extremo con una aspiradora. Después de 15 minutos de crecimiento de las bacterias en presencia de cefalexina, centrifugar un mililitro de células en una microcentrífuga y resuspender en 200 microlitros de VI con cefalexina. A continuación, de nuevo, utilice una micropipeta en un extremo y aspire en el otro extremo para hacer fluir 50 microlitros del cultivo celular concentrado en la cámara que contiene la incubación del cubreobjetos recubiertos durante tres minutos.

A continuación, lavar con 50 microlitros de Vel B suplementado con cefalexina. Para eliminar las células no adheridas, incube la cámara a 37 grados centígrados durante 30 minutos a una hora para permitir que las células adheridas crezcan antes de colocarlas en el instrumento de captura óptica mientras las células se incuban. Prepare perlas recubiertas de polilisina incubando tres microlitros de perlas de poliestireno de 0,5 micrómetros de diámetro en una de polilisina al 0,1% diluida en agua durante 30 minutos.

Cuando las perlas terminen de incubarse, lávelas tres veces girándolas hacia abajo en una micro centrífuga y resus suspendiéndolas en un mililitro de agua, proceda a unir las perlas a las bacterias y mida la rigidez de unión de las células. El aspecto más difícil de este protocolo es ser capaz de reconocer, localizar y reconocer una buena celda para las mediciones de flexión y rigidez. Y una buena celda es aquella que tiene un extremo atascado bien definido y un lugar de extremo libre.

La cámara de flujo del microscopio busca una célula con un extremo atascado bien definido. Algunas celdas están unidas solo en una punta, y la fuerza de flexión en la otra punta hace que una celda completa gire en lugar de doblarse. Para encontrar una celda adecuada, doble cada celda rápidamente con la trampa usando el movimiento de etapa controlado por el joystick.

Cuando se encuentre una célula adecuada, diluya la solución de perlas por un factor de dos en libras con cefalexina, agregue 30 microlitros de la solución de perlas a la cámara de flujo pipeteando en un extremo y fluyendo suavemente en el otro extremo con un pañuelo de papel de toallita Kim, atrape ópticamente una perla flotante y tóquela en la punta libre de una celda. Lavar la cámara de nuevo con micropipeta y utilizando un pañuelo blanco Kim con 50 microlitros de cefalexina en LB para eliminar las perlas sueltas. A continuación, ejecute un programa de vista de laboratorio escrito a medida para aplicar fuerzas de flexión a la celda y registrar los datos de desplazamiento forzado.

Primero, calibre la respuesta del detector escaneando RA el cordón adjunto dentro del rayo láser de detección y registrando las señales de voltaje PSD 3D. A continuación, identifique el eje largo de la célula en una imagen de microscopio. Después de identificar el eje de celda largo, mueva la celda en pasos en una dirección perpendicular al eje largo mientras mueve el registro de celda, la distancia movida y el desplazamiento de la cuenta desde el centro de la trampa óptica.

Por último, convierta los valores de desplazamiento en fuerza aplicada utilizando la rigidez de la trampa medida anteriormente y guarde. El desplazamiento de la punta y la fuerza para archivar aquí son datos de desplazamiento forzado para una sola celda. La pendiente de esta línea es la rigidez a flexión de la célula.

Acabamos de mostrarle cómo combinar la rigidez a flexión de la E. coli con una trampa óptica. Al usar este procedimiento, es importante recordar encontrar una buena celda con un extremo atascado y un extremo libre bien definidos. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.