La medición de la resistencia a la flexión de las células bacterianas usando una trampa óptica

Con el fin de determinar la rigidez a la flexión de células individuales de coli, primero cultive las bacterias hasta la fase exponencial y luego adhiéralas a una superficie de cubreobjetos tratada químicamente. Deje que las células ya adheridas a la superficie sigan creciendo para que desarrollen extremos flexibles. A continuación, introduzca microesferas dieléctricas, atrape una microesfera y dóblela hacia la punta flexible de una célula.

El paso final del procedimiento consiste en doblar la célula con la trampa óptica y medir los datos resultantes de desplazamiento forzado. La rigidez a la flexión de la célula puede calcularse mediante un ajuste lineal a los datos de desplazamiento forzado. Hola, soy Steven Wong del laboratorio del profesor Joshua Shaevitz en el Instituto Louis Sickler de Genómica Integrativa y el Departamento de Física de la Universidad de Princeton.

Hoy les mostraremos un procedimiento para doblar células eco individuales y medir la rigidez de las células apareadas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las contribuciones de diferentes estructuras intracelulares a la integridad mecánica de las células bacterianas. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, cultive tres mililitros de cualquier cepa de células de E. coli en medio LB hasta la fase exponencial. Una vez que las células alcancen una densidad óptica a 600 nanómetros entre 0,2 y 0,4, suplemente el cultivo con 50 microgramos por mililitro de cefalexina durante 15 minutos para inducir el crecimiento filamentoso. Durante estos 15 minutos, prepare una cámara de flujo.

Coloque dos trozos de cinta adhesiva doble cara con un espacio de tres milímetros entre ellos sobre un portaobjetos de vidrio y fije un cubreobjetos encima. El espacio entre los trozos de cinta crea un canal para el flujo de líquido. Recubra el cubreobjetos con PEI haciendo fluir 10 microlitros de polietileno al 1% diluido en agua dentro de la cámara de flujo mediante una micropipeta e incube durante cinco minutos.

Luego, lave haciendo pasar 200 microlitros de agua por un extremo de la cámara y recogiéndola por el otro extremo con vacío. Después de 15 minutos de crecimiento de las bacterias en presencia de cefalexina, centrifugue un mililitro de células en una microcentrífuga y resuspenda en 200 microlitros de LV con cefalexina. A continuación, use nuevamente una micropipeta en un extremo y vacío en el otro extremo para hacer pasar 50 microlitros del cultivo celular concentrado a la cámara que contiene la cubreobjetos recubierta e incube durante tres minutos.

Luego, lave con 50 microlitros de Vel B suplementado con cefalexina. Para eliminar las células no adheridas, incube la cámara a 37 grados Celsius durante 30 minutos hasta una hora para permitir que las células adheridas crezcan antes de colocarlas en el instrumento de trampa óptica mientras las células están en incubación. Prepare perlas recubiertas con polilisina incubando tres microlitros de perlas de poliestireno de 0,5 micrómetros de diámetro en una solución de polilisina al 0,1 % diluida en agua durante 30 minutos.

Una vez finalizada la incubación de las perlas, lávelas tres veces centrifugándolas en una microcentrífuga y resuspendiéndolas en un mililitro de agua; a continuación, proceda a unir las perlas a las bacterias y mida la rigidez de unión de las células. El aspecto más difícil de este protocolo consiste en poder recuperar, localizar y reconocer una célula adecuada para las mediciones de flexión y rigidez. Y una célula adecuada es aquella que tiene un extremo fijo bien definido y un extremo libre.

En la cámara de flujo del microscopio, busque una célula con un extremo bien definido y fijo. Algunas células están adheridas solo en un extremo, y la fuerza de flexión en el otro extremo provoca que toda la célula gire en lugar de doblarse. Para encontrar una célula adecuada, doble rápidamente cada célula con la trampa utilizando el movimiento del escenario controlado por joystick.

Cuando se encuentre una célula adecuada, diluya la solución de microesferas en un factor de dos en LB con cefalexina, agregue 30 microlitros de la solución de microesferas a la cámara de flujo pipeteando por un extremo y haciendo que fluya suavemente por el otro extremo con un tejido Kimwipe; atrape ópticamente una microesfera flotante y colóquela en contacto con el extremo libre de una célula. Lave nuevamente la cámara mediante micropipeta y utilizando un tejido Kimwipe blanco con 50 microlitros de cefalexina en LB para eliminar las microesferas no adheridas. A continuación, ejecute un programa personalizado escrito en LabVIEW para aplicar fuerzas de flexión sobre la célula y registrar los datos de desplazamiento inducido por la fuerza.

Primero, calibre la respuesta del detector mediante un barrido RA de la perla adjunta dentro del haz láser de detección y registre las señales de voltaje del PSD en 3D. Luego, identifique el eje largo de la célula en una imagen de microscopio. Después de identificar el eje longitudinal de la célula, mueva la célula en pasos en una dirección perpendicular al eje largo mientras desplaza la célula, registre la distancia recorrida y el desplazamiento de la perla desde el centro del trampa óptica.

Finalmente, convierta los valores de desplazamiento en fuerza aplicada utilizando la rigidez de la trampa medida previamente y guarde. El desplazamiento de la punta y la fuerza registrados en el archivo corresponden a datos de desplazamiento forzado para una sola célula. La pendiente de esta línea es la rigidez a flexión de la célula.

Acabamos de mostrarle cómo combinar la rigidez a la flexión de E. coli con una trampa óptica. Al utilizar este procedimiento, es importante recordar encontrar una buena célula con un extremo bien definido fijo y un extremo libre. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.