Name: La medición de la resistencia a la flexión de las células bacterianas usando una trampa óptica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprende a medir la rigidez a la flexión de células bacterianas usando una trampa óptica con E. coli. Este protocolo permite estudiar las propiedades mecánicas celulares y la integridad estructural.

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Reconocemos útiles consejos de Mingzhai Sol en las células de la unión a las superficies. Agradecemos a Ned Wingreen y Gitai Zemer valiosa para los debates. Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención P50GM07150, premio Nacional de Ciencias CARRERA Fundación PHY-0844466 y la Fundación Alfred P. Sloan.

<ol><li> Se cultivan las células de E. coli en caldo Luria-beltrani (LB) para la fase exponencial (OD = 0.2-0.4). </li><li> Mantener el cultivo en LB suplementado con 50 mg / ml de cefalexina durante 15 minutos para inducir el crecimiento de filamentosas, y luego se concentran la cultura por 5 veces por centrifugación. </li><li> Hacer PEI cubreobjetos recubiertos por las corrientes de 1% polietilenimina diluida en agua en una cámara de flujo, y lavar con agua después de una incubación de 5 minutos. </li><li> El flujo del cultivo de células concentradas en la cámara, y se lava con una mezcla de LB y cefalexina (50μg/mL) después de 3 minutos para eliminar las células sueltas. </li><li> Incubar la cámara a 37 ° C durante 30 minutos a 1 hora para permitir que las células adjunto crecer antes de colocarlo en el instrumento de captura óptica. </li><li> Hacer polilisina revestida de piedras mediante la incubación de 0,5 m de diámetro, bolas de poliestireno (Laboratorios explosiones) en el 0,1% de polilisina diluido en agua durante 30 minutos. Luego lave las cuentas 3 veces y se resuspenden en agua. </li><li> Diluir la solución de cuentas por un factor de dos en LB con cefalexina (50μg/mL), y agregarlo a la cámara de flujo. </li><li> Ópticamente una trampa flotante de cuentas y el tacto a la extremidad libre de una célula. (Nosotros usamos un Mad City Laboratorios etapa piezoeléctricos para el control del movimiento de la muestra.) Cuando una combinación adecuada de cuentas / célula se encuentra, lavar la cámara con cefalexina en LB (50μg/mL) para eliminar las perlas sueltas. </li><li> Ejecutar custom-written programa LabView para aplicar las fuerzas de flexión a la celda y registrar los datos de fuerza-desplazamiento. Detalles del programa <ol class="lalpha"><li> Calibrar la respuesta del detector de barrido de exploración que se adjunta en el cordón de rayo láser de detección y registro de las señales de tensión en 3D PSD. </li><li> Identificar el eje de células largas a la imagen de microscopio. </li><li> Mover celdas en los pasos en una dirección perpendicular al eje de la célula de largo. </li><li> Registrar la distancia recorrida y el desplazamiento de la trampa óptica. </li><li> Convertir el desplazamiento a la fuerza aplicada con la rigidez trampa medido previamente y guardar desplazamiento de su punta y la fuerza de archivo. </li></ol></li></ol> Secretos para el éxito: En el paso 8), se necesita encontrar una celda con un fin bien definido atascado. Algunas células son atrapados en un extremo, y la fuerza de flexión en la otra punta lleva a un giro de células enteras en lugar de doblar. Un par adecuado se encuentra al doblar cada célula rápidamente a mano con el movimiento etapa joystick controlado. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Esta figura muestra de fuerza-desplazamiento de datos para una sola celda. La pendiente de esta línea es la rigidez a la flexión de la célula.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

El protocolo que aquí se presenta está diseñado para medir cuantitativamente las propiedades de flexión de las células bacterianas. El montaje del experimento se puede aplicar a cualquier celda en forma de bastón que se puede hacer para crecer filamentously. Hemos utilizado con éxito este programa de instalación para investigar los efectos de los filamentos del citoesqueleto en la resistencia a la flexión de la E. células de E. coli. Esta misma técnica se puede utilizar para evaluar el papel de la presión, la rigidez de la pared celular y otros componentes intracelulares en la determinación de la rigidez general de la flexión de las células.

