Procesamiento de patas de insectos para microscopía de fluorescencia: un método para preservar estructuras neuromusculares para la obtención de imágenes

- Para empezar, sumerja los insectos anestesiados en una solución de etanol al 70% para reducir la hidrofobicidad de la cutícula. A continuación, lavar y permeabilizar el tejido con solución salina tamponada con fosfato que contenga un detergente durante al menos 30 minutos para permitir la penetración del tejido durante la fijación.

A continuación, retira la cabeza y el abdomen del tórax. Use fórceps para aplicar una presión suave en la unión coxa-tórax y separe la pierna. Coloque con cuidado las patas en una solución helada de paraformaldehído al 4% durante la noche para permitir que penetre en el tejido. El paraformaldehído fija los tejidos mediante la reticulación de proteínas.

A continuación, retire la solución de fijación y lave el pañuelo varias veces con solución salina tamponada con fosfato que contenga detergente. Antes de montar, coloque las patas en un tampón de montaje puro o ligeramente diluido durante al menos un día para proporcionar tiempo suficiente para que el tampón ingrese al tejido.

Por último, monte las patas en una gota de medio de montaje. Utilice un espaciador entre el portaobjetos del microscopio y el cubreobjetos para evitar que la muestra se dañe, y asegure la montura con esmalte de uñas.

En el siguiente ejemplo, veremos la disección, fijación y montaje de las patas de Drosophila melanogaster.

- Comience llenando el número apropiado de pocillos en una placa de vidrio de múltiples pocillos con etanol al 70%. Use un cepillo para agregar de 15 a 20 moscas anestesiadas con dióxido de carbono de cualquier edad o sexo a cada pocillo, y frote suavemente las moscas en el etanol hasta que estén completamente sumergidas.

Después de no más de un minuto, enjuague las moscas tres veces con una solución de detergente tensioactivo no iónico al 0,3% en solución salina tamponada con fosfato durante al menos 10 minutos por lavado. Después del último lavado, use pinzas para quitar la cabeza y el abdomen de cada mosca sin dañar el segmento torácico o las patas, y use la punta de un par de pinzas finas para aplicar presión suave pero firmemente en la unión coxa-tórax para separar una pierna del segmento torácico.

Coloque las patas en un pocillo de una nueva placa multipocillo, que contenga un 4% de paraformaldehído recién preparado en hielo, para una incubación nocturna a 4 grados centígrados.

- Es importante empujar las patas suavemente dentro del tope de fijación sin dejarlas flotar para obtener patas bien fijadas.

- Al día siguiente, lave las piernas cinco veces con una solución fresca de detergente tensioactivo no iónico al 0,3 % durante 20 minutos por lavado. Después del último lavado, reemplace el detergente con el medio de montaje y mantenga las patas en el medio de montaje durante al menos 24 horas.

Al día siguiente, agregue aproximadamente 20 microlitros de glicerol al 70% junto al extremo recubierto del portaobjetos de vidrio del microscopio y cubra el glicerol con un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros. A continuación, agregue una línea de aproximadamente 10 microlitros de medio de montaje a la derecha del cubreobjetos y aplique una segunda línea de 30 microlitros de medio de montaje a la derecha de la línea de 10 microlitros.

Con pinzas finas, transfiera una pierna de la placa de pocillos múltiples en una gota de medio a la tira de 10 microlitros de medio de montaje en una orientación externa hacia arriba o hacia abajo. Repita hasta que se hayan montado y alineado de seis a ocho patas, y coloque un segundo cubreobjetos sobre las patas de modo que el segundo cubreobjetos descanse ligeramente sobre el primer cubreobjetos. Luego, usa esmalte de uñas en cada esquina de los cubreobjetos para asegurarlos en su lugar.