<table><tbody><tr><td>cefalexina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>polietilenimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>polilisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>esferas de poliestireno de 0,5-&amp;mu;m de diámetro</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de nanoposicionamiento serie Nano-LP</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

la medición de la resistencia a la flexión de las células bacterianas usando una trampa óptica

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Hemos desarrollado un protocolo para medir la rigidez a la flexión de filamentos en forma de bacilos. Las fuerzas se aplican con una trampa óptica, un microscopio tridimensional primavera hecha de luz que se forma cuando un haz de alta intensidad de láser se enfoca a un lugar muy pequeño por la lente de objetivo de un microscopio. Para doblar una célula, lo primero que se unen las bacterias vivas a un cubreobjetos tratados químicamente. A medida que estas células crecen, la mitad de las células permanece fijo en la cubreobjetos pero los extremos cada vez están libres de esta restricción. Al inducir el crecimiento de filamentosas con la cefalexina de drogas, que son capaces de identificar las células en el que estaba atrapado uno de los extremos de la célula a la superficie, mientras que el otro extremo quedó suelto y susceptible a las fuerzas de flexión. A fuerza de flexión se aplica con una trampa óptica por un cordón de unión polilisina recubiertos en la punta de una célula que crece. Tanto la fuerza y ​​el desplazamiento de la cuenta se registran y la rigidez a la flexión de la célula es la pendiente de esta relación.

Se presenta un protocolo para doblar las células filamentosas bacterianas unidas a una superficie cubierta antideslizante con una trampa óptica para medir la resistencia a la flexión celular.

La medición de la resistencia a la flexión de las células bacterianas usando una trampa óptica

Desarrollamos un protocolo para medir la rigidez a la flexión de bacterias filamentosas en forma de bastón. Las fuerzas se aplican mediante una trampa óptica, un microscopio...

Con el fin de determinar la rigidez a la flexión de células individuales de coli, primero cultive las bacterias hasta la fase exponencial y luego adhiéralas a una superficie de cubreobjetos tratada químicamente. Deje que las células ya adheridas a la superficie sigan creciendo para que desarrollen extremos flexibles. A continuación, introduzca microesferas dieléctricas, atrape una microesfera y dóblela hacia la punta flexible de una célula.El paso final del procedimiento consiste en doblar la célula con la trampa óptica y medir los datos resultantes de desplazamiento forzado. La rigidez a la flexión de la célula puede calcularse mediante un ajuste lineal a los datos de desplazamiento forzado. Hola, soy Steven Wong del laboratorio del profesor Joshua Shaevitz en el Instituto Louis Sickler de Genómica Integrativa y el Departamento de Física de la Universidad de Princeton.Hoy les mostraremos un procedimiento para doblar células eco individuales y medir la rigidez de las células apareadas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las contribuciones de diferentes estructuras intracelulares a la integridad mecánica de las células bacterianas. Así que comencemos.Para comenzar este procedimiento, cultive tres mililitros de cualquier cepa de células de E. coli en medio LB hasta la fase exponencial. Una vez que las células alcancen una densidad óptica a 600 nanómetros entre 0,2 y 0,4, suplemente el cultivo con 50 microgramos por mililitro de cefalexina durante 15 minutos para inducir el crecimiento filamentoso. Durante estos 15 minutos, prepare una cámara de flujo.Coloque dos trozos de cinta adhesiva doble cara con un espacio de tres milímetros entre ellos sobre un portaobjetos de vidrio y fije un cubreobjetos encima. El espacio entre los trozos de cinta crea un canal para el flujo de líquido. Recubra el cubreobjetos con PEI haciendo fluir 10 microlitros de polietileno al 1% diluido en agua dentro de la cámara de flujo mediante una micropipeta e incube durante cinco minutos.Luego, lave haciendo pasar 200 microlitros de agua por un extremo de la cámara y recogiéndola por el otro extremo con vacío. Después de 15 minutos de crecimiento de las bacterias en presencia de cefalexina, centrifugue un mililitro de células en una microcentrífuga y resuspenda en 200 microlitros de LV con cefalexina. A continuación, use nuevamente una micropipeta en un extremo y vacío en el otro extremo para hacer pasar 50 microlitros del cultivo celular concentrado a la cámara que contiene la cubreobjetos recubierta e incube durante tres minutos.Luego, lave con 50 microlitros de Vel B suplementado con cefalexina. Para eliminar las células no adheridas, incube la cámara a 37 grados Celsius durante 30 minutos hasta una hora para permitir que las células adheridas crezcan antes de colocarlas en el instrumento de trampa óptica mientras las células están en incubación. Prepare perlas recubiertas con polilisina incubando tres microlitros de perlas de poliestireno de 0,5 micrómetros de diámetro en una solución de polilisina al 0,1 % diluida en agua durante 30 minutos.Una vez finalizada la incubación de las perlas, lávelas tres veces centrifugándolas en una microcentrífuga y resuspendiéndolas en un mililitro de agua; a continuación, proceda a unir las perlas a las bacterias y mida la rigidez de unión de las células. El aspecto más difícil de este protocolo consiste en poder recuperar, localizar y reconocer una célula adecuada para las mediciones de flexión y rigidez. Y una célula adecuada es aquella que tiene un extremo fijo bien definido y un extremo libre.En la cámara de flujo del microscopio, busque una célula con un extremo bien definido y fijo. Algunas células están adheridas solo en un extremo, y la fuerza de flexión en el otro extremo provoca que toda la célula gire en lugar de doblarse. Para encontrar una célula adecuada, doble rápidamente cada célula con la trampa utilizando el movimiento del escenario controlado por joystick.Cuando se encuentre una célula adecuada, diluya la solución de microesferas en un factor de dos en LB con cefalexina, agregue 30 microlitros de la solución de microesferas a la cámara de flujo pipeteando por un extremo y haciendo que fluya suavemente por el otro extremo con un tejido Kimwipe; atrape ópticamente una microesfera flotante y colóquela en contacto con el extremo libre de una célula. Lave nuevamente la cámara mediante micropipeta y utilizando un tejido Kimwipe blanco con 50 microlitros de cefalexina en LB para eliminar las microesferas no adheridas. A continuación, ejecute un programa personalizado escrito en LabVIEW para aplicar fuerzas de flexión sobre la célula y registrar los datos de desplazamiento inducido por la fuerza.Primero, calibre la respuesta del detector mediante un barrido RA de la perla adjunta dentro del haz láser de detección y registre las señales de voltaje del PSD en 3D. Luego, identifique el eje largo de la célula en una imagen de microscopio. Después de identificar el eje longitudinal de la célula, mueva la célula en pasos en una dirección perpendicular al eje largo mientras desplaza la célula, registre la distancia recorrida y el desplazamiento de la perla desde el centro del trampa óptica.Finalmente, convierta los valores de desplazamiento en fuerza aplicada utilizando la rigidez de la trampa medida previamente y guarde. El desplazamiento de la punta y la fuerza registrados en el archivo corresponden a datos de desplazamiento forzado para una sola célula. La pendiente de esta línea es la rigidez a flexión de la célula.Acabamos de mostrarle cómo combinar la rigidez a la flexión de E. coli con una trampa óptica. Al utilizar este procedimiento, es importante recordar encontrar una buena célula con un extremo bien definido fijo y un extremo libre. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un método para seleccionar de forma individual, manipular, y los agentes patógenos de imágenes en vivo con una trampa óptica acoplada a un microscopio de disco giratorio. La trampa óptica proporciona un control espacial y temporal de los organismos y los coloca junto a las células huésped. Microscopía de fluorescencia captura dinámica de interacciones intercelulares con perturbación mínima para las células.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Se presenta un protocolo para lanzar y atrapar de manera estable micropartículas dieléctricas seleccionadas en el aire.

Cargando óptica Trampa de micropartículas en dieléctrica del aire

Muchas proteínas en la célula de sensación e inducen curvatura de la membrana. Se describe un método para nanotubos de membrana de las vesículas de lípidos para el estudio de la interacción de proteínas o cualquier molécula activa de curvatura con membranas curvo in vitro.

Tirando de nanotubos de membrana de las vesículas unilaminar gigante

Presentamos una instalación de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación y su aplicación a la punta de prueba mecánica de la célula sin cuentas en el embrión de Drosophila .

Sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de Drosophila

Este protocolo presenta un flujo de trabajo experimental completo para estudiar las interacciones ARN-proteína utilizando pinzas ópticas. Se describen varias configuraciones experimentales posibles, incluida la combinación de pinzas ópticas con microscopía confocal.

Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción

Aquí, presentamos un protocolo para investigar las propiedades mecánicas intracelulares de células embrionarias aisladas de pez cebra en confinamiento tridimensional con medición directa de la fuerza mediante una trampa óptica.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

Aquí, se describe un protocolo integrado basado en pinzas ópticas y microscopía desenfocada para medir las propiedades reológicas de las células. Este protocolo tiene una amplia aplicabilidad en el estudio de las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos en condiciones fisiopatológicas variables.

Análisis cuantitativo de las propiedades viscoelásticas de los glóbulos rojos mediante pinzas ópticas y microscopía desenfocada

Se presenta y discute la formación de haces de actomiosina in vitro y la medición de la generación de fuerza del conjunto de miosina utilizando pinzas ópticas.

Sondeo de la mecánica del conjunto de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Aprende a medir la rigidez a la flexión de células bacterianas usando una trampa óptica con E. coli. Este protocolo permite estudiar las propiedades mecánicas celulares y la integridad estructural.

La medición de la resistencia a la flexión de las células bacterianas usando una trampa óptica

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